何璇 黃宇昕 吳茂霞 焦晚琪 趙振東 何文英

（1. 海南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院 海南?？?571158；2. 海南師范大學(xué)/熱帶藥用資源化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南?？?571158；3. 海南大學(xué)/分析測(cè)試中心 海南?？?570228）

長(zhǎng)花龍血樹（Dracaena angustifoliaRoxb.）屬百合科（Liliaceae）龍血樹屬（DracaenaVand.exL）植物，該屬植物某些物種莖部位的樹脂成分是傳統(tǒng)藥物“血竭”的重要來(lái)源，而血竭是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，在我國(guó)境內(nèi)發(fā)現(xiàn)的、有野生分布的血竭基源植物只有海南龍血樹和劍葉龍血樹2種，其性平、味甘、溫、咸，具有良好的活血散淤、定痛止血、生肌斂瘡等功效。海南黎族民間用長(zhǎng)花龍血樹根煮水喝，用作涼茶；葉煮水喝，治療胃痛、腹痛[1-2]?，F(xiàn)代研究表明，龍血樹植物莖含有黃酮類、酚類、三萜及其皂苷等化學(xué)成分[1]，葉片含有黃酮類、阿魏酸酰胺、松脂醇、甾體等化學(xué)成分[3]，藥理活性表現(xiàn)出抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗血栓、止痛止血等作用[1,4]；最新報(bào)道血竭在抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生、輔助治療并發(fā)癥等神經(jīng)退行性疾病方面的治療潛力[5]。從查閱文獻(xiàn)看，國(guó)內(nèi)外對(duì)長(zhǎng)花龍血樹的研究較少且多集中在其莖中植物化學(xué)成份提取及其生物或藥理活性的研究[1-5]，對(duì)其葉片的研究則更少，尤其是海南龍血樹作為“血竭”的重要來(lái)源，其同生的葉片作為一種亟待開發(fā)研究的植物資源，值得引起廣大學(xué)者的關(guān)注。

本課題組的研究方向之一是海南藥用植物的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，前期研究就發(fā)現(xiàn)，某些植物蛋白也具有一定藥用功能[6]，可從生物大分子的角度結(jié)合其中的小分子化學(xué)成分，補(bǔ)充并從整體闡釋藥用植物的物質(zhì)基礎(chǔ)，有利于更好地實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化?；谝陨隙喾N原因，雖然有較多關(guān)于龍血樹屬植物化學(xué)成份提取及其生物或藥理活性的研究，但還未見有長(zhǎng)花龍血樹葉的蛋白提取及其指紋圖譜的建立或其中關(guān)鍵蛋白發(fā)現(xiàn)分析的報(bào)道。作為一種有良好生物及藥理活性的植物藥，研究其所含植物蛋白名稱、發(fā)現(xiàn)與其藥物活性相關(guān)的關(guān)鍵蛋白，對(duì)進(jìn)一步深入開發(fā)、利用長(zhǎng)花龍血樹葉具有非常重要的實(shí)踐及理論意義?；陔p向電泳的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)結(jié)合生物質(zhì)譜分析具有分辨率高和可重復(fù)性好的特點(diǎn)，是目前分析蛋白質(zhì)的主要工具之一[6]。本研究選擇海南地道產(chǎn)長(zhǎng)花龍血樹葉作為研究對(duì)象，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，首次獲得其蛋白指紋圖譜及高表達(dá)的蛋白，并對(duì)質(zhì)譜鑒定的蛋白功能進(jìn)行了初步分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 長(zhǎng)花龍血樹葉樣品 樣品采集于海南省定安縣白石嶺公園（經(jīng)度：110.323959，緯度：19.699211），經(jīng)海南師范大學(xué)生命科學(xué)院的陳玉凱副教授鑒定確為長(zhǎng)花龍血樹葉。

1.1.2 儀器及試劑 儀器及試劑：臺(tái)式恒溫振蕩器（精宏）；QL-866渦旋混合器；SIGMA3-18K低溫超速離心機(jī)（德國(guó)SIGMA）；超純水系統(tǒng)（上海和泰）；EYELA搖床（東京理化）；蛋白質(zhì)等電聚焦儀(Ettan IPGphor3)，固相 pH 梯膠條（pH=3-10）；Image scanner III掃描儀（美國(guó)通用公司GE Healthcare）；ImageMaster5.0凝膠圖像分析軟件；MultiTemp IV 恒溫循環(huán)器；UV-2700 紫外分光光度計(jì)（日本島津）；KQ2200E型超聲波清洗儀（曙峰企業(yè)）；GM-0.33A型隔膜真空泵（津騰）；Voyager-DE PRO ABI4700時(shí)間飛行質(zhì)譜儀（美國(guó)ABI公司）。

所有試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。所有?shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理及蛋白提取 （1）樣品預(yù)處理：采集回來(lái)的長(zhǎng)花龍血樹葉用超純水把葉片清洗干凈，每4片長(zhǎng)花龍血樹葉用錫箔紙包裹住放入保鮮袋中，于-80℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）蛋白提?。豪?BPP+酚提取法提取長(zhǎng)花龍血樹葉的蛋白。稱量 3 g樣品于用液氮預(yù)冷的研缽中，加入0.3 g的PVPP和0.3 g二氧化硅粉末研磨；轉(zhuǎn)移到 10 mL離心管中，加入10 mLBPP提取緩沖液充分渦旋震蕩10 min；再加入10 mLTris飽和酚，渦旋10 min；在SIGMA3-18 K低溫超速離心機(jī)中離心15 min（4℃，轉(zhuǎn)速：16 000 g）；移取上層清液轉(zhuǎn)移至干凈離心管中，加入5 mL BPP提取緩沖液，渦旋震蕩10 min后離心15 min；再移取3 mL上清液轉(zhuǎn)移至干凈離心管中，加入15 mL預(yù)冷的AM沉淀劑，置于-20℃冰箱中沉淀12 h以上，從冰箱中取出離心管，離心15 min棄去上清液；重復(fù)2次轉(zhuǎn)移及離心步驟；風(fēng)干樣品（約 3 h）再加入蛋白裂解液，放置于22℃恒溫裂解 2 h以上；離心后轉(zhuǎn)移上清液于10 mL離心管中，放置在-20℃冰箱中保存；采用Bradford法測(cè)定樣品的蛋白濃度[6]，根據(jù)文獻(xiàn)[6]進(jìn)行單向電泳實(shí)驗(yàn)，確定雙向電泳的最佳上樣濃度。

（3）雙向電泳實(shí)驗(yàn)：移取285 μL蛋白溶液、160 μL蛋白裂解液和5 μL IPG Buffer于離心管中，在IPG膠條（pH 4～7）上水化上樣；保持室溫 20℃左右，設(shè)置聚焦極限電流為每根膠條50 μA，電壓分別為 250、500、1 000、1 000～8 000、8 000、1 000 V，時(shí)間分別為3、2、1、3、12 h、任意時(shí)間，進(jìn)行一向等電聚焦；再將膠條放置在搖床上平衡15 min；在制備好的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行二向垂直電泳操作，設(shè)置參數(shù)：5 W/每張膠片進(jìn)行預(yù)電泳1 h，7 W/每張膠片至電泳結(jié)束；再進(jìn)行凝膠染色和脫色、凝膠掃描和用 Image Master軟件分析凝膠圖譜，篩選出其中高表達(dá)的蛋白并進(jìn)行編號(hào)[6]。

1.2.2 蛋白的生物質(zhì)譜鑒定 挖取高表達(dá)蛋白質(zhì)；分別用150 μL超純水、150 μL脫色液、和100 μL乙腈處理，放置在搖床上搖蕩30 min，轉(zhuǎn)速設(shè)置為150 r/min，搖蕩后吸出離心管中的水，以上步驟重復(fù)3次，直至蛋白粒變?yōu)闊o(wú)色，置于室溫下風(fēng)干；將蛋白樣品離心后加入適量胰蛋白酶，放置在4℃冰箱中1 h左右；再將其放置在PCR儀上酶解蛋白（37℃，13 h）；設(shè)置轉(zhuǎn)速7 000 g，離心5 min（20℃），備用；利用MALDI-TOF-MS進(jìn)行蛋白鑒定；再通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，確定蛋白的名稱、種類及其他信息[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)花龍血樹葉蛋白的單向電泳和雙向電泳分析

通過Bradford法來(lái)測(cè)定長(zhǎng)花龍血樹葉的蛋白濃度，在波長(zhǎng)為595 nm處通過測(cè)定系列梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白溶液的吸光度值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（圖略），計(jì)算得出長(zhǎng)花龍血樹葉蛋白溶液的濃度為4.568 mg/mL。

為獲得雙向電泳合適的上樣濃度，進(jìn)行單向電泳實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1。從圖1可看出，長(zhǎng)花龍血樹葉的蛋白分子量15～130 kDa，主要在55 kDa左右。

圖1 長(zhǎng)花龍血樹葉單向電泳凝膠圖

通過雙向電泳實(shí)驗(yàn)可以得到清晰明顯、分離效果很好的蛋白凝膠圖譜，再經(jīng) ImageMaster軟件分析在蛋白凝膠圖譜上標(biāo)記 60個(gè)高表達(dá)的蛋白點(diǎn)（圖2）。

圖2 海南長(zhǎng)花龍血樹葉雙向電泳蛋白凝膠圖譜

2.2 長(zhǎng)花龍血樹葉主要蛋白的質(zhì)譜鑒定

將 60個(gè)高表達(dá)蛋白點(diǎn)經(jīng)過挖點(diǎn)和酶解處理后，利用生物質(zhì)譜技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析和鑒定，再通過植物蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比來(lái)確定這些蛋白的種類、名稱及其它信息，鑒定結(jié)果如表1所示。

表1 蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果

續(xù)表1 蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果

以上通過 Bradford法、雙向電泳實(shí)驗(yàn)和MALDI-TOF-MS質(zhì)譜技術(shù)對(duì)海南產(chǎn)長(zhǎng)花龍血樹葉植物蛋白進(jìn)行提取、分離及鑒定實(shí)驗(yàn)，鑒定出了45個(gè)蛋白，從屬多種蛋白類型，對(duì)相關(guān)的功能進(jìn)行了初步分析。

編號(hào) 1蛋白為蛋氨酸合酶（methionine synthase，MS）或甲硫氨酸合酶，即N5-甲基四氫葉酸（MTHF）-同型半胱氨酸（Hcy）甲基轉(zhuǎn)移酶，它是葉酸代謝的關(guān)鍵酶，其位于葉酸代謝的上游，負(fù)責(zé)將MTHF轉(zhuǎn)化為四氫葉酸（THF），而THF是參與葉酸循環(huán)的重要活性形式，其不足會(huì)導(dǎo)致嘌呤和嘧啶的合成受阻，進(jìn)而抑制DNA的合成，從而抑制細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)[7]；另外一個(gè)功能為：通過幾個(gè)相互作用和介于甲基鈷胺素輔因子及其底物電子轉(zhuǎn)移的S-腺苷甲硫氨酸循環(huán)，蛋氨酸合酶可從半胱氨酸再生出甲硫氨酸[8]。

編號(hào)2、11、13及53蛋白為ATP合酶亞基β（葉綠體），ATP 合酶廣泛分布于線粒體內(nèi)膜，位于線粒體內(nèi)膜、葉綠體類囊體膜和光合菌質(zhì)膜上，參與呼吸鏈氧化磷酸化的最后環(huán)節(jié)，參與氧化磷酸化和光合磷酸化，在跨膜質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)的推動(dòng)下合成ATP。ATP合酶功能與生物體能量代謝密切相關(guān)。亞基β的功能表現(xiàn)在ATP水解時(shí)，β亞基是推動(dòng)γε中心柄旋轉(zhuǎn)的動(dòng)力來(lái)源；β亞基對(duì)ATP合酶空間構(gòu)象有影響；β亞基對(duì)底物ATP具有高選擇性，可有效提高催化效率[9]。

編號(hào)3及7蛋白為細(xì)胞分裂蛋白WhiA，細(xì)胞分裂是所有生物生命活動(dòng)中最為重要的事件之一，真核生物通過依賴細(xì)胞分裂蛋白的蛋白激酶與相應(yīng)的細(xì)胞分裂蛋白形成復(fù)合體而促使細(xì)胞進(jìn)入并完成細(xì)胞分裂過程；同時(shí)，植物可通過轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)這2個(gè)過程，來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂蛋白在細(xì)胞內(nèi)的水平[10]。

編號(hào)5蛋白為2-[(L-丙氨酸-3-基氨基甲酰)甲基]-2-羥基丁二酸脫羧酶，屬于L-丙氨酸脫羧酶。自然界中常見的 20種 L-氨基酸不僅在生命體中組成各種各樣的不同功能的蛋白質(zhì)，還能夠參與體內(nèi)的代謝，為生命體的基本活動(dòng)提供物質(zhì)基礎(chǔ)和能量。其中丙氨酸的代謝方式之一是在丙氨酸脫羧酶的催化下脫羧形成乙胺，而乙胺則參與植物體內(nèi)糖類、多酚類和氨基酸等物質(zhì)的代謝[11]。

編號(hào)8蛋白為轉(zhuǎn)錄抑制因子 NrdR，NrdR是來(lái)自天藍(lán)色鏈霉菌作為I類和II類核苷酸還原酶的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，由于這些酶為核苷酸的還原提供脫氧核苷酸，使其在 DNA合成過程中發(fā)揮重要的作用，而 NrdR作為一種抑制因子，通過在I類和II類操縱子的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合來(lái)阻止基因的轉(zhuǎn)錄[12]。

編號(hào)9、10、12、17、54及56蛋白為核酮糖二磷酸羧化酶，核酮糖二磷酸羧化酶是高等植物葉片中含量極豐富的一種酶，其同時(shí)具有羧化與加氧雙重功能，是光合作用與光呼吸作用的分水嶺。其能夠催化核酮糖-1,5-二磷酸和CO2的羧化反應(yīng)和 O2的氧化反應(yīng)，同時(shí)可以使核酮糖-1,5-二磷酸參與光呼吸途徑，是影響植物光合作用的關(guān)鍵性酶[13-14]。

編號(hào)19蛋白為景天庚酮糖-1,7-二磷酸（葉綠體），葉綠體能通過吸收光能并將其轉(zhuǎn)化為生物能而為自身的生長(zhǎng)發(fā)育提供所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，葉綠素作為植物體中葉綠體的重要組成部分，是植物進(jìn)行光合作用的主要色素和作物生長(zhǎng)診斷的重要參數(shù)[15]。

編號(hào)20及57蛋白為氧化酶活化酶/核酮糖二磷酸羧化酶（RuBisCO activase, RCA），是一種由核基因編碼的可溶性葉綠體蛋白，普遍存在于高等植物、綠藻和藍(lán)細(xì)菌中，其在植物中具有抗逆性作用，如減輕高溫對(duì)RuBisCO的鈍化或活性的恢復(fù)，從而維持植物在高溫下一定的光合速率中發(fā)揮關(guān)鍵作用；對(duì)低溫脅迫表現(xiàn)在可維持光合碳同化速率以完成抵抗脅迫響應(yīng)及鹽和滲透等其它脅迫條件下的響應(yīng)[16]。

編號(hào) 21蛋白為鐵氧還蛋白-NADP還原酶，它是生物體內(nèi)非常重要的酶之一，其同工酶參與了光合電子傳遞、CO2的固定、N的同化、抗氧化脅迫等生化、生理過程。在植物體內(nèi)，過表達(dá)鐵氧還蛋白-NADP還原酶可能有利于C、N的固定，從而可以提高轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)量[17]。

編號(hào)22蛋白為細(xì)胞色素C氧化酶亞基，線粒體是哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)中唯一含有遺傳物質(zhì)的細(xì)胞器，其基本功能是通過氧化磷酸化，以ATP的形式為細(xì)胞提供能量，被稱為細(xì)胞的“動(dòng)力工廠”。線粒體細(xì)胞色素 C氧化酶（mt-COX）是線粒體內(nèi)呼吸鏈復(fù)合物Ⅳ，定位于線粒體內(nèi)膜，哺乳動(dòng)物mt-COX由13個(gè)亞基組成，由亞基組裝成有功能的全酶是一個(gè)復(fù)雜的過程，需要多種分子伴侶和裝配因子的協(xié)助才能完成[18]。

編號(hào)23、24、25、26及52蛋白為產(chǎn)氧增強(qiáng)蛋白，它不僅是涉及釋放氧和光合系統(tǒng)穩(wěn)定性的一種重要蛋白，而且在植物響應(yīng)外界環(huán)境鹽脅迫和高 pH條件下維持光合系統(tǒng)穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用[19]。

編號(hào) 27蛋白為賴氨酸特異性脫甲基酶（LSD），是一種黃素依賴型單胺氧化酶編碼的基因，其可以使單雙甲基化賴氨酸去甲基化，特別是組蛋白3、賴氨酸 4 和賴氨酸9，是第一批被發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)賴氨酸脫甲基酶。功能分析表明LSD 定位于細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控著基因轉(zhuǎn)錄的激活和抑制，被譽(yù)為細(xì)胞深處的基因“開關(guān)”，在胚胎發(fā)育發(fā)生過程中起著重要的作用[20]。

編號(hào)28和60蛋白為氨基酸-tRNA連接酶，核酸連接酶在原核生物及真核生物中普遍存在，其功能是通過在3'OH和5'PO4基團(tuán)之間形成磷酸二酯鍵來(lái)維持核酸骨架分子的正確和穩(wěn)定性。tRNA連接酶是一種多功能酶，可將相應(yīng)的tRNA半分子鏈接成整分子tRNA植物的tRNA連接酶，在未折疊蛋白反應(yīng)中有重要作用，可加固特定轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞質(zhì)拼接等[21]。編號(hào) 28蛋白為異亮氨酸-tRNA連接酶，植物葉綠體的tRNA可被異亮氨酸氨?；?，參與對(duì)胞啶的修飾[22]。編號(hào) 60蛋白為蘇氨酸-tRNA連接酶，其能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)的結(jié)合與沉積，使氨基酸平衡，減少由于生長(zhǎng)抑制而引起色氨酸和蛋氨酸過量的問題，促進(jìn)各類蛋白質(zhì)的生長(zhǎng)和發(fā)育[23]。

編號(hào)29蛋白為甘油醛-3-磷酸脫氫酶，在植物細(xì)胞內(nèi)部是組成性表達(dá)的蛋白，參與細(xì)胞的糖酵解過程[24]；作為一個(gè)多功能蛋白，也參與多種亞細(xì)胞的水平活動(dòng)，在催化微管聚合、參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)及膜融合、促進(jìn)細(xì)胞程序性死亡和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)等方面發(fā)揮多種作用[25]。

編號(hào)33及55蛋白為過氧化氫酶，是一類廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)的末端氧化酶,作為生物體內(nèi)重要物質(zhì), 其最為主要的功能就是參與活性氧代謝過程，是在生物演化過程中建立起來(lái)的生物防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一。在環(huán)境脅迫等逆境情況下, 可導(dǎo)致生物體內(nèi)自由基增多, 使細(xì)胞膜產(chǎn)生過氧化, 導(dǎo)致細(xì)胞膜的破壞和損傷。過氧化氫酶與超氧化物歧化酶、過氧化物酶共同組成生物體內(nèi)活性氧防御系統(tǒng), 在清除超氧自由基、H2O2和過氧化物以及阻止或減少羥基自由基形成等方面發(fā)揮重要作用[26]。

編號(hào)31蛋白為天冬氨酸1-脫羧酶，脫羧酶是能催化羧酸分子中的羧基脫去并產(chǎn)生二氧化碳的酶類，包括氨基酸類脫羧酶和有機(jī)酸類脫羧酶。天冬氨酸1-脫羧酶能催化脫去L-天冬氨酸的α羧基生成β-丙氨酸，而β-丙氨酸是合成泛酸的前體，泛酸是B族維生素的一種，可構(gòu)成輔酶A的一部分，在各種組織內(nèi)的內(nèi)源代謝能量交換方面發(fā)揮重要作用[27-28]。

編號(hào)32蛋白為癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子，細(xì)胞表面的分子統(tǒng)稱為細(xì)胞粘附分子，由于細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的相互粘附是構(gòu)建機(jī)體的組織器官及維持其功能的最基本生命現(xiàn)象，這種相互粘附作用是細(xì)胞粘附分子參與介導(dǎo)的，故在介導(dǎo)單核細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞粘附方面起重要作用[29]。癌胚抗原是最具有代表性的腫瘤標(biāo)志物，在多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)，對(duì)癌癥的臨床診斷具有較好的敏感性和特異性[30]。

編號(hào)35蛋白為粘附 G蛋白偶聯(lián)受體，在認(rèn)知障礙相關(guān)疾病中扮演著重要角色，是一個(gè)超級(jí)膜蛋白家族，不僅可以識(shí)別并整合細(xì)胞外環(huán)境中各類信號(hào)分子，還激活細(xì)胞內(nèi)異源三聚體中的G-protein，使得激活后的G蛋白聯(lián)合三磷酸鳥苷（GTP）置換二磷酸鳥苷（GDP），引起異源三聚體會(huì)有解離等變化，將信號(hào)傳送到細(xì)胞內(nèi)的效應(yīng)分子，進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)的連續(xù)變化[31]。

編號(hào)39蛋白為甘露糖寡糖葡萄糖苷酶，屬于糖蛋白，糖蛋白廣泛存在于微生物和動(dòng)植物中，是生物體內(nèi)最重要的生物大分子之一，其參與的功能也是各有所異。植物中的糖蛋白參與眾多的生命過程，如細(xì)胞壁的形成、受精、病原防御和細(xì)胞間通訊等。甘露糖寡糖葡萄糖苷酶的功能為在寡糖合成過程中，負(fù)責(zé)切除由脂質(zhì)多萜醇轉(zhuǎn)移到目的蛋白上的寡糖鏈最末段的葡萄糖殘基，參與植物根系的發(fā)育[32]。

編號(hào)44蛋白為分選鏈接蛋白，作為一類保守蛋白家族，是指含有吞噬細(xì)胞氧化酶同源性結(jié)構(gòu)域蛋白的統(tǒng)稱。其功能為參與蛋白跨膜過程中貨物分子接頭蛋白與膜錨定蛋白的結(jié)合等蛋白間的相互作用, 在細(xì)胞內(nèi)吞、蛋白分選、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、膜運(yùn)輸、囊泡運(yùn)輸、膜重塑和細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)等方面均起重要作用[33-34]。

編號(hào)46蛋白為熱休克70 kDa蛋白，熱休克蛋白是一類廣泛存在于生物界且高度保守的蛋白質(zhì)，生物體受熱刺激、營(yíng)養(yǎng)缺失、中毒、缺氧、滲透脅迫、創(chuàng)傷等其他應(yīng)激源可誘導(dǎo)熱休克蛋白表達(dá)，故也被稱為應(yīng)激蛋白。常作為分子伴侶在多種細(xì)胞的蛋白質(zhì)折疊、重塑、運(yùn)輸和降解過程中發(fā)揮作用，進(jìn)而參與機(jī)體應(yīng)激損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡、免疫、腫瘤發(fā)生發(fā)展，乃至細(xì)胞的發(fā)育調(diào)控等多種生命活動(dòng)[35-36]。

編號(hào)47蛋白為DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白，參與多種重要的生物學(xué)過程，若 DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)出現(xiàn)缺陷則可能使細(xì)胞出現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定，突變率顯著提高，其完整表達(dá)對(duì)保證細(xì)胞遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性具有重要意義；人類腫瘤部位、分化程度和分期與 DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)密切相關(guān)，其表達(dá)缺失患者愈后明顯較差，可作為判斷患者愈后的一個(gè)潛在標(biāo)志物[37]。

編號(hào) 48蛋白為 Pre-mRNA 剪接因子，Pre-mRNA在剪接體發(fā)生剪接，剪接體的組裝和活性對(duì)剪接位點(diǎn)的選擇和催化作用非常重要。Pre-mRNA 剪接因子在植物響應(yīng)非生物脅迫方面發(fā)揮重要作用，且不同的剪接因子在植物協(xié)迫反應(yīng)中扮演不同的角色[38]。

編號(hào) 50蛋白為光系統(tǒng)Ⅱ穩(wěn)定性/組裝因子，植物葉綠體中的氧化還原調(diào)控，在生長(zhǎng)發(fā)育、基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗逆等生命活動(dòng)中起非常重要的作用。光系統(tǒng)Ⅰ與光系統(tǒng)Ⅱ涉及高等植物2個(gè)光系統(tǒng)復(fù)合物組裝和功能調(diào)控，結(jié)構(gòu)上由核基因與葉綠體基因共同編碼的蛋白組成的多亞基色素蛋白復(fù)合體，其復(fù)合物組裝過程中蛋白以一定地次序合成并組裝，且每一個(gè)過程都需要一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)因子的參與[39]。除了結(jié)構(gòu)蛋白亞基，光系統(tǒng)Ⅱ還包含了用來(lái)結(jié)合反應(yīng)中心蛋白的色素和輔因子，伴隨強(qiáng)烈的氧化光化學(xué)反應(yīng)，使得這些反應(yīng)中心蛋白易受到光損傷并加速它們的周轉(zhuǎn)[40]。

編號(hào)58蛋白為鐵紅桿菌素受體，鐵是多細(xì)胞生物和幾乎所有微生物的必需微量元素，鐵蛋白是細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存鐵的蛋白復(fù)合體，可將鐵以穩(wěn)定的Fe3+儲(chǔ)存起來(lái)，防止細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過多的游離Fe2+，并在細(xì)胞內(nèi)可利用鐵降低時(shí)釋放儲(chǔ)存的鐵來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)。鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白能夠降低細(xì)胞內(nèi)鐵水平，位于細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor，TFRC）能夠與攜帶游離鐵的轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合，將細(xì)胞外鐵轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，提高細(xì)胞內(nèi)鐵水平，對(duì)細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)起到重要作用[41]。大多數(shù)細(xì)菌在缺鐵環(huán)境中會(huì)生產(chǎn)和分泌一種被稱為鐵載體的小分子鐵結(jié)合化合物，并通過同類運(yùn)輸?shù)鞍變?nèi)在化這些鐵復(fù)合物，而鐵紅桿菌素受體涉及細(xì)菌在響應(yīng)鐵饑餓時(shí)，在操縱子發(fā)生聚合，從而進(jìn)行其生物合成的4個(gè)主要步驟[42]。

編號(hào)59蛋白為tRNA-鳥嘌呤轉(zhuǎn)糖基酶，也被稱為 tRNA鳥嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶，是一種用喹啉催化取代鳥嘌呤的酶，可以使 tRNA中的部分鳥嘌呤核苷合成苷。糖基轉(zhuǎn)移酶的種類較多，具有較高的特異性，參與細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、黏附等生理過程，其表達(dá)或功能的失調(diào)失控均參與多種病理過程[43-44]。

以上結(jié)果分析中，編號(hào) 4蛋白高密度脂蛋白結(jié)合蛋白的得分和覆蓋率低，編號(hào)41蛋白為推定的未表征蛋白質(zhì) ENSP00000382790同源物及編號(hào)51蛋白為蛋白質(zhì) sepa-1無(wú)合適文獻(xiàn)支持，因此沒有對(duì)這3個(gè)蛋白進(jìn)行功能分析。從其他的蛋白功能分析結(jié)果可看出, 提取的長(zhǎng)花龍血樹葉中的主要蛋白涉及生長(zhǎng)、發(fā)育及植物抗逆等多種功能，有些不僅也與動(dòng)物體內(nèi)所含蛋白名稱一致，而且大多數(shù)蛋白以及酶都具有一定的藥理活性，比如蛋氨酸合酶對(duì)防治肝臟疾病和砷中毒能到達(dá)一定的有效性治療[7]，熱休克70 kDa蛋白對(duì)攻擊感染產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)性[45]，tRNA-鳥嘌呤（15）轉(zhuǎn)糖基酶可在肺腺癌中有特異性，無(wú)論是對(duì)肝臟疾病或者提高免疫力、促進(jìn)機(jī)體健康等方面都能有一定的作用[44]。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選擇海南地道產(chǎn)長(zhǎng)花龍血樹葉作為研究對(duì)象，建立了提取分離長(zhǎng)花龍血樹葉的蛋白指紋圖譜的方法，并鑒定分析了其中所含主要蛋白及其功能，確定了與長(zhǎng)花龍血樹藥物活性相關(guān)的蛋白名稱，對(duì)補(bǔ)充說(shuō)明有關(guān)長(zhǎng)花龍血樹藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)、進(jìn)一步對(duì)長(zhǎng)花龍血樹葉的育種和開發(fā)以及為海南黎藥的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)合理的理論依據(jù)，對(duì)理解海南島的生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)和生態(tài)效益也具有一定的理論和實(shí)踐意義。