姚靜靜，譚軍

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三臨床學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003

缺血性腦卒中病情重、預(yù)后差，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［1］。早期開展靜脈溶栓或血管內(nèi)介入治療、恢復(fù)腦缺血部位血供是缺血性腦卒中首選的治療方法［2］。然而缺血再灌注可能引起腦損傷，導(dǎo)致更廣泛的神經(jīng)功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)是引發(fā)腦缺血再灌注損傷的關(guān)鍵因素［3-4］。腦缺血時(shí)，缺血核心區(qū)腦細(xì)胞急性死亡觸發(fā)炎癥因子過度表達(dá)和炎癥介質(zhì)釋放，大量炎癥細(xì)胞聚集在腦缺血半暗帶產(chǎn)生細(xì)胞毒性，導(dǎo)致血腦屏障功能破環(huán)，出現(xiàn)腦水腫，此時(shí)即便大血管恢復(fù)血供，缺血半暗帶區(qū)的微循環(huán)依然“無復(fù)流”，繼發(fā)性神經(jīng)元損傷不斷擴(kuò)大［4］。炎癥因子白細(xì)胞介素（IL）1β、IL-6及炎癥介質(zhì)環(huán)氧化酶2（COX-2）在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［5-6］。腺苷是天然存在的內(nèi)源性嘌呤核苷，有助于維持細(xì)胞和組織穩(wěn)態(tài)。通常情況下，腺苷在細(xì)胞外濃度極低，但在病理狀態(tài)（如癲癇、缺血、疼痛、炎癥和惡性腫瘤等）、代謝需求增加或缺氧的情況下，腺苷水平會(huì)顯著升高［7］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血前進(jìn)行腺苷預(yù)處理能夠通過抑制炎癥因子TNF-α、NF-κB 的表達(dá)［8］，減輕腦缺血再灌注損傷。2021 年10 月—2022年10月，本研究構(gòu)建大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型，通過觀察腺苷預(yù)處理的腦缺血再灌注大鼠腦損傷程度及IL-1β、IL-6、COX-2 表達(dá)變化，探討腺苷對(duì)腦組織的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要材料 雄性SPF級(jí)SD大鼠85只，體質(zhì)量250 ～ 300 g，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)于SPF 級(jí)環(huán)境中，自由飲食，室內(nèi)溫度控制在（23 ± 2）℃。腺苷購自北京索萊寶科技有限公司，TUNEL 染色試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，即用型免疫組化試劑盒購自福州市邁新生物技術(shù)開發(fā)公司，ELISA 試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。線栓的制備：將長(zhǎng)約5 cm、直徑0.26 mm 的尼龍線頂端燒燙為光滑圓球，用硅膠潤(rùn)滑脂包被頭端5 ～ 6 mm，距膨大端20 mm處用防水筆做記號(hào)，75%乙醇浸泡消毒后，置于肝素生理鹽水中備用。

1.2 模型制作與分組處理 將85 只大鼠隨機(jī)分為空白組10 只及假手術(shù)組、模型組、腺苷組各25 只。模型組、腺苷組采用線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型，參考KOIZUMI 等［9］的方法加以改良：用10%水合氯醛3 mL/kg 腹腔注射麻醉，將麻醉成功的大鼠消毒備皮后，頸正中切口切開，分離大鼠右頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）；結(jié)扎CCA 近心端及ECA，在ICA 近分叉處使用微動(dòng)脈血管夾將血管夾閉，在CCA 近分叉處留置一打好單結(jié)但不收緊的絲線；在CCA 的兩線間用眼科剪作“V”形微切口，插入膨大的線栓頭端，線栓沿CCA 經(jīng)ICA送入顱內(nèi)，當(dāng)頭端插入18 ～ 20 mm 遇到輕微阻力感時(shí)，停止進(jìn)線；收緊CCA 遠(yuǎn)心端的線結(jié)，消毒縫合切口，2 h 后，在大鼠麻醉狀態(tài)下將線栓輕輕向外拔出1.0 cm 左右。術(shù)中、術(shù)后注意維持大鼠體溫。腺苷組造模前連續(xù)3 d 腹腔注射1.5 mg/kg 的腺苷溶液2 mL，假手術(shù)組和模型組造模前連續(xù)3 d 腹腔注射生理鹽水2 mL。假手術(shù)組術(shù)中不插入線栓。空白組不予任何處理。將缺血性腦損傷癥狀典型（神經(jīng)功能缺損評(píng)分1 ～ 3 分）的大鼠納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)，將無腦損傷癥狀和神經(jīng)功能嚴(yán)重受損（評(píng)分為0、4分）的大鼠排除實(shí)驗(yàn)。因剔除大鼠致樣本量減少時(shí)，隨機(jī)選擇同一批次、同等條件下飼養(yǎng)的SD大鼠重新進(jìn)行模型制備，補(bǔ)足樣本量。假手術(shù)組、模型組及腺苷組分別于再灌注后6、12、24、48 h 各取5 只大鼠脫臼取腦；空白組不分時(shí)間點(diǎn)，隨機(jī)取5 只大鼠脫臼取腦。將大鼠腦組織沿冠狀面切開，將靠近額極的一半缺血半暗帶腦皮質(zhì)層（空白組、假手術(shù)組取同部位腦組織）用于ELISA 檢測(cè)；另一半腦組織置于4%多聚甲醛溶液中固定后，脫水，透明，石蠟包埋，從頂葉端沿冠狀面切成厚4 μm的組織切片，用于免疫組化檢測(cè)。各組剩余5只大鼠進(jìn)行腦組織TTC染色，計(jì)算腦梗死體積。

1.3 神經(jīng)功能缺損評(píng)價(jià) 于再灌注后24 h 進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。神經(jīng)功能正常計(jì)0 分，提尾時(shí)大鼠左前肢屈曲計(jì)1 分，大鼠于光滑平面上行走時(shí)左側(cè)轉(zhuǎn)圈計(jì)2 分，大鼠靜止?fàn)顟B(tài)下向左側(cè)傾斜計(jì)3 分，大鼠意識(shí)減退、肢體無自發(fā)活動(dòng)計(jì)4分。

1.4 腦梗死體積測(cè)算 各組于再灌注后24 h 各取5 只大鼠取腦，在全腦視交叉及其前后各2 mm 處作冠狀切4 刀，將腦標(biāo)本切成5 片，置于5 mL 含有2% TTC 的磷酸緩沖溶液中，37 ℃避光溫孵20 min。用數(shù)碼相機(jī)拍照，之后用眼科鑷分離缺血區(qū)（蒼白色）和非缺血區(qū)（紅色），采用Image pro plus6.0 軟件分析并計(jì)算腦梗死面積占比。腦梗死體積占比=缺血區(qū)體積/（缺血區(qū)體積+非缺血區(qū)體積）×100%。

1.5 腦細(xì)胞凋亡率測(cè)算 制備好的腦石蠟切片脫蠟水化后，滴加100 μL 的Proteinase K 工作液，37 ℃反應(yīng)30 min，浸入3% H2O2封閉液中室溫封閉10 min，每個(gè)樣本上滴加50 μL 的TdT 酶反應(yīng)液，37 ℃避光反應(yīng)60 min，DAPI 復(fù)染細(xì)胞核。激光共聚焦顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取3 個(gè)腦皮質(zhì)區(qū)缺血半暗帶在高倍鏡（400×）視野下拍照，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 病灶腦組織IL-1β、IL-6 檢測(cè) 將腦組織剪碎，按照1∶9 體質(zhì)量體積比加入PBS，冰上勻漿，4 ℃ 3 500 r/min 離心10 min，取上清進(jìn)行檢測(cè)。在酶標(biāo)板上每孔加入100 μL 的標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品，之后依次加入生物素化抗體工作液、洗滌液、酶結(jié)合物工作液、底物溶液、終止液，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)處的光密度值，計(jì)算樣本濃度。

1.7 病灶腦組織COX-2 檢測(cè) 將制好的石蠟切片脫蠟，水化，采用HE 染色，按照試劑盒說明書操作。使用相差顯微鏡在高倍鏡（400×）視野下隨機(jī)選取3個(gè)腦皮質(zhì)區(qū)缺血半暗帶視野拍照，計(jì)算COX-2 表達(dá)指數(shù)。COX-2 表達(dá)指數(shù)=COX-2 染色平均陽性細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)總細(xì)胞數(shù)×100%

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布、方差齊性的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析、兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量資料采用重復(fù)測(cè)量的方差分析；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（IQR）表示，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分比較 空白組、假手術(shù)組、模型組、腺苷組神經(jīng)功能缺損評(píng)分分別為0.0（0.0，0.0）、0.0（0.0，0.0）、3.0（2.0，3.0）、1.0（1.0，2.0）分，模型組、腺苷組神經(jīng)功能缺損評(píng)分高于空白組和假手術(shù)組，腺苷組神經(jīng)功能缺損評(píng)分低于模型組（P均＜0.05）。

2.2 各組大鼠腦梗死體積占比及腦細(xì)胞凋亡率比較 空白組及假手術(shù)組大鼠未出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙，腦TTC 染色未見梗死灶?？瞻捉M、假手術(shù)組、模型組、腺苷組腦梗死體積占比分別為0、0、44.68% ± 2.80%、29.71 ± 2.39%，腦細(xì)胞凋亡率分別為4.84% ± 1.87%、6.30% ± 1.48%、51.00% ± 4.70%、32.51% ± 4.86%。模型組、腺苷組大鼠腦梗死體積占比及腦細(xì)胞凋亡率高于空白組和假手術(shù)組，腺苷組腦梗死體積占比及腦細(xì)胞凋亡率低于模型組（P均＜0.05）。

2.3 各組大鼠腦組織IL-1β、IL-6 表達(dá)比較 模型組、腺苷組腦組織中IL-1β、IL-6 表達(dá)在再灌注6、12 h逐漸上升，于再灌注24 h時(shí)最高，48 h后開始下降。再灌注后12、24 h，假手術(shù)組大鼠腦組織IL-1β表達(dá)高于空白組（P均＜0.05）；模型組、腺苷組再灌注6、12、24、48 h腦組織中IL-1β、IL-6表達(dá)高于空白組和假手術(shù)組，腺苷組IL-1β、IL-6 表達(dá)低于模型組（P均＜0.05）。詳見表1、表2。

表1 各組大鼠再灌注后不同時(shí)點(diǎn)腦組織IL-1β表達(dá)比較（pg/mg，± s）

表1 各組大鼠再灌注后不同時(shí)點(diǎn)腦組織IL-1β表達(dá)比較（pg/mg，± s）

注：與空白組相比，aP＜0.05；與假手術(shù)組相比，bP＜0.01；與模型組相比，cP＜0.01。

組別腺苷組模型組假手術(shù)組空白組n 5 5 5 5 IL-1β 48 h 95.26 ± 3.49abc 123.46 ± 6.87ab 49.32 ± 4.71 44.94 ± 1.63 6 h 73.32 ± 2.69abc 87.44 ± 5.15ab 47.46 ± 3.26 44.94 ± 1.63 12 h 92.86 ± 4.50abc 108.34 ± 6.67ab 51.42 ± 4.23a 44.94 ± 1.63 24 h 103.54 ± 5.87abc 134.26 ± 6.48ab 51.52 ± 2.55a 44.94 ± 1.63

表2 各組大鼠再灌注后不同時(shí)點(diǎn)腦組織IL-6表達(dá)比較（pg/mg，± s）

表2 各組大鼠再灌注后不同時(shí)點(diǎn)腦組織IL-6表達(dá)比較（pg/mg，± s）

注：與空白組相比，aP＜0.05；與假手術(shù)組相比，bP＜0.01；與模型組相比，cP＜0.01。

組別腺苷組模型組假手術(shù)組空白組n 5 5 5 5 IL-6 48 h 85.15 ± 7.82abc 105.05 ± 5.21ab 30.03 ± 2.68 29.31 ± 2.62 6 h 37.76 ± 2.34abc 52.30 ± 4.16ab 31.06 ± 2.46 29.31 ± 2.62 12 h 64.03 ± 3.13abc 77.50 ± 3.01ab 30.12 ± 2.72 29.31 ± 2.62 24 h 102.51 ± 4.40abc 150.79 ± 7.26ab 32.52 ± 2.09 29.31 ± 2.62

2.4 各組大鼠腦組織中COX-2 表達(dá)比較 模型組、腺苷組腦組織中COX-2 表達(dá)在再灌注6、12 h 逐漸上升，于再灌注24 h 時(shí)最高。再灌注后24 h，假手術(shù)組腦組織COX-2 表達(dá)高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組、腺苷組再灌注后6、12、24、48 h 腦組織COX-2 表達(dá)均高于空白組和假手術(shù)組，腺苷組COX-2 表達(dá)低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠再灌注后不同時(shí)點(diǎn)腦組織COX-2表達(dá)比較（± s）

表3 各組大鼠再灌注后不同時(shí)點(diǎn)腦組織COX-2表達(dá)比較（± s）

注：與空白組相比，aP＜0.05；與假手術(shù)組相比，bP＜0.01；與模型組相比，cP＜0.01。

組別腺苷組模型組假手術(shù)組空白組n 5 5 5 5 COX-2 48 h 22.59 ± 2.40abc 37.55 ± 3.97ab 11.07 ± 1.45 7.76 ± 0.99 6 h 18.33 ± 2.09abc 29.56 ± 3.74ab 8.82 ± 1.36 7.76 ± 0.99 12 h 19.18 ± 2.75abc 32.90 ± 2.69ab 10.31 ± 1.79 7.76 ± 0.99 24 h 27.00 ± 1.44abc 37.60 ± 3.02ab 11.40 ± 2.11a 7.76 ± 0.99

3 討論

建立腦缺血再灌注動(dòng)物模型是研究腦缺血再灌注損傷病理生理機(jī)制和治療方案的重要方法。本研究中，模型組和腺苷組大鼠造模后出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能障礙，癥狀特點(diǎn)與臨床上觀察到的大腦中動(dòng)脈梗死患者相似。腦TTC 染色結(jié)果顯示，模型組及腺苷組大鼠右側(cè)大腦出現(xiàn)典型的染色缺失區(qū)，染色缺失區(qū)主要為大腦皮層及紋狀體區(qū)域，與大腦中動(dòng)脈支配區(qū)域相符。于大鼠腦缺血再灌注24 h 時(shí)進(jìn)行TUNEL 染色發(fā)現(xiàn)，模型組和腺苷組缺血半暗帶腦細(xì)胞凋亡率較假手術(shù)組增多，表明在缺血腦組織中，即便在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行再灌注，缺血半暗帶腦細(xì)胞仍然發(fā)生了不可逆轉(zhuǎn)的損害，腦細(xì)胞出現(xiàn)進(jìn)行性凋亡。

大腦預(yù)處理是指預(yù)先將大腦暴露于某些亞致死性刺激，誘發(fā)較短暫的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，以此來提高大腦對(duì)該因素的耐受性或適應(yīng)性［10］。在大腦預(yù)處理中，腺苷是內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)作用的重要介質(zhì)。GENG 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，電針預(yù)處理可通過激活腺苷A1受體，保護(hù)缺血再灌注損傷的神經(jīng)元。唐偉等［12］研究認(rèn)為，針刺預(yù)處理的腦保護(hù)作用機(jī)制與增強(qiáng)內(nèi)源性腺苷含量密切相關(guān)。本研究中，經(jīng)過腺苷預(yù)處理的大鼠在腦缺血再灌注24 h后精神狀態(tài)明顯好于模型組，腦梗死體積縮小，神經(jīng)細(xì)胞凋亡減少，神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低，再次驗(yàn)證了腺苷預(yù)處理能減輕腦缺血再灌注損傷。

在缺血腦組織重建血流可能會(huì)觸發(fā)一系列直接或間接的神經(jīng)元凋亡、血腦屏障破壞、腦水腫和出血性轉(zhuǎn)化等繼發(fā)性損傷，這與缺血腦組織內(nèi)大量促炎細(xì)胞因子釋放觸發(fā)的神經(jīng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)密切相關(guān)［13］。IL-1β和IL-6是最常見的促炎細(xì)胞因子，腦缺血時(shí)IL-1β、IL-6等促炎性細(xì)胞因子過度釋放在可加劇腦水腫，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞死亡，引發(fā)炎癥反應(yīng)［14］。在腦缺血損傷中，活化的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、白細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞大量表達(dá)IL-1β和IL-6，進(jìn)一步促使趨化因子和黏附分子表達(dá)增強(qiáng)，這使得更多炎癥細(xì)胞在缺血區(qū)毛細(xì)血管末端發(fā)生聚集、黏附，腦血流速度進(jìn)一步降低，加重腦水腫；募集的炎癥細(xì)胞還能合成繼發(fā)性損傷相關(guān)的細(xì)胞因子如白三烯、前列腺素等，導(dǎo)致毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能損傷，血腦屏障破壞［15-16］。本研究結(jié)果顯示，再灌注后12、24 h，假手術(shù)組大鼠腦組織IL-1β 表達(dá)高于空白組，而在術(shù)后48 h，假手術(shù)組IL-1β表達(dá)接近空白組，表明IL-1β為較為敏感的炎癥因子，暴露血管的手術(shù)操作引起大鼠體內(nèi)IL-1β 水平發(fā)生一定程度的變化，但在術(shù)后48 h 能基本恢復(fù)至正常水平。模型組、腺苷組再灌注6、12、24、48 h后腦組織中IL-1β、IL-6表達(dá)高于空白組和假手術(shù)組，腺苷組IL-1β、IL-6 表達(dá)低于模型組，進(jìn)一步表明IL-1β 與IL-6 參與了腦缺血再灌注損傷，腺苷預(yù)處理能在腦缺血再灌注損傷急性期發(fā)揮抗炎作用。我們還發(fā)現(xiàn)，模型組、腺苷組腦組織中IL-1β、IL-6 表達(dá)于再灌注6、12 h 逐漸上升，于再灌注24 h時(shí)最高，48 h后開始下降，這為進(jìn)一步研究抗炎治療時(shí)間窗提供了依據(jù)。

COX-2 在腦缺血時(shí)被大量誘導(dǎo)表達(dá)，是炎癥反應(yīng)的標(biāo)志，與神經(jīng)元凋亡及壞死密切相關(guān)［17］。在腦缺血缺氧時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞膜電位失衡，大量Ca2+內(nèi)流，激活降解神經(jīng)細(xì)胞膜磷脂的磷脂酶A2，大量的花生四烯酸（AA）由神經(jīng)細(xì)胞膜降解而來［18］。COX-2 是AA 經(jīng)酶促代謝中的關(guān)鍵酶，AA 在COX-2 的催化下分解出大量氧自由基、前列腺素和血栓素等［19］，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血管收縮，血小板活化，炎癥反應(yīng)進(jìn)展。方曉艷等［20］使用免疫組化染色法觀察大鼠腦組織中COX-2 陽性表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)COX-2 存在于大鼠缺血側(cè)腦額頂葉神經(jīng)元的胞質(zhì)中。本實(shí)驗(yàn)中，四組大鼠腦皮質(zhì)層中均出現(xiàn)COX-2 陽性細(xì)胞，COX-2 定位于細(xì)胞質(zhì)，與之前報(bào)道一致。假手術(shù)組再灌注后24 h 腦組織中COX-2 表達(dá)高于空白組，提示手術(shù)操作可能引起了一定程度的COX-2 表達(dá)增強(qiáng)，但在可控范圍內(nèi)。模型組COX-2 表達(dá)在缺血半暗帶腦皮質(zhì)區(qū)顯著增多，于再灌注24 h達(dá)到高峰，這與IL-1β、IL-6 表達(dá)升高時(shí)間相似，推測(cè)IL-1β、IL-6表達(dá)升高與COX-2 表達(dá)上調(diào)具有相互促進(jìn)作用，共同促進(jìn)炎癥反應(yīng)進(jìn)展。腺苷預(yù)處理后各時(shí)間點(diǎn)，大鼠腦組織COX-2 表達(dá)均低于模型組，提示腺苷預(yù)處理的腦保護(hù)作用也與降低腦內(nèi)COX-2表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，腺苷預(yù)處理能夠減輕腦缺血再灌注后大鼠腦損傷，腺苷可能通過調(diào)節(jié)IL-1β、IL-6、COX-2表達(dá)從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果為臨床應(yīng)用腺苷預(yù)處理防治腦缺血再灌注損傷提供了參考。