翁吳斌 劉昌明 張家彬 李國(guó)敏 薛清平 林寧峰 陳光炳

目前前列腺癌發(fā)病率為13.5%，位居男性全部惡性腫瘤第二位[1]，且隨著人口老齡化，其發(fā)病率和病死率將逐年升高，對(duì)社會(huì)和家庭均造成巨大負(fù)擔(dān)，因此尋找有效的治療方案成了當(dāng)務(wù)之急。RALA 作為RAL（Ras 相關(guān)性蛋白，Ras-like）家族的一員，其基因最早由類(lèi)人猿RALA 基因序列中分離出來(lái)的，定位在人類(lèi)7 號(hào)染色體上，其長(zhǎng)度為84 642 bp[2]。相關(guān)研究數(shù)據(jù)顯示RAL 家族蛋白在惡性腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移等生物行為中起著至關(guān)重要的作用，在包括結(jié)腸癌、肺癌在內(nèi)的多種腫瘤中都發(fā)現(xiàn)RAL 家族基因的表達(dá)改變[2]。另有研究表明，在多種腫瘤的生長(zhǎng)中，RALA 作為癌基因起著關(guān)鍵性作用[3]。在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中是否存在RALA 的參與目前尚不明確。因此本研究通過(guò)小干擾RNA 沉默前列腺癌DU145 細(xì)胞株中RALA 基因的表達(dá)來(lái)觀(guān)察對(duì)DU145 細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的影響，以及探討可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人前列腺癌細(xì)胞株LNCap、PC-3 和DU145 購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。PRMI1640 培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清均購(gòu)于北京賽默飛世爾科技有限公司；鏈霉素、青霉素來(lái)源于山東魯抗醫(yī)藥；PBS 緩沖液、細(xì)胞裂解液（RIPA）、RTPCR 試劑盒、Trizol 試劑購(gòu)于杭州博日生物科技有限公司；LipofectamineTM2000 購(gòu)于Invitrogen 公司；Annexin V/PI 染色試劑、噻唑藍(lán)比色法（MTT）盒均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；未包被基質(zhì)膠 的Transwell 小室美國(guó)Sigma 公 司；PCR 引物和RALA-siRNA 由上海生工生物工程有限公司合成，于-20 ℃下保存；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL試劑盒均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所；山羊抗兔IgG 第二抗體、山羊抗鼠IgG、兔抗人RALA 多克隆抗體第二抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人前列腺癌LNCap、DU145 和PC-3 細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液進(jìn)行傳代培養(yǎng)。每2～3 天更換一次培養(yǎng)液，維持培養(yǎng)液pH 值在7.2～7.4，當(dāng)前列腺癌細(xì)胞以致密單層的形式平鋪在培養(yǎng)瓶壁上后則用于傳代，使用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，實(shí)驗(yàn)用的前列腺癌細(xì)胞采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.2.2 RT-PCR 檢測(cè)前列腺癌DU145、PC-3 和LNCap 細(xì)胞中RALA mRNA 的表達(dá)水平 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DU145、PC-3 和LNCap 細(xì)胞，按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)，用Trizol 試劑提取細(xì)胞總RNA，取2 μg 總RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以該cDNA 作為模板，用RT-PCR 試劑進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，檢測(cè)三種細(xì)胞株中RALA mRNA 的表達(dá)，以GAPDH 為內(nèi)參照。PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成，RALA上游引物5′-ATCGGAAGAAGGTAGTGC-3′，下游引物5′-AAATCTGCTCCCTGAAGT-3′；GAPDH上游引物5′-GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT-3′，下游引物5′-AAGAATGGGAGTTGCTTTGAAGTC-3′，RALA 與GAPDH 擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度分別為182 bp、700 bp。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，56 ℃（RALA）/60 ℃（GAPDH）30 s，72 ℃ 30 s，共40 個(gè)循環(huán)。根據(jù)2-ΔΔCt法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.2.3 分組轉(zhuǎn)染與MTT 法檢測(cè)細(xì)胞的增殖率 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DU145 細(xì)胞，以細(xì)胞懸液的形式接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù)達(dá)5×105個(gè)，于孵育箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)60%，利用LipofectamineTM2000 進(jìn)行轉(zhuǎn)染（操作步驟參照LipofectamineTM2000 說(shuō)明書(shū)），轉(zhuǎn)染RALA-siRNA為RALA-siRNA組，也即實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染negativesiRNA 為陰性對(duì)照組，而在空白對(duì)照組中只加入等體積無(wú)血清RPMI-1640 培養(yǎng)液。在96 孔板中，將三組以5×104個(gè)細(xì)胞/mL 的密度進(jìn)行接種，每孔100 μL，每組設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，置于孵育箱中，分別培養(yǎng)12、24、48、72 和96 h 后在避光環(huán)境下添加5 mg/mL MTT，10 μL/孔，再培養(yǎng)4 h 后吸棄培養(yǎng)液，以150 μL/孔的量添加DSMO，然后放在搖床上低速震蕩，時(shí)間為10 min，于酶標(biāo)檢測(cè)儀波長(zhǎng)為490 nm 處檢測(cè)每個(gè)孔的OD值，作為細(xì)胞增殖的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)開(kāi)展3次，然后繪制細(xì)胞的增殖曲線(xiàn)。

1.2.4 Transwell 法檢測(cè)細(xì)胞的遷移 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞重懸于RPMI-1640 培養(yǎng)液中，該培養(yǎng)液中含有1 mmol/L 的氯化鎂、0.2 mmol/L 的氯化錳、1 mmol/L 的氯化鈣及5 g/L 的牛血清白蛋白，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×105/mL。在Transwell 上室中加入200 μL 重懸細(xì)胞液，在下室的每室中添加500 μL 含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液。置于孵育箱中培養(yǎng)12 h，取出小室，吸棄培養(yǎng)液，濕棉簽?zāi)ǔ龥](méi)有穿過(guò)小室膜的細(xì)胞，在室溫環(huán)境中4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，1×PBS 緩沖液洗滌固定后的細(xì)胞3次，每次時(shí)長(zhǎng)5 min，結(jié)晶紫染色時(shí)長(zhǎng)3 min，1×PBS 緩沖液清洗干凈，干燥后置于100 倍光鏡下觀(guān)察計(jì)數(shù)并拍照。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率 轉(zhuǎn)染72 h后，置于離心機(jī)中進(jìn)行離心，然后收集空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞，預(yù)冷PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞3次，離心后去除上清液，應(yīng)用200 μL Binding Buffer 重懸細(xì)胞，然后分別添加5 μL 的PI及10 μL 的Annexin V-FITC，輕輕混勻，在避光及室溫環(huán)境下反應(yīng)20 min。通過(guò)流式細(xì)胞儀來(lái)測(cè)細(xì)胞的凋亡率，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)開(kāi)展3 次。

1.2.6 RT-PCR 檢測(cè)沉默RALA 基因后DU145 細(xì)胞株中RALA 基因的表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染72 h后，收集空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞，按1.3 節(jié)的RT-PCR 法檢測(cè)DU145 細(xì)胞株中RALA mRNA 的表達(dá)水平。

1.2.7 Western blot 檢測(cè)沉默RALA 基因后DU145細(xì)胞株中RALA 蛋白的表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染72 h后，收集空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞，用RIPA 提取細(xì)胞總蛋白（步驟參照RIPA 說(shuō)明書(shū)）。BCA 法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，并根據(jù)定量結(jié)果調(diào)整平衡蛋白量。充分混勻等體積的上樣緩沖液與樣品，在98 ℃下變性5 min，室溫下冷卻。取10 μg 上樣在SDS-PAGE 凝膠上電泳，電泳結(jié)束后目的蛋白移到PVDF 膜上，進(jìn)行膜的染色，5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉1 h，加入一抗RALA、GAPDH（工作濃度分別為1∶1 000、1∶2 000）4 ℃孵育過(guò)夜；加入相應(yīng)辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的二抗（1∶1 000 稀釋?zhuān)?，在室溫環(huán)境下平緩搖動(dòng)，時(shí)間為1 h。濾紙干燥PVDF膜，根據(jù)ECL 試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行發(fā)光、壓片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以用（±s）描述，組間比較采用t檢驗(yàn)或方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞中RALA mRNA 的表達(dá) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DU145、LNCap 和PC-3細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞中RALA mRNA 的表達(dá)水平，以GAPDH 為內(nèi)參照。其結(jié)果顯示：RALA在體外培養(yǎng)的DU145、LNCap 和PC-3 細(xì)胞中均有表達(dá)，且相對(duì)表達(dá)水平分別為（0.83±0.02）、（0.41±0.01）、（0.37±0.07），RALA 在DU145 細(xì) 胞中的表達(dá)水平最高（P＜0.05），見(jiàn)圖1。遂取DU145細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究細(xì)胞。

圖1 RT-PCR檢測(cè)前列腺癌DU145、LNCap和PC-3 細(xì)胞中RALA mRNA的表達(dá)

2.2 沉默RALA 基因?qū)U145 細(xì)胞增殖的影響 MTT 法測(cè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組DU145 細(xì)胞的增殖。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染RALA-siRNA 2 d后，實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組相比較，其DU145 細(xì)胞的增殖速度明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞增殖情況的比較（±s）

表1 各組細(xì)胞增殖情況的比較（±s）

*與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組比較，P＜0.05。

2.3 沉默RALA 基因?qū)U145 細(xì)胞遷移能力的影響 用未包被基質(zhì)膠的Transwell 小室檢測(cè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的遷移，結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)（26.00±9.29）明顯少于空白對(duì)照組（157.00±16.03）及陰性對(duì)照組（149.01±12.03），實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染RALA-siRNA抑制DU145細(xì)胞的遷移

2.4 沉默RALA 基因?qū)U145 細(xì)胞凋亡的影響轉(zhuǎn)染RALA-siRNA 72 h后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組DU145 細(xì)胞的凋亡?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞的凋亡率為（2.71±0.78）%，陰性對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為（2.39±0.89）%，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率為（17.21±1.33）%，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染RALA-siRNA促進(jìn)DU145細(xì)胞的凋亡

2.5 RT-PCR 和Western blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染RALAsiRNA 后DU145 細(xì)胞中RALA 的表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染RALA-siRNA 72 h后，RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果（圖4A）顯示實(shí)驗(yàn)組RALA mRNA 的表達(dá)水平（0.21±0.03）明顯低于空白對(duì)照組（0.81±0.09）和陰性對(duì)照組（0.79±0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Western blot 結(jié)果（圖4B、4C）顯示與空白對(duì)照組（0.82±0.03）、陰性對(duì)照組（0.80±0.02）比較，實(shí)驗(yàn)組（0.21±0.03）DU145 細(xì)胞中RALA 蛋白表達(dá)明顯受抑制（P＜0.05）。

圖4 轉(zhuǎn)染RALA-siRNA后DU145細(xì)胞中RALA的表達(dá)水平

3 討論

前列腺癌在全球男性惡性腫瘤中的占比呈逐年遞增趨勢(shì)，與此同時(shí)，由于老齡化人口增多、生活壓力變大、生活飲食習(xí)慣改變及前列腺癌篩查普及等因素，我國(guó)前列腺癌發(fā)病率近年來(lái)呈明顯上升趨勢(shì)[4]。得益于前列腺癌篩查的開(kāi)展，早期前列腺癌的診斷率明顯升高，但在我國(guó)仍有約60%患者就診時(shí)已處于前列腺癌晚期，已無(wú)法通過(guò)根治性治療獲得良好療效，需終生采用綜合性治療，主要采用內(nèi)分泌治療[5-6]。目前，抗雄治療仍是晚期前列腺癌治療的首選方案，但絕大多數(shù)的患者經(jīng)1 年半至2 年的內(nèi)分泌治療，均會(huì)進(jìn)展到去勢(shì)抵抗性前列腺癌（CRPC）階段。雖然阿比特龍等新型雄激素生物合成酶抑制劑的使用，提高了患者的生存率，但耐藥性、副作用及價(jià)格昂貴等限制了其廣泛應(yīng)用。因此目前前列腺癌基礎(chǔ)研究的重要及主要方向仍是尋找新的靶向基因。

在腫瘤的生長(zhǎng)過(guò)程中，RAS 作為原癌基因發(fā)揮著重要及關(guān)鍵性的作用。RAS 基因的激活，并通過(guò)調(diào)控一系列下游信號(hào)通路，最終導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)腫瘤的形成。RALA 作為RAS 信號(hào)通路下游蛋白，在腫瘤的形成、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[7]。RALA 是RAL 家族的一員，屬于小GTP 酶超家族，對(duì)細(xì)胞生物學(xué)功能具有重要的調(diào)控作用，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)、細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞分裂等[8-9]。研究表明，在腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)等方面，RAL 家族蛋白起著重要作用[10]。RAL 家族是一類(lèi)低分子量的蛋白質(zhì)，以?xún)煞N形式存在，分別為非活性的RALGDP 和活性的RALGTP[11-12]。RALA生物學(xué)功能主要通過(guò)非活性的RALAGDP 與活性的RALAGTP 兩種形態(tài)間的相互轉(zhuǎn)化得以實(shí)現(xiàn)，其過(guò)程受RAL 特異的鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子（RALspecific guanyl nucleotide exchange factor，RALGEF）調(diào)節(jié)[13]。在RAS 信號(hào)通路中RALGEF 介導(dǎo)惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，發(fā)揮關(guān)鍵性作用[14]。RALBP1（RALA binding protein 1）作 為RALA下游效應(yīng)物，通過(guò)與活化的RALA 結(jié)合而得以激活[15-16]?；罨疪ALBP1 能夠調(diào)控cyclin B-CDK1 的活性，從而促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂期的線(xiàn)粒體分裂。同時(shí)激活RALBP1 可活化Rac1 和Cdc42，兩者分別在遷移細(xì)胞細(xì)胞膜的變化及細(xì)胞絲狀偽足的形成中起著促進(jìn)作用[15]。RALBP1 的結(jié)合蛋白R(shí)EPS2/POB1（partner of RALBP1）的活性受RALBP1 調(diào)節(jié)。REPS2/POB1的表達(dá)在癌細(xì)胞中是呈抑制狀態(tài)的，當(dāng)其過(guò)表達(dá)時(shí)能抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及誘導(dǎo)其凋亡[17]。另外通過(guò)增強(qiáng)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換，活化的RALA 可以抑制Cdc42 所致的轉(zhuǎn)錄減少來(lái)抑制凋亡調(diào)節(jié)蛋白CFLAR（CASP8 and FADD-like apoptosis regulator）的表達(dá)，以此來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[18-19]。散射因子（scatter factor，SF）是一種肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，通過(guò)在腫瘤內(nèi)大量堆積對(duì)抗腫瘤細(xì)胞的凋亡，而RALA 參與調(diào)解SF 通過(guò)NF-κB 信號(hào)通路介導(dǎo)對(duì)腫瘤細(xì)胞保護(hù)和抗凋亡[20-21]。本實(shí)驗(yàn)將RALA-siRNA 轉(zhuǎn)染人前列腺癌DU145 細(xì)胞，結(jié)果顯示DU145 細(xì)胞增殖、遷移能力受抑制（P＜0.05），細(xì)胞凋亡明顯加?。≒＜0.05），細(xì)胞RALA 表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05），說(shuō)明沉默前列腺癌細(xì)胞中RALA 的表達(dá)能抑制其增殖、遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，沉默RALA 基因能抑制人前列腺癌細(xì)胞在體外的增殖及遷移，并能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與沉默RALA 后抑制其下游蛋白（例如RALBP1）的活化相關(guān)，提示RALA 可作為治療前列腺癌新的靶向基因。