薛正淳，孫強，孟祥龍，張健，張墨軒，衡雪源

1 濰坊醫(yī)學(xué)院研究生院，山東濰坊 261053；2 臨沂市人民醫(yī)院神經(jīng)外科；3 北京市神經(jīng)外科研究所 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院功能神經(jīng)外科研究室

膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤，約占顱內(nèi)惡性腫瘤的81%［1-3］。目前手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后放化療是腦膠質(zhì)瘤常用的治療方法［4］，但由于腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長迅速、侵襲性高、易復(fù)發(fā)或產(chǎn)生耐藥，治療效果仍不理想。研發(fā)新的治療策略是膠質(zhì)瘤治療相關(guān)研究的重點［5-6］。近年來分子靶向治療研究進(jìn)展迅速，許多與膠質(zhì)瘤診斷、治療和預(yù)后相關(guān)的基因被篩選出來。透明質(zhì)酸合成酶2（HAS2）定位于染色體8q24.13，是透明質(zhì)酸合成酶家族中的一員。透明質(zhì)酸連同其表面受體已被證實與惡性腫瘤進(jìn)展（如侵襲和轉(zhuǎn)移）有關(guān)［7-8］。多項研究表明，HAS2 與結(jié)直腸癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌的腫瘤分級和患者預(yù)后有關(guān)［9-11］。一項回顧性分析也顯示，HAS2 在浸潤性星形細(xì)胞膠質(zhì)瘤中高表達(dá)［12］。本研究觀察了腦膠質(zhì)瘤組織中HAS2 的表達(dá)變化，探討HAS2 表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013 年7 月—2020 年7 月在臨沂市人民醫(yī)院行腦膠質(zhì)瘤切除術(shù)患者的膠質(zhì)瘤標(biāo)本70 例納入病例組，患者男37 例、女33 例，年齡2 ～ 70 歲，WHO 分級1 ～ 2 級32 例、3 ～ 4 級38 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后病理證實為腦膠質(zhì)瘤；②患者具有手術(shù)指征，且自愿手術(shù)；③術(shù)前未進(jìn)行放化療、免疫治療等。排除患有其他惡性腫瘤或二次膠質(zhì)瘤手術(shù)的患者，病例資料缺失的患者，圍術(shù)期死亡者。另選同期行顱腦外傷減壓手術(shù)的腦外傷患者的正常腦組織10例納入對照組。對照組患者男6例、女4例，年齡16 ～ 72 歲。兩組患者一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。本研究獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 HAS2蛋白檢測

1.2.1 免疫組化法 標(biāo)本組織獲取后經(jīng)多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm 厚切片，烘片機70 ℃烘烤45 min；切片經(jīng)常規(guī)脫蠟水化，置于檸檬酸鹽修復(fù)液中進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻至室溫移至濕盒；加入內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑靜置15 min，PBS 沖洗3 次；滴加1∶100 稀釋的HAS2 抗體，孵育過夜后PBS 漂洗3 次；滴加反應(yīng)增強液室溫孵育20 min，PBS沖洗3次；滴加抗鼠/兔IgG 二抗，室溫孵育40 min；加入新鮮配置的二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液，流動水沖洗；蘇木素復(fù)染，脫水，透明，干燥，中性樹膠封片。顯微鏡下（200×）觀察，每個切片隨機選取10 個視野，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。根據(jù)HAS2 染色程度和陽性細(xì)胞百分比評估結(jié)果：染色程度為無染色、淡黃色、棕黃色、褐黃色分別計0、1、2、3分，HAS2陽性細(xì)胞百分比為0、＜25%、25% ～ ＜50%、≥50%分別計0、1、2、3 分，二項評分乘積1 ～ ≤4為HAS2低表達(dá)，＞4為HAS2高表達(dá)。

1.2.2 Western blotting 法 兩組組織在液氮作用下研磨，全蛋白提取試劑混勻后提取總蛋白，BCA蛋白定量；配置10%分離膠，4%濃縮膠上樣電泳，濃縮膠恒壓80 V，分離膠恒壓120 V，恒流280 mA轉(zhuǎn)膜70 min；將轉(zhuǎn)膜后的聚偏氟乙烯膜放入新鮮配置的牛奶中封閉2 h，后加入1∶1 000 稀釋的HAS2 抗體，放置4 ℃冰箱孵育過夜；次日PBST 洗膜3 次，加入抗兔酶標(biāo)記二抗，搖床孵育2 h，PBST 洗膜；吸取顯影液均勻滴于膜上進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，得到Western blotting條帶；用Image J軟件分析條帶，得到條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH 蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS26.0 軟件及Graph-Pad Prism9 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以-x±s表示，組間比較采用t檢驗。計數(shù)資料用百分比（%）及頻數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Logistic 回歸模型分析HAS2 表達(dá)的影響因素。采用Kaplan-Meier 曲線描述患者生存情況，生存期差異比較采用Log-Rank 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組HAS2 蛋白表達(dá)比較 免疫組化法檢測結(jié)果顯示，HAS2 主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，為淡黃色至黃褐色顆粒。見圖1。病例組HAS2 高表達(dá)38 例（54.2%，38/70），其中1 ～ 2 級、3 ～ 4 級腦膠質(zhì)瘤組織HAS2 高表達(dá)分別為11 例（34.4%，11/32）、37 例（71.1%，27/38）；對照組HAS2 高表達(dá)1 例（10%，1/10）。病例組HAS2高表達(dá)率高于對照組，且3 ～ 4級腦膠質(zhì)瘤組織中HAS2高表達(dá)率高于1 ～ 2級腦膠質(zhì)瘤組織（P均＜0.05）。Western blotting 檢測結(jié)果顯示，病例組、對照組HAS2 相對表達(dá)量分別為0.803 ± 0.286、0.243 ± 0.108，其中1 ～ 2 級、3 ～ 4 級腦膠質(zhì)瘤組織HAS2 相對表達(dá)量分別為0.355 ± 0.109、0.765 ± 0.081。病例組HAS2 相對表達(dá)量高于對照組，且3 ～ 4 級腦膠質(zhì)瘤組織中HAS2 相對表達(dá)量高于1 ～ 2級腦膠質(zhì)瘤組織（P均＜0.05）。

圖1 兩組HAS2表達(dá)情況（免疫組化法）

2.2 HAS2 表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系 WHO 分級3 ～ 4 級、突變型p53、Ki-67 高表達(dá)腦膠質(zhì)瘤組織中HAS2 高表達(dá)率分別高于1 ～ 2 級、野生型p53、Ki-67 低表達(dá)的腫瘤組織（P均＜0.05）。HAS2 表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤位置、O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）表達(dá)無相關(guān)性。見表1。將WHO 分級、Ki-67 表達(dá)、p53 分型、年齡、性別、腫瘤部位和MGMT 表達(dá)作為自變量，將HAS2 表達(dá)作為因變量，納入Logistic 回歸模型分析，結(jié)果顯示W(wǎng)HO 分級、Ki-67 表達(dá)與p53 分型是腦膠質(zhì)瘤患者HAS2表達(dá)的獨立影響因素（P均＜0.05）。見表2。

表1 HAS2與腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系［例（%）］

表2 HAS2表達(dá)影響因素的Logistic回歸分析結(jié)果

2.3 HAS2 表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者生存時間及預(yù)后的關(guān)系 隨訪至2020 年12 月，病例組70 例患者死亡37例、存活33例，存活率為47.1%。HAS2高表達(dá)患者的平均生存時間（33.6 個月）、總生存率（28.9%）低于HAS2 低表達(dá)患者（分別為43.5 個月、62.5%），P＜0.01。見圖2。

圖2 HAS2低表達(dá)與高表達(dá)患者預(yù)后比較

3 討論

原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的發(fā)病中位年齡約為60 歲，其中膠質(zhì)瘤約占26%［13］。盡管膠質(zhì)瘤有很多治療方案，包括手術(shù)治療、化療、放療和免疫治療，但膠質(zhì)瘤患者的生存率仍然很低。可能原因是腫瘤的異質(zhì)性和表觀遺傳學(xué)的復(fù)雜性使膠質(zhì)瘤的治療靶點難以確定，生理性血腦屏障的存在也限制了藥物的效果。此外，腫瘤的高浸潤性也使手術(shù)治療的效果有限?，F(xiàn)已明確腫瘤標(biāo)志物可作為膠質(zhì)瘤診斷和治療的分子依據(jù)［14］。

近年來與惡性腫瘤相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)成分備受關(guān)注。在細(xì)胞外基質(zhì)成分中，透明質(zhì)酸在腦組織的含量較其他組織豐富，且透明質(zhì)酸在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)較周圍正常腦實質(zhì)更為豐富，其高表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后密切相關(guān)。生理狀態(tài)下，透明質(zhì)酸由于其黏性和保水能力，對組織的平衡、生物力學(xué)和結(jié)構(gòu)的完整性有重要意義［15］。但在病理狀態(tài)下，透明質(zhì)酸在損傷部位表達(dá)更加豐富。在膠質(zhì)瘤中，透明質(zhì)酸一方面作為機械基質(zhì)為膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移提供環(huán)境基礎(chǔ)；另一方面，透明質(zhì)酸還作為一種信號成分，通過其同源受體（如CD44、透明質(zhì)酸移動受體、細(xì)胞黏附分子1等）為 膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲提供條件［16］。因此，探望為腦膠質(zhì)瘤的靶向治療研究提供新的方向。

本研究分別通過免疫組化法和Western blotting法檢測了腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中的HAS2，結(jié)果顯示，免疫組化檢測結(jié)果與Western blotting 檢測結(jié)果均顯示，病例組HAS2 表達(dá)高于對照組，且3 ～ 4 級腦膠質(zhì)瘤組織中HAS2 表達(dá)高于1 ～ 2 級腦膠質(zhì)瘤組織，提示HAS2 與腦膠質(zhì)瘤發(fā)病和惡性程度有關(guān)。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，WHO 分級3 ～ 4 級、突變型p53、Ki-67 高表達(dá)患者腦膠質(zhì)瘤組織中HAS2 高表達(dá)率分別高于1 ～ 2 級、野生型p53、Ki-67低表達(dá)的腫瘤組織；WHO 分級、Ki-67 表達(dá)與p53 分型是腦膠質(zhì)瘤患者HAS2 表達(dá)的獨立影響因素。我們還發(fā)現(xiàn)，野生型p53、Ki-67 低表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤患者生存率為61.5%，突變型p53、Ki-67高表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤患者生存率為36.0%，而突變型p53、Ki-67 高表達(dá)、HAS2 高表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤患者生存率為僅為28.5%，表明突變型p53、Ki-67 高表達(dá)和HAS2 高表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤惡性程度更高。上述結(jié)果進(jìn)一步提示，HAS2表達(dá)可能與腦膠質(zhì)瘤惡性程度有關(guān)。

有研究表明，HAS2 參與上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程［17］。EMT 表現(xiàn)為細(xì)胞極性、黏附性和緊密性喪失，導(dǎo)致細(xì)胞易從基底膜脫落，有助于向遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移。野生型p53 可通過幫助細(xì)胞保持上皮基因特征來抑制EMT，并且可以通過增強抑制EMT 的miRNA 表達(dá)來抑制EMT 核心轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。野生型p53缺失在乳腺癌細(xì)胞中會引發(fā)EMT［18］。另有研究表明，在乳腺癌細(xì)胞中上調(diào)HAS2 表達(dá)會導(dǎo)致間質(zhì)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白和波形蛋白表達(dá)增加，從而導(dǎo)致EMT［17］。Ki-67 作為腫瘤增殖相關(guān)因子，在G1中期到晚期出現(xiàn)，M 期達(dá)到峰值，其半衰期短，在細(xì)胞脫離增殖周期后迅速降解。除G0期外的細(xì)胞周期都可檢測到Ki-67，Ki-67與腫瘤的增殖、遷移和侵襲密切相關(guān)［19］。研究表明，Ki-67的促增殖作用可能與EMT 產(chǎn)生協(xié)同作用。肺癌相關(guān)研究顯示，Ki-67過表達(dá)者EMT 顯著增強，且患者預(yù)后更差［19］。本研究結(jié)果顯示，HAS2 高表達(dá)患者的平均生存時間、總生存率低于HAS2 低表達(dá)患者，提示HAS2 高表達(dá)者預(yù)后更差，HAS2 可能通過上述相關(guān)機制影響腦膠質(zhì)瘤的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，HAS2 在腦膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，HAS2 高表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤惡性程度有關(guān)，并影響患者預(yù)后。HAS2 有望作為腦膠質(zhì)瘤的潛在治療靶點。HAS2 在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的具體作用機制和相關(guān)通路仍需進(jìn)一步研究。