劉文，黃萌，王德香，郭春暉，林秀蔚，陳國(guó)旺，沈思思，楊坤，邵廣，張建勝，南景東，李紅宇

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005）

在我國(guó)的牛場(chǎng)，犢牛腹瀉是犢牛死淘的第一大原因。腹瀉不僅可以在短期內(nèi)造成犢牛直接死淘，而且發(fā)生腹瀉的犢牛最終生產(chǎn)性能也會(huì)顯著下降。由于犢牛腹瀉在感染初期不易被發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致?tīng)倥Ｒ蚋篂a營(yíng)養(yǎng)缺乏生長(zhǎng)受阻，免疫力降低進(jìn)而并發(fā)多種疾病。疾病一旦發(fā)生就不可避免產(chǎn)生損失，因而畜牧產(chǎn)業(yè)對(duì)于疾病的態(tài)度始終是防大于治。預(yù)防細(xì)菌性犢牛腹瀉可以避免由此帶來(lái)的直接損失和間接損失，以及短期和長(zhǎng)期的損失。噬菌蛭弧菌特異性攻擊大腸桿菌和沙門氏菌等病原菌，這一特性與抗生素抑制病原菌的作用相同。相比于抗生素，噬菌蛭弧菌不攻擊乳酸菌、放線菌等益生菌，不破壞消化道內(nèi)有益菌群并且在病原菌消失后排出體外有助于消化道內(nèi)建立健康的菌群平衡；噬菌蛭弧菌的噬菌方式類似于噬菌體，不產(chǎn)生化學(xué)抑菌物質(zhì)，因而不會(huì)產(chǎn)生耐藥菌。噬菌蛭弧菌依存于病原菌，以病原菌為繁殖材料，在沒(méi)有病原菌的情況下不會(huì)大量繁殖，因而服用噬菌蛭弧菌的犢牛排出的糞便不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。使用噬菌蛭弧菌預(yù)防細(xì)菌性犢牛腹瀉可以減少抗生素的使用，對(duì)于我國(guó)對(duì)畜牧養(yǎng)殖減少抗生素使用保護(hù)環(huán)境的要求具有實(shí)施指導(dǎo)意義和示范作用。目前，噬菌蛭弧菌在水產(chǎn)動(dòng)物上研究較多，在反芻動(dòng)物上應(yīng)用的研究較少。因此，本試驗(yàn)通過(guò)在犢牛奶中添加噬菌蛭弧菌，并對(duì)其生長(zhǎng)性能及糞便微生物區(qū)系進(jìn)行研究，探究噬菌蛭弧菌在犢牛健康及生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起到的作用，為犢牛的無(wú)抗養(yǎng)殖提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在黑龍江省綏化某牧業(yè)有限公司進(jìn)行，噬菌蛭弧菌試劑由河北某動(dòng)物藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)分組設(shè)計(jì)，試驗(yàn)選取健康的荷斯坦公犢牛16 頭，初生體重為38.74±1.06 千克，隨機(jī)分為2 組，每組8 個(gè)重復(fù)。對(duì)照組的初乳中不添加噬菌蛭弧菌，試驗(yàn)組初乳中添加10 毫升/頭噬菌蛭弧菌。

將手指沾上初乳伸入犢牛口中感覺(jué)犢牛吸吮力的大小。如吸吮力大用奶瓶灌服法反之用胃管灌服法，整個(gè)操作期間要清潔衛(wèi)生。

從第2 天開(kāi)始每天飼喂兩次鮮奶，喂量：2～7 日齡（3～6 升/頭）；8～14 日齡（6～7 升/頭）喂奶做到定時(shí)、定量、定溫，從第3 天開(kāi)始自由采食和飲水?；A(chǔ)日糧構(gòu)成見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)日糧及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.3 測(cè)定指標(biāo)

1.3.1 飼糧營(yíng)養(yǎng)成分含量

體重及體尺指標(biāo)：分別在犢牛出生后7 日齡和14 日齡早飼前稱重，計(jì)算平均日增重（ADG）；同時(shí)，測(cè)量犢牛的體高、體直長(zhǎng)、體高、胸圍、胸深、腿圍和管圍，記錄測(cè)定的數(shù)據(jù)，并計(jì)算體尺指數(shù)：

1.3.2 糞便樣品采集及糞便微生物多樣性檢測(cè)

糞便樣本于試驗(yàn)期的第1 天和14 天的晨飼前采集，每個(gè)處理組內(nèi)選取3 頭體型相近的犢牛，刮取其直腸末端進(jìn)行取樣，將糞樣裝于無(wú)菌凍存管內(nèi)并于-80 ℃冰箱內(nèi)保存，便于后續(xù)的微生物死亡測(cè)定與分析。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2019 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與整理，使用SPSS 29.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 噬菌蛭弧菌對(duì)荷斯坦公犢牛生長(zhǎng)性能的影響

由表2 可知，試驗(yàn)處于0～7 日齡、8～14 日齡及0～14 日齡時(shí)，兩組間犢牛的平均日增重差異均不顯著（P＞0.05）。

表2 噬菌蛭弧菌對(duì)荷斯坦公犢生長(zhǎng)性能的影響

2.2 噬菌蛭弧菌對(duì)荷斯坦公犢牛體尺指數(shù)的影響

由表3 可知，兩組犢牛的體尺指數(shù)間差異均不顯著（P＞0.05）。

表3 噬菌蛭弧菌對(duì)荷斯坦公犢牛體尺指數(shù)的影響

2.3 噬菌蛭弧菌對(duì)荷斯坦公犢牛糞便微生物區(qū)系的影響

2.3.1 噬菌蛭弧菌對(duì)荷斯坦公犢牛糞便菌群α 多樣性的影響

由 表4 可 知，兩 組 間 的Chao1、Simpson、Shannon、ACE 和覆蓋率指數(shù)差異均不顯著（P＞0.05）。

表4 噬菌蛭弧菌對(duì)荷斯坦公犢牛糞便菌群α 多樣性的影響

相對(duì)豐度低于0.5%的物種樣品全部合并成其他。圖2 同。

2.3.2 噬菌蛭弧菌對(duì)荷斯坦公犢牛糞便微生物菌群的組成及相對(duì)豐度的影響

由圖1 和表5可知，對(duì)兩組微生物進(jìn)行差異性分析，在門水平上未發(fā)現(xiàn)顯著差異（P＞0.05）。

圖1 犢牛糞便菌群門水平上的組成

由圖2 和表6可知，各組均有9種優(yōu)勢(shì)菌屬 （相對(duì)豐度＞1 %），除其他（Others）菌 屬 外，兩 組犢牛糞便菌群在屬水平上均以瘤胃球菌屬_UCG -005 （Ruminococcaceae_UCG-005）瘤 胃球菌科_UCG-010（Ruminococcaceae_UCG -010）、腸球菌屬（Enterococcus）、擬桿菌屬（Bacteroi 天es）、理 研 菌 科_RC9_ 腸 道 群（Rikenellaceae_RC9_gut_group）等為主。其他豐度較高的菌屬有固氮螺菌屬（Azospirillum）、鞘氨醇單胞菌（Sphingobacterium）、芽 殖 菌（Gilliamella）、大腸桿菌_ 志賀氏菌（Escherichia_Shigella）和梭狀芽孢桿菌屬（Clostri 天iales）。與對(duì)照組相比試驗(yàn)組的菌科相對(duì)豐度中瘤胃球菌科_UCG-010顯著增加（P＜0.05），大腸桿菌_ 志賀氏菌顯著降低（P＜0.05）。

表6 噬菌蛭弧菌對(duì)荷斯坦公犢牛糞便菌群屬水平相對(duì)豐度的影響%

圖2 犢牛糞便菌群屬水平上的組成

3 討論

3.1 噬菌蛭弧菌對(duì)荷斯坦公犢牛生長(zhǎng)性能和腹瀉率的影響

犢牛是奶牛生命的起點(diǎn)，也是奶牛生長(zhǎng)過(guò)程的重要階段，此階段的生長(zhǎng)速度很大程度上會(huì)影響其之后的生產(chǎn)性能。目前，對(duì)犢牛生長(zhǎng)發(fā)育的研究主要通過(guò)平均日增重和體尺指標(biāo)進(jìn)行研究，定期稱重能夠準(zhǔn)確掌握犢牛的生長(zhǎng)發(fā)育情況，以便檢查飼養(yǎng)效果。Atterbury 等研究發(fā)現(xiàn)對(duì)雞雛飼料中添加噬菌蛭弧菌改變了其腸道微生物群的總體多樣性，但對(duì)它們的生長(zhǎng)和健康沒(méi)有不利影響。

體尺也是衡量犢牛生長(zhǎng)發(fā)育的重要指標(biāo)，在實(shí)際生產(chǎn)中也常用來(lái)對(duì)其成年后的體重進(jìn)行預(yù)測(cè)。DlVDS 等研究表明也證實(shí)了以上觀點(diǎn)。本試驗(yàn)兩組間犢牛的體尺指標(biāo)均沒(méi)有顯著影響 （P＞0.05），這可能與飼喂時(shí)間和噬菌蛭弧菌的添加量等因素有關(guān)。

3.2 噬菌蛭弧菌對(duì)荷斯坦公犢牛糞便微生物區(qū)系的影響

本試驗(yàn)中，兩組測(cè)序數(shù)據(jù)覆蓋度均達(dá)99%以上，說(shuō)明測(cè)序樣品取樣充分，覆蓋程度好。其中α多樣性分析可反映糞便微生物群落的豐富度和多樣性。Ace 指數(shù)和Chao 指數(shù)用于估算群落中OTU 的數(shù)目，其指數(shù)越大，群落豐富度越高；Shannon 指數(shù)是用于描述樣本中的紊亂性和不確定性，指數(shù)越大，群落多樣性越高，Simpson 指數(shù)是反映優(yōu)勢(shì)物種在種群中的地位和作用，Simpson 指數(shù)越小，群落多樣性越高。本試驗(yàn)中，飼喂噬菌蛭弧菌對(duì)犢牛腸道微生物多樣性無(wú)顯著影響，這可能是由于選取的樣本量較少造成的。

在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在門水平上，犢牛的糞便微生物優(yōu)勢(shì)菌門分別是Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria。這與前人在對(duì)犢牛糞便微生物上的報(bào)道結(jié)果一致。此外在對(duì)鼠、羊、肉牛等研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)irmicutes 和Bacteroidetes 也是胃腸道主要的優(yōu)勢(shì)菌群。Firmicutes 和Bacteroidetes 分別對(duì)纖維類物質(zhì)和非纖維物類物質(zhì)進(jìn)行降解作用，幫助機(jī)體對(duì)一些自身無(wú)法利用的物質(zhì)進(jìn)行消化。Proteobacteria 也是胃腸道的優(yōu)勢(shì)菌門，對(duì)維持腸道微生物群落平衡和胃腸道疾病的臨床診斷具有重要作用。本試驗(yàn)中，添加噬菌蛭弧菌組對(duì)犢牛糞便的優(yōu)勢(shì)菌門種類沒(méi)有影響，但其有Bacteroidetes 豐度增加以及Proteobacteria 豐度減少的趨勢(shì)。

在屬水平上，Ruminococcaceae_UCG -005、Ruminococcaceae_UCG -010、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Enterococcus、Bacteroides 等是主要優(yōu)勢(shì)菌屬。有研究表明Ruminococcaceae_UCG-005和Bacteroides 與纖維分解有關(guān)，可以提高飼料的利用率。SINGH 等 研 究 發(fā) 現(xiàn)Ruminococcaceae_UCG-010可以促進(jìn)T 細(xì)胞的分化，對(duì)炎癥反應(yīng)具有抑制作用。Rikenellaceae 對(duì)維護(hù)動(dòng)物腸道健康有著重要影響，LI 等研究發(fā)現(xiàn)隨著糞便中Rikenel laceae_RC9_gut_group 的相對(duì)豐度降低，麝鹿腹瀉率顯著增加。Escherichia_Shigella 是動(dòng)物腸道感染的主要病菌之一，犢牛感染志賀氏菌可引起急性中毒，死亡率很高。在本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比試驗(yàn)組Ruminococcaceae_UCG-010 的相對(duì)豐度顯著增加，Escherichia_Shigella 的相對(duì)豐度顯著降低，表明添加噬菌蛭弧菌可以對(duì)犢牛腹瀉有一定預(yù)防作用。

4 結(jié)論

添加噬菌蛭弧菌對(duì)犢牛的生長(zhǎng)性能無(wú)顯著影響。

添加噬菌蛭弧菌可提高糞便中Ruminococcaceae_UCG-010 的相對(duì)豐度，降低Escherichia_Shigella 的相對(duì)豐度，對(duì)犢牛腹瀉有一定預(yù)防作用。