葛小琴 趙菁 葉曉賢 沈虹

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，每年全球新診斷病例超過200 萬[1]，三陰性乳腺癌是乳腺癌中侵襲性最強的類型，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后很差。全身化療是治療晚期三陰性乳腺癌患者主要手段。紫杉類聯(lián)合蒽環(huán)類（taxane-anthracycline，AT）藥物是治療乳腺癌最主要化療藥物，其中紫杉類藥物以紫杉醇和多西他賽為代表，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌的一線和二線治療中顯示出重要作用[2-4]。其他可選的化療藥物包括吉西他濱、長春瑞賓、鉑類等。然而，化療是經(jīng)驗性用藥，并非所有患者都能從中受益。目前，臨床上未有明確的標(biāo)志物可用來預(yù)測化療療效。因此，如能找到合適的預(yù)測手段，在化療前就能將對某一種化療方案受益的人群篩選出來，進行個體化治療，這將有益于患者的治療及預(yù)后。表面增強激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜（surface-enhanced laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）是一種基于化學(xué)修飾表面捕獲肽或/和蛋白質(zhì)的新技術(shù)，可有效分析復(fù)雜的生物樣品，結(jié)合生物信息學(xué)方法，SELDITOF-MS 發(fā)現(xiàn)了幾種對癌癥診斷和治療具有高靈敏度和特異度的標(biāo)志物[5-8]。本研究使用SELDI-TOF-MS技術(shù)比較晚期三陰性乳腺癌患者中經(jīng)一線AT 治療的化療受益者和無效者的血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，結(jié)合人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（artificial neural networks，ANN），初步建立血清蛋白質(zhì)指紋圖譜晚期三陰性乳腺癌化療療效的預(yù)測模型，以期為化療前篩選出對AT 方案有效的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料 收集的26 份血清標(biāo)本保存于浙江大學(xué)腫瘤研究所血清庫，患者為2015年8月至2018年7月浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院收治的三陰性轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：組織學(xué)診斷為三陰性乳腺癌；未經(jīng)化療；至少有1 個可測量的轉(zhuǎn)移性病灶；年齡18～75 歲；WHO 體能狀態(tài)評分為0 或1。排除標(biāo)準(zhǔn)：心功能不全患者及預(yù)計生存期＜3 個月。患者首次化療空腹采集靜脈血，1 000 r/min 離心2 min 分離血清，儲存在-80℃冰箱備用。本研究經(jīng)浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院人體研究倫理委員會審核[審批號：（2022）倫審研第（0528）號]，所有患者簽署知情同意書。

1.2 化療方案 所有患者均采用AT 方案作為一線化療。AT 方案包括多柔比星（美國輝瑞，規(guī)格：10 mg）50 mg/m2靜脈推注加多西他賽（法國賽諾菲，規(guī)格：20 mg）75 mg/m2靜脈滴注1 h，每3 周給藥1 次，共2 個周期。療效評價：根據(jù)實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)（response evaluation criteria in solid tumors 1.1，RECIST 1.1），每2個化療周期評估療效。使用觀察到的最佳反應(yīng)將患者分為兩組?；熓芤妫╮esponders，R）組包括完全緩解（complete response，CR）和部分緩解（partial response，PR）患者，化療無效（non-responders，NR）組包括疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）和疾病進展（progressive disease，PD）患者。

1.3 蛋白質(zhì)峰的檢測與收集 使用SELDI-TOF-MS檢測。取血清標(biāo)本10 μl 加入到90 μl 的5 g/L 的3-環(huán)乙胺-1 丙磺酸（3-cholamidopropyl dimethylammonio-1-propanesulfonate，CHAPS）中，調(diào)整pH 7.4，振蕩10 min使之充分混合，加入到用5 g/L CHAPS 平衡3 次的100 μl Cibacron Blue 3GA 溶液中，轉(zhuǎn)移至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，4 ℃搖床上振蕩1 h。取出培養(yǎng)液1 000 r/min 離心，去上清液，用150 μl 20 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸[4-（2-hydroxyerhyl）piperazine-1-erhanesulfonic acid，HEPES，pH 7.4]稀釋。使用包含疏水表面（H4）芯片的生物處理器，其芯片先前由20 mmol/L HEPES 激活。將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至生物處理器密封平臺搖床上，4 ℃振蕩1 h。棄去上清液，平臺搖床上以700 r/min 振蕩5 min，取出芯片用20 mmol/L HEPES（pH 7.4）洗滌3次。晾干芯片，加入氰基-4-羥基肉桂酸（acyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA）結(jié)晶，使用蛋白質(zhì)生物系統(tǒng)II 和質(zhì)譜儀讀取器以65 次激光射擊收集數(shù)據(jù)，強度為165，探測器靈敏度為7，最高質(zhì)量為60 000 m/z，優(yōu)化收集數(shù)據(jù)范圍2 000～30 000 m/z。使用全合一肽分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)儀將質(zhì)量準(zhǔn)確度校準(zhǔn)到＜0.1%。所有樣品的光譜均歸一化為2 000～30 000 m/z 的總離子電流。濾除噪聲，并使用自動峰檢測通道檢測峰。采用第二次通過峰選擇（信噪比＞2，在0.3% 質(zhì)量窗口內(nèi)）完成峰簇，添加估計峰值。使用ProteinChip Software 3.2 和Biomarker Wizard 3.1 軟件執(zhí)行數(shù)據(jù)的收集步驟。使用ANN 分析收集到的蛋白質(zhì)峰。所有計算均使用Statistica6.0（StatSoft，Inc.，Tulsa，OK）軟件包進行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件，非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗。采用ROC 曲線分析蛋白質(zhì)峰的評價效能。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 化療療效統(tǒng)計 經(jīng)2 個周期治療后，26 例患者17例（65.4%）有效，9例（34.6%）無效。

2.2 蛋白質(zhì)峰分析 共檢測到223個質(zhì)荷比為2 000～30 000 m/z的蛋白質(zhì)峰，可能作為AT方案治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者療效預(yù)測的潛在標(biāo)志物。經(jīng)ROC曲線排序，選擇AUC最大的5個峰作為候選生物標(biāo)志物。血清蛋白質(zhì)荷比分別為16 031、6 098、15 931、6 916 和4 773 m/z，見圖1（插頁）。相比無效組，有效組中4 773 m/z 蛋白質(zhì)峰顯著升高，16 031、6 098、15 931 和6 916 m/z 峰顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。利用這5 個峰建立用于預(yù)測AT 方案治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌療效的預(yù)測模型。將樣本隨機分為訓(xùn)練組和測試組，交叉驗證顯示，化療受益者組17 例樣本均被準(zhǔn)確預(yù)測，化療無效組9 例樣本中8 例被準(zhǔn)確預(yù)測，該預(yù)測模型預(yù)測化療療效靈敏度達(dá)1.000（17/17），特異度達(dá)0.889（8/9），見表2。

表1 兩組患者5 個蛋白質(zhì)峰比較

表2 乳腺癌化療療效預(yù)測模型的驗證結(jié)果（例）

圖1 AT方案治療兩組晚期乳腺癌患者的蛋白質(zhì)峰

3 討論

臨床發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療過程中，有大約一半的患者出現(xiàn)耐藥性。事實上轉(zhuǎn)移性腫瘤在初始治療中獲得最大反應(yīng)對提高整體治療成功率至關(guān)重要，這顯示化療藥物療效預(yù)測標(biāo)志物的重要性。

SELDI-TOF-MS蛋白質(zhì)芯片技術(shù)可用于乳腺癌的診斷、鑒別診斷、預(yù)后評估及術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)測等。Sun 等[9]通過SELDI-TOF-MS技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，相比于健康人群，乳腺癌患者外周血中蛋白質(zhì)峰在6 448 m/z 處表達(dá)顯著降低，尤其是三陰乳腺癌中表達(dá)強度明顯減弱，提示6 448 m/z 的蛋白質(zhì)峰可能是一種潛在的診斷標(biāo)志物。Yigitbasi 等[10]使用SELDI-TOF-MS技術(shù)鑒定了4 個在乳腺癌患者和非癌癥患者間存在明顯差異的蛋白質(zhì)峰群，所鑒定的蛋白質(zhì)峰（分別為3 972、6 850、8 115、8 949 m/z）可與癌抗原125 選擇性結(jié)合，作為診斷乳腺癌的重要生物標(biāo)志物。Chung 等[11]用蛋白質(zhì)芯片質(zhì)譜法發(fā)現(xiàn)并確立了由5 種血清蛋白組成的預(yù)測模型，區(qū)分乳腺癌患者和人群的靈敏度為0.866，特異度為0.924；該模型與腫瘤大小和淋巴結(jié)受累相關(guān)，有助于判斷乳腺癌的預(yù)后，尤其是雌激素受體（esrtogen receptor，ER）陰性的乳腺癌。Gmez-Pozo[12]等在對乳腺癌患者術(shù)后輔助化療的研究中發(fā)現(xiàn)高通量蛋白組學(xué)可用于識別三陰性乳腺癌中具有不同預(yù)后的亞組，可通過多種蛋白質(zhì)組合，實現(xiàn)對不同分期患者的分層預(yù)測，如蛋白質(zhì)RAC2、RAB6A、BIEA 和IPYP 組成的最佳預(yù)測因子，可有效預(yù)測患者病情，并對醫(yī)師治療起指導(dǎo)和參考作用。Lei 等[6]發(fā)現(xiàn)3 964 m/z 蛋白質(zhì)峰在乳腺癌術(shù)后下降，復(fù)發(fā)后又回升，可作為監(jiān)測乳腺癌早期復(fù)發(fā)的標(biāo)志物。以上研究在乳腺癌診斷、復(fù)發(fā)監(jiān)測和預(yù)后評估中都體現(xiàn)了較好的預(yù)測效能。

目前通過乳腺癌化療療效預(yù)測的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜模型研究較為罕見。王棟梁等[13]使用基質(zhì)輔助雷射解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)從乳腺癌MMTVPyMT 轉(zhuǎn)基因小鼠中篩選出5 個差異最大的分子峰，并建立紫杉醇耐藥預(yù)測模型。Zhang 等[14]使用SELDITOF-MS 發(fā)現(xiàn)新輔助化療后有8 個不同血清蛋白質(zhì)峰的強度高于新輔助化療前。鄭弘宇等[15]通過SELDITOF-MS 技術(shù)檢測了乳腺癌患者治療前外周血中蛋白質(zhì)峰，結(jié)果發(fā)現(xiàn)7 971、9 284 m/z 處峰值降低的乳腺癌患者可能對曲妥珠單抗治療耐藥。He 等[16]利用SELDI-TOF-MS 技術(shù)分析新輔助化療前乳腺癌組織的蛋白組學(xué)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)16 906 m/z 處的蛋白質(zhì)峰能正確鑒別出88.9%的病理完全反應(yīng)的腫瘤和91.7%耐藥腫瘤。提示使用乳腺癌蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物可預(yù)先區(qū)分化療受益人群，并由此指導(dǎo)不同患者選擇最佳的化學(xué)治療。Shenoy 等[17]通過蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了兩個脯氨酸生物合成途徑的蛋白吡咯啉-5-羧酸還原酶（pyrroline-5-carboxylate reductase 1，PYCR1）和ALDH18A1，與化療的耐藥性顯著相關(guān)，其中PYCR1 在治療后完全應(yīng)答者中明顯下調(diào)，而在非應(yīng)答者中則沒有改變。Yang 等[18]通過質(zhì)譜分析及免疫組化方法發(fā)現(xiàn)FK506 結(jié)合蛋白4（FK 506 binding protein 4，F(xiàn)KBP4）、S-100A9可能是阿霉素聯(lián)合多西他賽治療乳腺癌化療靈敏度的預(yù)測標(biāo)志。

本研究使用SELDI-TOF-MS 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)化療收益組和無效組中血清蛋白質(zhì)峰的差異，并使用ANN 分析這些峰值，最終建立預(yù)測AT 方案療效的蛋白質(zhì)模型，靈敏度和特異度分別為1.000 和0.889。今后研究可重點關(guān)注這些蛋白質(zhì)或多肽的鑒定與分離。如果能清楚地闡明它們的分子結(jié)構(gòu)及功能，它們在預(yù)測化療療效方面的應(yīng)用潛力將顯著提高，并為轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療提供新的見解，即將這種蛋白質(zhì)模型作為決策工具，優(yōu)先篩選出能從一線化療中獲益的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者。

綜上所述，SELDI-TOF-MS 技術(shù)與生物信息學(xué)工具及ANN 相結(jié)合可促進新的標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。本研究篩選出能預(yù)測轉(zhuǎn)移性乳腺癌化療療效相關(guān)的標(biāo)志蛋白，建立高靈敏度和特異度的預(yù)測模型，為腫瘤個體化治療提供了新的方法。