郭玉娟 裴新 鄭小明 金冰 楊嫄嫄 查鑫華 張曉東 季宇

自1986年第一個生物治療藥物上市以來,生物制藥行業(yè)的生產工藝一直在快速發(fā)展［1］。到2023年,全球市場規(guī)模預計將達到2850億美元。目前,細胞培養(yǎng)工藝仍以分批補料(Fed-batch)工藝為主,原因為Fed-batch工藝相對簡單和相對簡單的可放大性。通過細胞系工程、培養(yǎng)基開發(fā)和工藝控制改進,實現了更高的比生產率、較高的活細胞密度(viable cell density,VCD)、延長培養(yǎng)時間,已將表達量從每升幾十毫克提高到＞3 g/L,成本大幅降低［2］。

單克隆抗體(monoclonal antibodies,mAb)的生產成本仍然遠高于小分子,并且需要增加產量來滿足市場需求。因此,降低mAb 生產成本、減少供應短缺、提高生產力和產量是生物制造行業(yè)面臨的最重要挑戰(zhàn)［3］。強化工藝(process intensification,PI)是上游工藝中倍受關注的新技術。強化工藝是連續(xù)進行培養(yǎng)基置換,使用截留設備將細胞保留在生物反應器中,使細胞維持穩(wěn)定的狀態(tài)。強化工藝能達到較高的細胞密度及蛋白產量。本文將討論強化工藝在生物制藥上游工藝開發(fā)中的應用,包括N-1種子培養(yǎng)步驟以及N生產培養(yǎng)步驟。

1 強化工藝概述

強化工藝采用創(chuàng)新技術和方法來實現工藝改進,從而顯著降低制造成本。在生物制藥上游工藝方面,傳統(tǒng)的上游工藝開發(fā)路線包括從最早的種子復蘇、搖瓶擴增、種子罐擴增到生產罐。因此,整個路線可以分為種子階段和生產階段。強化工藝可應用于N-1種子培養(yǎng)階段以及N生產培養(yǎng)階段。前者可以實現高密度種子培養(yǎng),后者可以進行Perfusion、高密度接種培養(yǎng)、濃縮補料批培養(yǎng)(concentrated Fed-batch,CFB)等。

2 N-1種子階段

2.1 N-1 Perfusion N-1 Perfusion指在N-1種子生物反應器培養(yǎng)階段使用細胞截留裝置將細胞截留在反應器內,同時進行培養(yǎng)基置換,使細胞維持在營養(yǎng)成分充足且較少代謝廢棄物的健康環(huán)境中,從而在短時間內(通常5～7 d)達到較高密度［(20～100)×106cells/ml］,同時維持較高活率［4］。傳統(tǒng)Fed-batch接種密度通常在(0.4～2.0)×106cells/ml左右,由于接種密度較低,培養(yǎng)前期主要是細胞生長階段,這種非生產性生長階段延長細胞培養(yǎng)運行時間,降低生產率［5］。Padawer等［6］通過高密度接種(8.0×106cells/ml),培養(yǎng)8 d即可達到與低密度(0.5×106cells/ml)接種培養(yǎng)14 d相同的蛋白產量。此外,由于N-1灌流種子培養(yǎng)細胞密度較高,1個N-1種子反應器可同時接種至多個N階段傳統(tǒng)低密度Fed-batch培養(yǎng),從而減小N-1階段設備規(guī)模［7］?；谝陨蟽?yōu)勢,N-1 Perfusion強化工藝被越來越廣泛應用［8］。

2.2 N-1高密度細胞庫 高密度細胞庫也是近年來新發(fā)展的一個強化工藝技術。傳統(tǒng)的種子擴增流程通常是在幾個連續(xù)的批培養(yǎng)中進行的,包括在搖瓶或搖管中經過幾次細胞擴增培養(yǎng),每個擴增步驟通常需要3 d左右的時間,然后再接種到種子生物反應器中。這個過程通常需要3周的時間,需要耗費很多人力和時間成本,增加污染的風險。

高密度細胞庫的建立可以克服這些不足。高密度細胞庫的運用通常與N-1 Perfusion相結合,種子培養(yǎng)以Perfusion模式擴增。結合WAVE生物反應器培養(yǎng)和Perfusion培養(yǎng)這兩種細胞培養(yǎng)技術,可以縮短細胞從凍存管到N-1生物反應器的整個種子擴增的過程。在減少操作時間的同時可以實現更短的種子擴增時間和更高的細胞密度。高密度細胞庫每支體積含4.5 ml［9］,細胞密度一般為(50～100)×106cells/ml。高密度細胞庫可以直接接種到生物反應器中,省去了中間種子擴增步驟。見圖1。Tao等［10］的研究中,使用高密度細胞庫(45×107cells/瓶)直接接種到20 L的WAVE袋中,結果顯示,使用高密度細胞庫可以省去搖瓶擴增步驟,工時可以減少9 d。高密度細胞庫是強化種子擴增步驟的一個簡單高效的途徑,可以在不影響生物工藝性能的情況下提高細胞培養(yǎng)工藝的效率。

圖1 傳統(tǒng)擴增工藝與強化過程

3 N階段

3.1 灌流工藝 N階段Perfusion是將反應器中培養(yǎng)基不斷置換,移除代謝副產物同時補充新的營養(yǎng)物質,細胞被截留在反應器中。此外,根據培養(yǎng)需求定量排出細胞,維持穩(wěn)定的生長環(huán)境。Perfusion可以達到比Fed-batch更高的細胞密度,具有單位體積產量高、占地面積小等優(yōu)勢。灌流工藝已成功運用于表達產物不穩(wěn)定和表達量較低產品的生產。

與Fed-batch培養(yǎng)相比,Perfusion工藝細胞VCD比Fed-batch高2～5倍［11］,并能在較長時間內保持較高密度,獲得更高的體積生產率,糖基化圖譜和電荷異質性比較一致。Perfusion工藝可以減少蛋白聚集和不完整碎片,批間異質性更低。從經濟方面進行比較,培養(yǎng)基對總成本的影響會隨著灌流速率(perfusion rate,PR)的提高而顯著降低。在Perfusion中,通過優(yōu)化培養(yǎng)基,降低單位細胞的灌流速率(CSPR),提高細胞特定生產率(QP)值,最終反應器產率提高230%,總培養(yǎng)基成本從17 $/g降低至10.1 $/g［12］。灌流工藝傳統(tǒng)習慣用于生產不穩(wěn)定產品比如凝血因子和酶制品,然而也可用于mAb的生產,以下匯總了12種采用灌流工藝進行生產商業(yè)治療生物制品藥物［13］。見表1。

表1 采用灌流工藝進行生產的商業(yè)治療生物制品藥物

3.2 高密度接種Fed-batch (HSD) 高密度接種Fedbatch的N-1階段一般采用Perfusion方式得到較高細胞密度,以滿足高接種密度的要求。一般高密度接種的細胞密度為2×106cells/ml以上,可減少生產階段時間,以更短的Fed-batch生產周期達到相同產量［14］。這一強化工藝模式主要有兩個優(yōu)勢：①對培養(yǎng)基用量需求較少；②對現有工藝設備改動較少,只需改動N-1階段設備即可［3］。有研究顯示,對比傳統(tǒng)的Fed-batch工藝,N-1 perfusion銜接高密度接種Fed-batch,可以顯著增加表達量［15］。

高密度接種Fed-batch可以縮短單批次培養(yǎng)時間達到同樣的產量要求,增加每年的生產批次,大大提升了設備利用率,繼而使產能得到提高。在Yang等［5］的研究中,對兩株CHO細胞株進行高密度接種Fedbatch工藝優(yōu)化,利用N-1 perfusion得到40×106cell/ml 的高密度種子,以初始密度10×106cells/ml接種N階段Fed-batch,12 d即達到原工藝17 d的表達量(5 g/L),產能提高30%,且產品質量與原工藝保持一致,并且其中一株克隆產品質量更得到改善。Stepper等［16］對比傳統(tǒng)工藝,采用超高密度接種Fed-batch后,6 d即達到原工藝11 d的表達量,生產周期縮短45%。以相同年產量計算,傳統(tǒng)工藝需要生產147批,采用高密度接種Fed-batch強化工藝后只需生產49批,產能從 2.1 kg/d提高到3.9 kg/d。有研究［17］將傳統(tǒng)工藝流程與強化工藝流程進行對比,具體見圖2。

圖2 傳統(tǒng)工藝流程與強化工藝流程對比

在進行高密度接種Fed-batch工藝優(yōu)化時,應充分考慮到細胞生長代謝和蛋白質量的變化。高密度接種Fed-batch,細胞對數增長期縮短,較早到達平臺期,可能會出現提前進入衰亡期,因此細胞生長代謝與傳統(tǒng)工藝存在一定差異。Xu等［18］以(3～16)×106cells/ml初始密度進行接種,對比原工藝Peak VCD提高1.8～2.4倍,最終表達量提高至4～8倍。根據細胞株及原工藝不同,采用高密度接種Fed-batch強化工藝后,由于細胞密度和活率、平臺期維持時間與傳統(tǒng)工藝可能存在差異,所以可能造成蛋白質量的變化。Padawer等［6］的研究,同樣發(fā)現采用高密度接種Fed-batch強化工藝后,蛋白的酸堿異構發(fā)生改變；以5×106cells/ml初始密度進行接種,以表達量達到原工藝水平時收獲日蛋白質量對比,糖基化結果沒有顯著差異,但是酸性峰比例下降12%～20%。

3.3 CFB工藝 CFB工藝一般是使用50 KD孔徑的中空纖維柱,通過1個動力系統(tǒng)使反應器內培養(yǎng)液流經柱子的同時排出廢液,而細胞和蛋白被截留在反應器內,同時會往反應器內補充新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)液循環(huán)于反應器與中空纖維柱的方法主要分為交替切向流(alternating tangential flow,ATF)和切向流過濾(tangential flow filtration,TFF),其中ATF應用較多。見圖3。

早期關于CFB的研究是使用WAVE生物反應器,John等［19］在WAVE生物反應器中使用CHO細胞生產免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)的研究中應用了ATF系統(tǒng)來開發(fā)CFB工藝,通過優(yōu)化PR,從0.8～1.2 VVD 提高到0.8～2.5 VVD,VCD可達到34.5×106cells/ml,最終蛋白濃度為3.8 g/L,相比于傳統(tǒng)補料培養(yǎng)(traditional fed-batch,TFB),最高VCD和表達量分別提高了6倍和10倍。Clincke等［20］同樣進行了在WAVE生物反應器中開發(fā)CFB工藝的研究,其團隊分別用ATF系統(tǒng)和TFF系統(tǒng)做了對比研究,得到了蛋白產量(ATF,第 11天,1.80 g/L；TFF,第12天,2.98 g/L)。受限于當時細胞株及培養(yǎng)基開發(fā)不太成熟,以及WAVE生物反應器中氧氣傳質效率不夠等原因,早期研究中Titer均比較低。

Yang等［21］在5 L Applikon生物反應器中結合ATF系統(tǒng)對CFB工藝參數的優(yōu)化進行了研究,最初在1×培養(yǎng)基,0.1 CSPR的條件下,培養(yǎng)至第10天時ATF柱即發(fā)生了堵塞現象,導致培養(yǎng)終止。經過優(yōu)化后將灌流培養(yǎng)基濃縮配制為2×培養(yǎng)基,以0.05 CSPR的PR重新進行實驗,但是由于VCD過高(接近200× 106cells/ml)ATF柱很快也出現了堵塞,但對比之下,同時期的Titer遠高于之前工藝,為了防止這一現象在培養(yǎng)至第8天時將培養(yǎng)溫度由35℃降為31℃,最高VCD得以控制在120×106cells/ml左右,培養(yǎng)周期相應也得到延長。在蛋白質量的變化上,該團隊發(fā)現,相比于TFB,CFB工藝產出的蛋白存在聚體增多、電荷異質性方面酸峰降低的質量數據變化。優(yōu)化后的工藝在另一細胞株上驗證,最終結果見表2。

表2 不同工藝的質量結果對比

3.4 細胞截留技術 細胞截留技術能使細胞和產品或培養(yǎng)基分離,去除代謝廢物,同時不斷進行新鮮培養(yǎng)基的置換,從而達到較高的細胞密度和細胞活率,延長培養(yǎng)時間。理想的細胞截留技術應具備較高的細胞截留效率和灌流能力,較低的流速和較短的反應器外停留時間,能夠維持較高的細胞密度和細胞活率、較長時間的運行性能穩(wěn)定及較低的失敗風險等。

該技術原理主要包括根據密度的沉降分離(傾斜式沉降、離心機分離、超聲波分離、水力渦旋器等)和根據細胞孔徑大小的膜分離(切向流膜分離、中空纖維膜分離等),每種技術各有其優(yōu)缺點。沉降分離是利用細胞與培養(yǎng)基的密度不同進行分離。其優(yōu)點是可以避免膜堵塞的問題,降低剪切力引起的細胞損傷,能夠實現長時間的Perfusion。但是采用這種灌流裝置,細胞密度的峰值較低。Searles等［22］報道細胞密度的峰值只能達到(20～30)×106cells/ml,如果超過這個細胞密度截留效率會顯著降低。Kim等［23］的實驗表明,連續(xù)離心Perfusion細胞密度是30×106cells/ml,能維持＞30 d的培養(yǎng)。超聲分離進行Perfusion細胞密度的峰值一般是(10～20)×106cells/ml,目前也有文獻［24］報道細胞密度的峰值能達到40×106cells/ml。2007年Pinto等［25］報告水力旋流表現出較高的分離效率,分離效率能達到99%,但細胞密度較低。Bettinardi等［26］研究顯示使用水力旋流進行截留,細胞密度也能達到 50×106cells/ml。

另一種細胞截留技術是膜分離技術,包括中空纖維過濾、交叉流過濾、漩渦流過濾及旋轉過濾等。膜分離截留技術最大的挑戰(zhàn)是死細胞,細胞碎片以及添加的消泡劑等會導致膜堵塞。目前常見的中空纖維過濾包括TFF和ATF。TFF是采用切向流技術,通過蠕動泵使過濾方向與液體流動方向相互垂直,從而減少膜堵塞風險。不同研究小組［27,28］實驗結果顯示,TFF細胞密度峰值能達到(60～70)×106cells/ml,培養(yǎng)時間＞25 d。ATF是通過隔膜泵提供動力使得培養(yǎng)液在經過中空纖維TFF實現細胞攔截,一次循環(huán)可以同時反沖膜,所以能有效防止膜的阻塞。ATF可以實現較高的培養(yǎng)基置換速率和低剪切力,能夠維持較高的細胞密度及活力。Kim等［23］研究發(fā)現使用ATF Perfusion,細胞密度的峰值能達到130×106cells/ml。Xu等［29］報道ATF Perfusion細胞密度維持在40×106cells/ml,培養(yǎng)時間能維持40 d,同時產品的表達量和質量能保持一致。

4 小結

強化工藝的優(yōu)點可以總結為更快(縮短生產周期)、更省(提高廠房利用率、在線過程分析技術可降低運營成本、自動化的引入可減少人為犯錯成本)及更好(穩(wěn)定卓越的產品質量、更高的產能)。然而,在成功進行商業(yè)生產之前,仍然存在一些必須克服的挑戰(zhàn),包括：如何降低巨大的成本壓力,如何通過風險控制讓變化可控?？梢灶A期,隨著研究工作的深入,下一代生物工藝實現工藝強化,降本增效,向連續(xù)流方向發(fā)展。