胡燕，鄭曉梅，張佳麗

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川瀘州 646000

腦出血是所有卒中類型中致殘率、病死率最高的一種［1］。神經(jīng)細胞凋亡和炎癥反應(yīng)是腦出血后繼發(fā)性腦損傷的重要病理過程，細胞凋亡可引起血腫周圍神經(jīng)元丟失，導(dǎo)致組織損傷和炎癥反應(yīng)加重［2］。因此，抗炎、抗凋亡治療對改善腦出血患者預(yù)后至關(guān)重要。血管緊張素Ⅳ（Ang Ⅳ）是血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）C 末端的六肽片段，通過結(jié)合其特異性血管緊張素受體4 來發(fā)揮作用［3-4］。相關(guān)研究表明，Ang Ⅳ及其類似物能在多種動物模型中發(fā)揮抗炎、抗凋亡作用［5-6］。Dihexa 是一種可口服的Ang Ⅳ類似物，具有半衰期較長、能透過血腦屏障、給藥方便的特點［7］。磷脂酰激醇-3-激酶（PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B（AKT）通路是體內(nèi)經(jīng)典的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)，在細胞生長、分化、自噬和凋亡中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［8-9］。2021 年6 月—2022 年9月，本研究觀察了Dihexa 對實驗性腦出血小鼠的神經(jīng)保護作用，并通過PI3K-AKT 通路蛋白表達變化探討相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要材料 6 ～ 8 周齡C57BL/6J小鼠110 只，體質(zhì)量20 ～ 25 g，購于湖北省實驗動物研究中心，許可證號SCXK（鄂）2020-0018。本研究通過西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物福利倫理審查。Dihexa購于源葉公司，PI3K 選擇性抑制劑wortmannin 購于MCE 公司，RIPA 總蛋白裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒、一抗稀釋液、二抗稀釋液均購自Aspen 公司，ELISA 試劑盒購于ELK Biotechnology 公司，普通光學(xué)顯微鏡購自O(shè)lympus公司。

1.2 動物分組處理及腦出血造模方法 以隨機數(shù)字表法將小鼠分為假手術(shù)組、模型組、藥物1 組、藥物2組、抑制劑組，每組22只。模型組、藥物1組、藥物2 組、抑制劑組小鼠采用膠原酶法制備腦出血模型［10］。造模前小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，禁食12 h，禁水4 h，常規(guī)稱重，用6%水合氯醛（0.7 mL/kg）腹腔注射麻醉小鼠，將其固定在腦立體定位儀上，頭部備皮，常規(guī)消毒，剪開皮膚；以前囟作為原點，向其前0.8 mm、右2.0 mm 處鉆一直徑為1 mm 小圓孔作為注射孔，將吸入膠原酶的微量注射器固定好；沿注射孔將針頭垂直、緩慢插入腦實質(zhì)，深度約3.5 mm；以0.5 μL/min 的速度注入膠原酶，注射完畢后停針10 min，緩慢向上拔針，每向上拔針1 mm停針5 min，直至全部拔出；最后用骨蠟封閉小孔，手術(shù)線縫合傷口，碘伏消毒。假手術(shù)組以生理鹽水代替膠原酶，其余操作與其他組一致。造模后進行Longa評分，1 ～ 3分視為造模成功。造模成功后，藥物1 組、藥物2 組分別以Dihexa 1.44、2.88 mg/（kg·d）灌胃；抑制劑組每次給藥前予wortmannin 0.5 mg/（kg·d）預(yù)處理90 min，再給予Dihexa 2.88 mg/（kg·d）灌胃；假手術(shù)組及模型組均給予等體積生理鹽水灌胃。共給藥3 d。

1.3 神經(jīng)功能評分及腦組織含水量測定 給藥3 d后根據(jù)改良Garcia評分評價各組大鼠神經(jīng)功能障礙程度，評分越低表示神經(jīng)功能障礙越嚴重。評分后處死小鼠，取腦組織。采用經(jīng)典干濕重法測量各組小鼠腦組織含水量。取腦后以電子天平稱濕重，置于100 ℃烤箱中，24 h 后測干重。腦組織含水量=（濕重-干重）／濕重×100%。

1.4 腦組織病理觀察 每組取4 只小鼠，常規(guī)稱重，過量麻醉，4%多聚甲醛灌注直至小鼠上半身僵硬，迅速斷頭取腦組織，脫水后甲醛固定，石蠟包埋，進行HE 染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織病理改變，使用Olympus cell Sens Standard 顯微鏡圖像軟件采集圖像。

1.5 腦組織炎癥因子檢測 取各組腦組織制成勻漿，按照ELISA試劑盒說明書操作，測定腦組織中的腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）。

1.6 腦組織神經(jīng)細胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白檢測TUNEL 染色觀察神經(jīng)細胞凋亡情況：取各組腦組織冰凍切片，采用0.3% Triton-X100 打孔，室溫封閉1 h，PBS 清洗3 次；滴加一抗過夜，滴加TUNEL 反應(yīng)液及熒光二抗混合液，37 ℃濕盒內(nèi)避光孵育2 h，PBS 清洗3 次；滴加DAPI 染色液，封片，熒光顯微鏡下觀察；每張切片隨機取5個視野，計數(shù)橫斷面中的TUNEL 陽性細胞。Western blotting 法檢測腦組織中的凋亡相關(guān)蛋白：取各組腦組織，加入蛋白裂解液，用組織勻漿儀勻漿，離心后取上清液，以BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度；制膠、上樣、轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入一抗過夜，TBST清洗3次，加入二抗，室溫下孵育，TBST清洗4次；滴加ECL 混合液，顯色、曝光、顯影、定影，保存膠片；以AlphaEaseFC 軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH 灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

1.7 腦組織中P13K/AKT 通路相關(guān)蛋白檢測 采用Western blotting 法檢測腦組織中的PI3K/AKT 通路蛋白，計算p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT，具體方法參考“1.6”。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，進行方差齊性檢驗，方差齊則多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠神經(jīng)功能評分及腦組織含水量比較 與假手術(shù)組相比，模型組、藥物1 組、藥物2 組、抑制劑組神經(jīng)功能評分降低，腦組織含水量升高（P均＜0.05）；模型組、藥物1 組、藥物2 組神經(jīng)功能評分依次增高，腦組織含水量依次降低（P均＜0.05）；抑制劑組小鼠神經(jīng)功能評分低于藥物2組，腦組織含水量高于藥物2組（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠神經(jīng)功能評分及腦組織含水量比較（± s）

表1 各組小鼠神經(jīng)功能評分及腦組織含水量比較（± s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05；與藥物1組相比，△P＜0.05；與藥物2組相比，&P＜0.05。

腦組織含水量（%）80.54 ± 0.41*#78.70 ± 0.36*#△81.78 ± 0.34*&82.12 ± 0.29*75.98 ± 0.62組別藥物1組藥物2組抑制劑組模型組假手術(shù)組n 22 22 22 22 22神經(jīng)功能評分（分）12.45 ± 0.86*#14.13 ± 1.21*#△10.77 ± 1.19*&9.68 ± 0.84*17.36 ± 0.72

2.2 各組小鼠腦組織病理改變比較 各組小鼠腦組織HE 染色結(jié)果見圖1。假手術(shù)組未見出血灶，細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰、排列整齊。模型組可見大量紅細胞，組織排列紊亂，細胞核固縮、溶解，細胞間隙增大，水腫明顯。與模型組相比，藥物2組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)致密，排列整齊，紅細胞減少，炎癥細胞聚集，細胞核固縮、溶解明顯改善。藥物1 組改變介于模型組和藥物2 組之間。與藥物2 組相比，抑制劑組腦組織病理損傷更嚴重，鏡下見大量紅細胞，組織排列紊亂，與模型組相比未見明顯改善。

圖1 各組小鼠腦組織病理改變（HE染色）

2.3 各組小鼠腦組織炎癥因子表達比較 與假手術(shù)組相比，模型組、藥物1 組、藥物2 組、抑制劑組小鼠腦組織TNF-α、IL-1β 表達升高（P均＜0.05）。模型組、藥物1 組、藥物2 組TNF-α、IL-1β 表達依次降低（P均＜0.05）。抑制劑組TNF-α、IL-1β 表達低于藥物2組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠腦組織TNF-α、IL-1β表達比較（pg/mL，± s）

表2 各組小鼠腦組織TNF-α、IL-1β表達比較（pg/mL，± s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05；與藥物1組相比，△P＜0.05；與藥物2組相比，&P＜0.05。

IL-1β 290.67 ± 19.28*#225.92 ± 21.02*#△471.28 ± 44.03*△&530.62 ± 59.71*130.41 ± 16.32組別藥物1組藥物2組抑制劑組模型組假手術(shù)組n 22 22 22 22 22 TNF-α 306.10 ± 21.59*#235.66 ± 26.06*#△375.90 ± 43.72*△&394.17 ± 51.50*107.54 ± 13.65

2.4 各組小鼠腦組織細胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達比較 各組小鼠神經(jīng)細胞TUNEL 染色結(jié)果見OSID 碼圖1。假手術(shù)組、模型組、藥物1 組、藥物2 組、抑制劑組小鼠腦組織神經(jīng)細胞凋亡率分別為1.96% ± 0.26%、40.28% ± 2.76%、19.00% ± 2.25%、8.17% ± 1.12%、28.34% ± 4.52%。凋亡相關(guān)蛋白表達比較見表3。與假手術(shù)組相比，模型組、藥物1 組、藥物2 組、抑制劑組神經(jīng)細胞凋亡率和cleaved-Capase3 表達增高，Bcl-2 蛋白表達降低（P均＜0.05）。模型組、藥物1 組、藥物2 組神經(jīng)細胞凋亡率及cleaved-Capase3 表達依次降低，Bcl-2 蛋白表達依次增高（P均＜0.05）。抑制劑組凋亡率及cleaved-Capase3表達高于藥物2組，Bcl-2蛋白表達低于藥物2組（P均＜0.05）。

2.5 各組小鼠腦組織PI3K-AKT 通路相關(guān)蛋白表達比較 與假手術(shù)組比較，模型組、藥物1組、藥物2組、抑制劑組小鼠腦組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 下降（P均＜0.05）。模型組、藥物1組、藥物2組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 依次增高（P均＜0.05）。抑制劑組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 低于藥物2 組（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠腦組織凋亡相關(guān)蛋白及PI3K-AKT通路相關(guān)蛋白表達比較（± s）

表3 各組小鼠腦組織凋亡相關(guān)蛋白及PI3K-AKT通路相關(guān)蛋白表達比較（± s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05；與藥物1組相比，△P＜0.05；與藥物2組相比，&P＜0.05。

組別藥物1組藥物2組抑制劑組模型組假手術(shù)組P-AKT/AKT 0.91 ± 0.22*#1.92 ± 0.25*#△0.19 ± 0.04*△&0.10 ± 0.37*2.18 ± 0.39 n 22 22 22 22 22 cleaved-Caspase3 0.44 ± 0.05*#0.17 ± 0.03*#△0.64 ± 0.07*△&0.77 ± 0.09*0.11 ± 0.02 Bcl-2 0.34 ± 0.06*#0.54 ± 0.08*#△0.12 ± 0.35*△&0.08 ± 0.01*0.79 ± 0.09 P-PI3K/PI3K 0.24 ± 0.59*#0.44 ± 0.86*#△0.06 ± 0.01*△&0.05 ± 0.22*0.79 ± 0.10

3 討論

腦出血尚無特效治療手段，在臨床上即使進行血腫清除術(shù)，大多數(shù)患者預(yù)后也無法得到明顯改善［10］。腎素—血管緊張素系統(tǒng)是重要的酶—神經(jīng)肽系統(tǒng)之一。Ang Ⅳ是由是Ang Ⅱ經(jīng)過兩次蛋白水解而來的六肽片段，在機體內(nèi)廣泛分布，被認為與神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病密切相關(guān)，可能成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病潛在的治療靶點［3，11-12］。

腦出血后紅細胞及其產(chǎn)物被釋放到腦組織中，可迅速激活炎癥通路，引起炎癥細胞募集和激活，TNF-α、IL-1β等炎癥因子釋放，TNF-α、IL-1β可通過觸發(fā)黏附分子、趨化因子釋放等破壞血腦屏障完整性，加重腦組織水腫，誘導(dǎo)細胞凋亡［13-14］。在本實驗中，模型組小鼠神經(jīng)功能評分顯著降低，腦組織含水量增加，HE 染色顯示神經(jīng)細胞核固縮溶解，間隙明顯水腫，在血腫周圍腦組織中檢測到TNF-α、IL-1β明顯升高，表明炎癥反應(yīng)參與了腦出血后的病理損傷過程。相關(guān)研究表明，在心肌梗死模型中，Ang Ⅳ可以抑制炎癥反應(yīng)，減少心肌細胞凋亡，延緩心肌梗死后的心室重塑［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，Ang Ⅳ類似物Dihexa 可以劑量依賴性減輕腦組織炎癥反應(yīng)，降低炎癥因子TNF-α、IL-1β 在血腫周圍組織的表達，具有較好的抗炎效應(yīng)。

血腫周圍神經(jīng)元凋亡是早期腦損傷的機制之一，腦出血后活性氧、興奮性氨基酸大量釋放、Ca2+內(nèi)流增加，引起線粒體膜功能障礙，細胞色素C從膜間隙丟失，與凋亡蛋白酶活化因子1結(jié)合，促進凋亡小體形成，激活下游Caspase 信號通路，引起神經(jīng)細胞凋亡增加［16-18］。細胞凋亡又會使外周巨噬細胞、中性粒細胞等向血腫周圍浸潤，進一步加重組織炎癥損傷［19］。本實驗中，模型組小鼠神經(jīng)細胞凋亡率升高，促凋亡蛋白cleaved-Caspase3 表達上調(diào)而抗凋亡蛋白Bcl-2 表達下降，不同劑量的Dihexa 作用后，神經(jīng)細胞凋亡減少，促凋亡蛋白表達降低而抗凋亡蛋白表達增加，提示凋亡相關(guān)蛋白表達失衡導(dǎo)致神經(jīng)細胞凋亡增加可能是腦組織損傷的重要原因，Dihexa可以調(diào)節(jié)凋亡蛋白表達，抑制神經(jīng)細胞凋亡。

PI3K-AKT通路是機體內(nèi)經(jīng)典的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細胞生長、分化、自噬和凋亡中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，其生物學(xué)效應(yīng)可能是通過增加抗凋亡蛋白Bcl-2活性、抑制促凋亡蛋白Caspase 家族激活、激活NF-κB、促進細胞增殖、調(diào)節(jié)線粒體釋放細胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子等實現(xiàn)的［20-22］。在腦出血動物模型中，PI3K-AKT 通路蛋白磷酸化水平明顯下降，神經(jīng)細胞凋亡增加，提示調(diào)節(jié)該通路蛋白表達可能對抑制腦出血早期細胞凋亡有積極作用［23］。本實驗中，模型組小鼠血腫周圍神經(jīng)細胞凋亡率升高，腦組織p-PI3K、p-AKT 表達下降，也表明PI3K-AKT 通路參與了繼發(fā)性損傷過程。大量研究證實，在腦出血早期，許多藥物可以通過上調(diào)PI3K-AKT 通路蛋白的磷酸化水平從而減輕神經(jīng)功能損傷，減少細胞凋亡，而PI3K 的選擇性抑制劑wortmannin、LY294002等可以阻斷藥物的抗炎、抗凋亡效應(yīng)［24-25］。研究表明，在阿爾茨海默病模型小鼠中，Dihexa 可通過上調(diào)腦組織中PI3K-AKT 通路蛋白磷酸化水平從而改善認知功能；而且，Dihexa 可降低小膠質(zhì)細胞標志物Iba-1表達，提示其可能對小膠質(zhì)細胞的分化也具有調(diào)控作用［7］。本研究也發(fā)現(xiàn)，Dihexa 作用后，PI3K-AKT通路蛋白磷酸化水平增高，而PI3K 特異性抑制劑wortmannin 能夠逆轉(zhuǎn)高劑量Dihexa 的抗炎、抗凋亡作用，提示Dihexa 對腦出血小鼠的治療作用可能與激活PI3K-AKT 通路、影響其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。本研究并未深入探討Dihexa 在腦出血后是否能通過影響小膠質(zhì)細胞分化極性從而調(diào)節(jié)炎癥因子水平，有待未來進一步探索。

綜上所述，Ang Ⅳ類似物Dihexa 可以劑量依賴性減輕腦出血小鼠神經(jīng)細胞凋亡和炎癥反應(yīng)，保護神經(jīng)功能，其作用機制可能與調(diào)控PI3K-AKT 通路有關(guān)。上述研究結(jié)果有望為腦出血后繼發(fā)性損傷的治療提供新的思路。