郭林濤，閆紅濤

（河北省館陶縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 邯鄲 056000）

為了解禽流感（H9 亞型）病毒雞胚毒接種獲得的細(xì)胞毒抗原與雞胚毒抗原免疫效力的差異，本試驗分別采用禽流感（H9 亞型）病毒HA效價≥1∶256 或病毒含量≥107.5EID50/0.1 毫升的細(xì)胞毒抗原和禽流感（H9 亞型）病毒雞胚毒抗原制備成兩批滅活疫苗，分別免疫SPF 雞，進(jìn)行免疫效力比較試驗。對比試驗結(jié)果顯示，禽流感（H9 亞型）病毒細(xì)胞毒滅活疫苗與禽流感（H9 亞型）病毒雞胚毒滅活疫苗免疫SPF 雞后HI 抗體效價均高于雞新城疫、禽流感（H9 亞型）二聯(lián)滅活疫苗禽流感部分質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，且兩者免疫效力無顯著差異。禽流感（H9 亞型）病毒細(xì)胞毒與禽流感（H9 亞型）病毒雞胚毒的免疫效力對比試驗證明了，禽流感（H9 亞型）病毒雞胚毒接種MDCK 細(xì)胞繁殖的細(xì)胞毒，沒有改變毒株本身的特性，保持了毒株較好的免疫原性，能夠用于本制品的研究；禽流感（H9 亞型）病毒HA 效價≥1∶256 或病毒含量≥107.5EID50/0.1 毫升的細(xì)胞毒，制備的滅活疫苗均合格。

1 材料

1.1 制苗用種毒、細(xì)胞

1.1.1 種毒

禽流感（H9 亞型）病毒雞胚毒，E5 和E7 代，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)繁殖傳代。

1.1.2 生產(chǎn)種毒

禽流感（H9 亞型）病毒雞胚毒。

1.1.3 生產(chǎn)種細(xì)胞

全懸浮MDCK 細(xì)胞由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗室制備。

1.2 主要試劑

1.2.1 診斷試劑

禽流感病毒H9 亞型血凝抑制試驗抗原及禽流感病毒H9 亞型陽性血清，來源于哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.2.2 MDCK 全懸浮無血清培養(yǎng)基

MS01 無血清培養(yǎng)基來源于蘇州沃美生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品批號41241701。

1.2.3 制苗用油相

來源于河南通商進(jìn)出口有限公司，批號：701195。

1.3 試驗動物

SPF 雞胚和SPF 雞均來源于北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司。

1.4 高剪切分散乳化機(jī)

型號：FA25；生產(chǎn)廠家：上海弗魯克科技發(fā)展有限公司。

2 方法

2.1 疫苗的配制

2.1.1 細(xì)胞毒滅活疫苗制備

使用禽流感（H9 亞型）病毒E5 和E7 代雞胚毒，接種MDCK 細(xì)胞，繁殖得到2 批禽流感（H9 亞型）病毒細(xì)胞病毒液，HA 效價均為1∶256，病毒含量分別為107.68EID50/0.1 毫升、107.5EID50/0.1 毫升。兩批細(xì)胞毒抗原滅活后，按照油相∶水相=2∶1 的比例，分別配制成兩批滅活疫苗。

2.1.2 雞胚毒滅活疫苗的制備

使用禽流感（H9 亞型）病毒E5 和E7 代雞胚毒，接種SPF 雞胚，繁殖得到禽流感（H9 亞型）病毒雞胚毒，HA 效價均為1∶256，病毒含量分別為108.5EID50/0.1 毫升、108.68EID50/0.1 毫升。兩批雞胚毒抗原滅活后，按照油相∶水相=2∶1 的比例，分別配制成兩批滅活疫苗。

2.2 分組與免疫

使用45 只雞，四組疫苗分別免疫10 只，每只雞頸部皮下注射疫苗0.3 毫升。另5 只SPF雞，不接種作為對照，同等條件下隔離飼養(yǎng)。免疫21 日后。連同對照雞5 只分別采血，分離血清，按現(xiàn)行《中國獸藥典》三部附錄3404 測定各組血清HI 抗體效價。

3 結(jié)果

3.1 將HA 血凝價均為1∶256 的兩批禽流感（H9 亞型）病毒細(xì)胞毒配制疫苗，免疫SPF 雞產(chǎn)生的HI 平均抗體滴度分別為1∶588 （9.2log2）和1∶676（9.4log2）。因此，免疫后雞新城疫HI 抗體水平遠(yuǎn)高于雞新城疫、禽流感（H9 亞型）二聯(lián)滅活疫苗禽流感部分質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求（HI 不低于1∶64）。不免疫對照組HI 抗體均不高于1∶4 （見表）。

3.2 將HA 血凝價均為1∶256 的禽流感（H9亞型）病毒雞胚毒配制疫苗，免疫SPF 雞產(chǎn)生的HI 平均抗體效價分別達(dá)到1∶724（9.5log2）和1∶832（9.7log2）；因此，免疫后抗體水平遠(yuǎn)高于雞新城疫、禽流感（H9 亞型）二聯(lián)滅活疫苗禽流感部分質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求（HI 不低于1∶64）。不免疫對照組HI 抗體均不高于1∶4（見下表）。

通過對比試驗，表明禽流感（H9 亞型）病毒細(xì)胞毒HA 效價1∶256 或病毒含量為107.5EID50/0.1 毫升，均可達(dá)到雞新城疫、禽流感（H9 亞型）二聯(lián)滅活疫苗制苗的標(biāo)準(zhǔn)。兩批細(xì)胞毒配制的疫苗，免疫SPF 雞后，抗體效價與兩批雞胚毒配制的疫苗效力相當(dāng)，且四組疫苗免疫SPF 雞后抗體效價均遠(yuǎn)高于雞新城疫、禽流感（H9 亞型）二聯(lián)滅活疫苗禽流感部分質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。因此，禽流感（H9 亞型）病毒細(xì)胞毒HA 效價1∶256 或病毒含量為107.5EID50/0.1 毫升均可用于制苗。

4 結(jié)論

綜上所述，通過禽流感（H9 亞型）病毒細(xì)胞源與雞胚源病毒液的免疫效力對比試驗，禽流感細(xì)胞源滅活疫苗接種SPF 雞可以獲得與禽流感雞胚源病毒滅活疫苗相近的抗體效價，兩者具有相同的免疫效力。禽流感（H9 亞型）病毒細(xì)胞毒與雞胚毒的免疫效力對比試驗證明了，禽流感病毒雞胚接種MDCK 細(xì)胞，制備的細(xì)胞毒，沒有改變毒株本身的特性，保持了毒株較好的免疫原性，能夠用于本制品的研究；禽流感（H9亞型）病毒HA 效價不低于1∶256 或病毒含量≥107.5EID50/0.1 毫升的細(xì)胞毒，制備的滅活疫苗均合格。

不同抗原制備的禽流感疫苗免疫后HI 抗體