黃麗丹，李冰玉，李亞男，王蘇，龔平，2

1 武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科，武漢 430060；2 武漢大學(xué)口腔醫(yī)院麻醉科 口腔基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地和口腔生物醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

缺血性腦卒中是我國(guó)最常見的卒中類型，具有高發(fā)病率、高致殘率、高病死率的特點(diǎn)［1-3］。近年來(lái)我國(guó)缺血性腦卒中患者數(shù)量持續(xù)增加且呈現(xiàn)發(fā)病年輕化趨勢(shì)，給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的壓力［4-5］。尋求安全有效的治療方案是缺血性腦卒中相關(guān)研究的重點(diǎn)。早期靜脈溶栓或機(jī)械取栓、及時(shí)恢復(fù)腦血流是目前治療缺血性腦卒中的首選方案，但在腦組織恢復(fù)血供后常會(huì)出現(xiàn)損傷進(jìn)一步加重的現(xiàn)象，即腦缺血再灌注損傷（CIRI）［6-7］。再灌注損傷是十分復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，涉及多種因素與機(jī)制［8］。新近研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀GMP-AMP 合酶（cGAS）天然免疫信號(hào)通路參與再灌注損傷的激活，同時(shí)有研究表明cGAS介導(dǎo)的天然免疫通路與細(xì)胞自噬密切相關(guān)［9-11］。對(duì)于cGAS 天然免疫信號(hào)通路是否能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬進(jìn)而參與腦缺血再灌注損傷，以及抑制cGAS 激活對(duì)缺血再灌注損傷的干預(yù)作用，目前尚不明確。2021 年9 月—2022 年6 月，本研究觀察了cGAS 抑制劑RU. 521 對(duì)小鼠CIRI 的干預(yù)作用，并基于自噬相關(guān)蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)探討相關(guān)機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要材料 健康雄性C57BL/6 小鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、實(shí)驗(yàn)組，每組6 只。cGAS 抑制劑RU. 521 購(gòu)自美國(guó)MedChemexpress 公司，HE 染色試劑和Nissl 染色試劑購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司，cGAS抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，LC3B 購(gòu)自美國(guó)CST 公司，Beclin-1 購(gòu)自武漢愛博泰克生物科技有限公司，TUNEL試劑盒購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 模型制作及cGAS 抑制劑用法 模型組、實(shí)驗(yàn)組采用線栓法制備大腦中動(dòng)脈栓塞模型。參照課題組前期研究［12］中的方法，小鼠室溫下稱重麻醉后仰臥位固定，剪除術(shù)野毛發(fā)，碘伏消毒皮膚，頸部正中切口，顯微鏡下鈍性分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，避免損傷迷走神經(jīng)，分別結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端和頸外動(dòng)脈起始處，在頸總動(dòng)脈上系一活結(jié)，隨后在頸總動(dòng)脈上剪一小缺口，將線栓沿頸總動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈，自頸總動(dòng)脈分叉處進(jìn)線9 ～ 10 mm。缺血1 h 后將線栓取出進(jìn)行再灌注。假手術(shù)組分離大腦中動(dòng)脈但不阻斷。實(shí)驗(yàn)組于再灌注前10 min腹腔注射5 mg/kg的cGAS抑制劑RU.521。

1.3 腦組織損傷情況評(píng)估 于再灌注6 h后處死小鼠，分離顱骨取出腦組織，石蠟包埋后制備切片。部分切片依次使用二甲苯、梯度乙醇脫蠟水化，蘇木素染色并沖洗，1%鹽酸乙醇分色，0.6%氨水處理，HE染色觀察胞核和胞質(zhì)染色情況；部分切片于載玻片上攤平，置于烤片機(jī)烤片，依次使用氯仿、梯度乙醇浸片。蒸餾水洗滌后室溫下焦油紫進(jìn)行Nissl 染色觀察尼氏體。

1.4 腦組織細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 取適量腦組織用多聚甲醛固定，制備石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，水浴鍋加熱0.01 mol/L 檸檬酸鈉緩沖液至95 ℃，放入切片加熱，待緩沖液冷卻后用PBS 清洗，滴加一抗黑暗處孵育過(guò)夜；次日37 ℃復(fù)溫，PBS 清洗，滴加二抗，室溫避光孵育后加入DAPI，黑暗中繼續(xù)孵育；采用抗熒光猝滅密封試劑進(jìn)行密封；顯微鏡下拍照，觀察并計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)，以凋亡細(xì)胞數(shù)除細(xì)胞總數(shù)計(jì)算凋亡率。

1.5 腦組織中cGAS、LC3B、Beclin-1 蛋白檢測(cè) 取適量組織加入RIPA后冰上裂解、離心、提取總蛋白，計(jì)算各樣品蛋白濃度。根據(jù)蛋白分子大小制備分離膠及濃縮膠，上樣后以90 V 電泳至Marker 分出條帶，轉(zhuǎn)至120 V 直至溴酚藍(lán)跑至分離膠底部終止電泳。將PVDF 膜置入轉(zhuǎn)移槽，加入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)液，根據(jù)蛋白分子大小設(shè)定轉(zhuǎn)移時(shí)間進(jìn)行電轉(zhuǎn)。加入cGAS（1∶500）、LC3B（1∶1 000）、Beclin-1（1∶500）一抗4 ℃搖床孵育過(guò)夜。次日TBST 洗滌后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育，ECL顯影，掃描后分析蛋白條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graph Pad Prism9.0 軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Turkey 檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腦組織損傷情況比較 假手術(shù)組細(xì)胞未見病理改變；與假手術(shù)組相比，模型組病理學(xué)形態(tài)異常，主要表現(xiàn)為神經(jīng)元形態(tài)不規(guī)則，固縮或消失，尼氏小體稀少或消失；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元形態(tài)相對(duì)規(guī)則，大部分細(xì)胞膜較完整，胞核較清晰，尼氏小體數(shù)量較多。見圖1。

圖1 各組小鼠腦組織病理變化

2.2 各組小鼠腦組織細(xì)胞凋亡率比較 模型組小鼠腦組織細(xì)胞凋亡率高于假手術(shù)組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率低于模型組（P均＜0.05）。見表1。

2.3 各組小鼠腦組織中cGAS、LC3B、Beclin-1 蛋白表達(dá)比較 模型組小鼠腦組織中cGAS、LC3B、Beclin-1蛋白表達(dá)高于假手術(shù)組，實(shí)驗(yàn)組cGAS、LC3B、Beclin-1蛋白表達(dá)低于模型組（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠腦組織細(xì)胞凋亡率及cGAS、LC3B、Beclin-1蛋白表達(dá)比較（± s）

表1 各組小鼠腦組織細(xì)胞凋亡率及cGAS、LC3B、Beclin-1蛋白表達(dá)比較（± s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組實(shí)驗(yàn)組Beclin-1 1.000 ± 0.119 2.601 ± 0.170*1.615 ± 0.169#n 6 6 6凋亡率（%）5.1 ± 1.4 29.2 ± 1.6*14.1 ± 2.2#cGAS 1.000 ± 0.078 2.423 ± 0.259*1.827 ± 0.244#LC3B 1.000 ± 0.134 2.239 ± 0.148*1.472 ± 0.138#

3 討論

缺血性腦卒中是我國(guó)人口致死、致殘的主要因素，給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［13-14］。目前缺血性腦卒中的治療手段以溶栓或取栓為主，有助于恢復(fù)腦組織的有效灌注，但治療后常會(huì)出現(xiàn)更嚴(yán)重的并發(fā)癥即CIRI［15］。CIRI 是十分復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞自噬、興奮性毒性、鈣超載、線粒體功能受損等多種機(jī)制，而這些因素彼此關(guān)聯(lián)、相互作用，最終導(dǎo)致缺血區(qū)神經(jīng)元的壞死和功能障礙［16-17］。因此，積極尋求減輕CIRI 的方案已成為臨床關(guān)注的熱點(diǎn)。

cGAS通路作為經(jīng)典的天然免疫信號(hào)通路，可通過(guò)識(shí)別病原相關(guān)分子模式從而抵御病原體入侵，亦可利用損傷相關(guān)分子模式對(duì)機(jī)體進(jìn)行監(jiān)控，是機(jī)體抵御病原體入侵的關(guān)鍵性自我監(jiān)控防御系統(tǒng)［18-19］。近期cGAS 通路在非免疫生理過(guò)程中的作用亦受到重視。研究發(fā)現(xiàn)，cGAS 通路可參與DNA 損傷修復(fù)過(guò)程，并通過(guò)介導(dǎo)核因子κB和絲裂原活化蛋白激酶等內(nèi)源性通路激活參與機(jī)體穩(wěn)態(tài)的調(diào)控［20-21］。新近研究發(fā)現(xiàn)，激活cGAS 通路不僅能產(chǎn)生強(qiáng)大的天然免疫反應(yīng)，還可調(diào)控多種形式的細(xì)胞死亡和應(yīng)激反應(yīng)［22］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，cGAS通路在再灌注初期功能顯著上調(diào)［23］。因此，若能在再灌注早期進(jìn)行及時(shí)干預(yù)則有望減輕腦損傷，對(duì)臨床防治CIRI 產(chǎn)生重要價(jià)值。

研究表明，cGAS通路激活與自噬依賴的細(xì)胞死亡有關(guān)［24］。端粒損傷可促進(jìn)DNA 片段釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致過(guò)度自噬的發(fā)生，表現(xiàn)為自噬相關(guān)蛋白LC3 表達(dá)上調(diào)和p62 表達(dá)下調(diào)，抑制自噬或cGAS通路則可明顯改善細(xì)胞的狀態(tài)［25-26］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，cGAS 共有5 個(gè)LC3 相互作用區(qū)域［27］，同時(shí)cGAS還可與自噬相關(guān)蛋白Beclin-1 相互作用，釋放自噬負(fù)調(diào)控因子，負(fù)反饋調(diào)節(jié)自噬過(guò)程［28］。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組腦組織中cGAS 表達(dá)升高，同時(shí)伴隨著神經(jīng)元形態(tài)不規(guī)則、細(xì)胞固縮、尼氏小體溶解或消失等現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡率亦呈升高趨勢(shì)，提示CIRI 過(guò)程中cGAS 升高可導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷。

自噬可通過(guò)自我消化和循環(huán)利用細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器及錯(cuò)誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)等，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和正常功能［29-30］。自噬通常被認(rèn)為是一種促生存的機(jī)制，但亦有研究認(rèn)為自噬是一種Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡方式［31］。研究表明，適度自噬可發(fā)揮保護(hù)性作用，而過(guò)度自噬則可能成為細(xì)胞死亡的驅(qū)動(dòng)因素。如在機(jī)體處于氧化應(yīng)激、再灌注損傷等病理狀態(tài)下，自噬激活可通過(guò)加速受損細(xì)胞器的更新和動(dòng)員細(xì)胞內(nèi)能量?jī)?chǔ)存從而維持代謝平衡，但再灌注后過(guò)度激活的自噬又會(huì)導(dǎo)致正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損進(jìn)而引起程序性細(xì)胞死亡［32-33］。自噬相關(guān)蛋白LC3B、Beclin-1 對(duì)自噬的進(jìn)展具有決定性作用，二者表達(dá)升高可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本研究結(jié)果顯示，模型組腦組織中LC3B、Beclin-1表達(dá)高于假手術(shù)組，細(xì)胞凋亡率高于假手術(shù)組，與相關(guān)研究結(jié)果一致［34-35］。

本研究模型組和假手術(shù)組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，激活cGAS 通路可通過(guò)增強(qiáng)自噬導(dǎo)致腦損傷。已有研究表明，cGAS 抑制劑RU.521 可透過(guò)血腦屏障發(fā)揮抑制cGAS 的作用。用5 mg/kg 的RU.521 對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射可獲得穩(wěn)定的抑制效果［36-38］。本研究采用cGAS 選擇性抑制劑RU.521 對(duì)小鼠腹腔注射，發(fā)現(xiàn)病灶腦組織中自噬相關(guān)蛋白LC3B、Beclin-1 表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡率下降，同時(shí)神經(jīng)元形態(tài)相對(duì)規(guī)則，大部分包膜較完整，胞核較清晰，尼氏小體數(shù)量較多，表明抑制cGAS 通路后自噬下調(diào)，進(jìn)而細(xì)胞凋亡減少。

綜上所述，小鼠CIRI 狀態(tài)下cGAS 天然免疫通路功能上調(diào)，可促進(jìn)細(xì)胞自噬激活，增加細(xì)胞凋亡進(jìn)而加重腦損傷；cGAS抑制劑預(yù)處理可減輕小鼠腦缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)自噬有關(guān)。