王歡利，嚴靈君，黃 犀，王仲偉，湯詩杰

(江蘇省中國科學院植物研究所，江蘇省植物資源研究與利用重點實驗室，江蘇 南京 210014)

南京椴(Tiliamiqueliana)為我國特有喬木樹種，隸屬錦葵科(Malvaceae)椴樹屬(Tilia)，綜合應(yīng)用前景廣泛，既是優(yōu)良的園林綠化和蜜源植物，亦具有極高的藥用價值。南京椴野生種群數(shù)量較少，目前僅在江蘇、安徽、浙江等地有分布，且種群規(guī)模較小[1]。已有前人對江蘇寶華山和安徽皇藏峪的南京椴群落結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域內(nèi)南京椴群體多為極小種群，且處于衰退狀態(tài)[2-3]，野生資源的保護工作已迫在眉睫。

對物種多樣性進行全方位評價和遺傳背景調(diào)查是保護野外種群的重要環(huán)節(jié)。近年來，DNA分子標記技術(shù)已成為分析物種遺傳結(jié)構(gòu)時必不可少的手段，其中，SSR標記因其具有共顯性、穩(wěn)定性良好、多態(tài)性高等特點廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析中。SSR標記，也稱為微衛(wèi)星DNA，是一類由幾個核苷酸(一般為1～6個)為重復單位組成的串聯(lián)重復序列。EST-SSR是存在于表達基因序列內(nèi)的SSR標記[4]，不僅具有SSR標記共顯性遺傳、穩(wěn)定性高、分布廣等特點[5]，同時具有開發(fā)成本較低的特點，而且主要反映了植物功能基因的差異，與表型性狀的關(guān)系更為密切[6-7]。因此EST-SSR在遺傳圖譜構(gòu)建[8-9]、種群遺傳多樣性[10-13]等領(lǐng)域有著極為重要的意義。

目前在椴樹屬遺傳多樣性領(lǐng)域已有一定的研究基礎(chǔ)，主要是利用nDNA或cpDNA的PCR-RFLP[14]、RAPD[15-17]等分子標記對銀毛椴(T.tomentosa)、毛柱椴(T.dasystyla)、歐洲小葉椴(T.cordata)等進行遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明椴樹屬樹種都具有較高的遺傳多樣性，并且不同種群間都具有較高的遺傳相似性，但前人的研究均未采用EST-SSR標記。為此，筆者選用15個SSR分子標記對5個南京椴天然群體進行研究，以期揭示南京椴群體遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)的地理分布特點，為南京椴野外群體的保護和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年6—10月，對浙江天臺山、江蘇牛首山、江蘇寶華山和安徽皇藏峪的南京椴天然群體進行野外調(diào)查及樣品采集，收集5個群體共計93個南京椴單株(表1)。供試植株選取各群體中生長健康、無嚴重缺陷及病蟲害，且樹高10 m以上、胸徑20 cm以上、間距30 m以上的成年植株，采集各單株新鮮、健康的葉片，分別置于自封袋中加入5倍體積的變色硅膠，干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 5個南京椴群體地理位置及采樣信息Table 1 Location and sample size of five populations T. miqueliana

1.2 基因組DNA提取

南京椴基因組DNA的提取采用北京百泰克生物科技有限公司的新型快速植物基因組DNA提取試劑盒(貨號：DP3112)。DNA樣品經(jīng)質(zhì)量分數(shù)1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測后，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴增及STR分型

采用前期研究中獲得的15對穩(wěn)定性好、多態(tài)性豐富的EST-SSR引物，引物序列信息見表2[18]。熒光引物交由上海捷瑞生物工程有限公司合成，標記類型見表2。以基因組DNA為模板進行PCR擴增，反應(yīng)體系為20 μL，包含2×TaqMaster Mix 7.5 μL，DNA模板1 μL(5～8 ng)，正向引物和反向引物(10 μmol/L)各0.9 μL，去離子水4.7 μL。PCR反應(yīng)程序為：預變性95 ℃，3 min；循環(huán)反應(yīng)95 ℃，15 s；根據(jù)不同引物設(shè)置退火溫度，15 s；最后72 ℃，60 s；共計30個循環(huán)。72 ℃延伸5 min，4 ℃儲存。PCR產(chǎn)物交由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司進行毛細管電泳檢測，完成STR分型。

表2 15對南京椴EST-SSR引物信息Table 2 Information of EST-SSR primers in T. miqueliana

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Gene-Marker 2.2.0軟件參照Esselink等[19]的方法讀取四倍體峰圖，對位點的峰面積進行比對讀取數(shù)據(jù)，校驗峰圖并將數(shù)據(jù)錄入Excel表格中，建立原始數(shù)據(jù)矩陣。

2 結(jié)果與分析

2.1 南京椴SSR位點擴增多態(tài)性

15對SSR引物在93份南京椴樣品中，共檢測到96個等位基因(124～288 bp)(表3)。15個SSR位點的等位基因(A)的均值為6.4，每個體等位基因(Ai)的均值為2.3。共檢測四倍體基因型(G)總數(shù)為441，各引物四倍體基因型(G)變化范圍為8～65；四倍體特異基因型(Gi)總數(shù)為251，各引物四倍體特異基因型(Gi)變幅為2～50，特異帶型比率(R1)范圍為15.38%～76.92%。15對引物多態(tài)性信息含量(CPIC)均大于0.6，平均值為0.871 0，CPIC值最高的為C3235(0.978 8)，最低的引物為C1050(0.660 2)；Shannon信息指數(shù)(I)平均值為2.728 4，最高的為C3235(3.997 7)，最低的為C1050(1.456 7)，結(jié)果與CPIC值一致，表明15對EST-SSR引物多態(tài)性高，可以有效揭示南京椴遺傳多樣性。

表3 SSR引物擴增產(chǎn)物多態(tài)性Table 3 Primer amplification product polymorphism

2.2 南京椴群體的遺傳多樣性

由5個群體的遺傳多樣性參數(shù)(表4)可知，每個位點等位基因數(shù)的均值(Al)為5.50±2.43，Al值最高的群體為皇藏峪群體(5.87±2.67)，最低的群體為天臺山群體(5.00±2.00)；每個體在每個位點的平均等位基因數(shù)的均值(Aloc)為2.29±0.44，Aloc值最高的群體為寶華山群體，最低的群體為蜀山群體。每個位點四倍體基因型豐富度的均值(Gloc)為9.41±4.29，Gloc值最高的群體為皇藏峪群體(13.20±6.54)，最低的群體為天臺山群體(6.73±3.28)。平均觀察雜合度(Ho)變化范圍為0.59～0.64，其中Ho值最高的群體為寶華山群體；平均期望雜合度(He)變幅為0.58～0.65，說明各群體均具有較高的雜合性，其中He值最高的群體為寶華山群體。綜合Gloc和He值可知：南京椴寶華山群體(P1)和皇藏峪群體(P3)具有較高的遺傳多樣性。

表4 15對引物在5個南京椴群體的遺傳多樣性參數(shù)Table 4 Genetic diversity parameters of five T. miqueliana populations

2.3 南京椴群體的遺傳分化

基因多樣性是衡量遺傳多樣性的指標，基因多樣性越高說明群體遺傳多樣性越高?？傮w來看，15個位點總基因多樣度(Ht)的均值為0.634，群體內(nèi)基因多樣度(Hs)的均值為0.616，但群體間基因多樣度(Dst)的均值僅為0.018，表明南京椴遺傳變異主要來自群體內(nèi)。15對引物中，總基因多樣性(Ht)最高的引物為B485(0.841)，最低引物B2410(0.425)；群體內(nèi)基因多樣度(Hs)最高的是B485(0.811)，C1050引物最低。遺傳分化系數(shù)(Gst)是衡量同一物種種群間基因分化程度的指數(shù)，數(shù)值越高，基因分化程度越大。15對遺傳分化系數(shù)(Gst)均值為0.030，進一步說明了南京椴群體間遺傳分化較小。比較15對引物的遺傳分化系數(shù)可知，C1050引物的Gst值最高，為0.110；C2700和B90的Gst值最低，只有0.002(表5)。

表5 5個南京椴種群的遺傳分化Table 5 Genetic differentiation of five T. miqueliana populations

AMOVA分子變異分析結(jié)果(表6)表明，群體內(nèi)變異(為12.847)遠大于群體間的方差平方和(0.557)；同時，群體內(nèi)變異占總變異的96%，遠高于與群體間變異(4%)。群體間遺傳分化系數(shù)(PhiPT)為0.042，群體間的基因流(Nm)為2.882。以上結(jié)果進一步驗證了南京椴群體的遺傳變異主要來自群體內(nèi)，群體間遺傳分化較小，存在廣泛的歷史基因流。

表6 5個南京椴群體的AMOVA分析Table 6 Analysis of molecular variance of five T. miqueliana populations

2.4 南京椴群體遺傳結(jié)構(gòu)

采用非加權(quán)組平均法(UPGMA，unweightedpairgroupmethodarithmeticmeans)，基于Nei’s遺傳距離，分別構(gòu)建南京椴5個天然群體及93個體的聚類樹。群體聚類結(jié)果(圖1)顯示：5個群體分為2支，分別為A組和B組，A組為寶華山、牛首山、皇藏峪和蜀山群體；B組天臺山群體單獨為1支；A組進一步被分為2支，其中寶華山和牛首山群體為A1組，皇藏峪和蜀山群體P4為A2組。個體聚類結(jié)果(圖2)與主坐標分析結(jié)果(圖3)均表明，5個群體中南京椴個體之間譜系較為混亂，未形成明顯的分離群體，可能是由于群體之間存在著較為頻繁的基因交流。對群體間地理距離與遺傳距離進行Mantel檢驗，結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)R=0.049(P=0.498)，表明南京椴遺傳距離與地理距離無顯著相關(guān)性。結(jié)果與主坐標(PCoA)分析一致，5個群體之間存在大量的重疊，說明群體間的個體之間存在大量的基因交流，尚未形成離群的群體。

圖1 5個南京椴群體遺傳距離聚類Fig.1 The genetic distance clustering of five populations T. miqueliana

圖2 南京椴93個體SSR聚類圖Fig.2 Phylogenetic tree of the 93 T. miqueliana individuals based on SSR

圖3 南京椴93個體SSR主坐標分析圖Fig.3 Principal coodinate analysis of SSR in 93 individuals of T. miqueliana

利用Structure2.3.1軟件，基于貝葉斯數(shù)學模型分析南京椴93個體構(gòu)成的群體結(jié)構(gòu)。通過StructureHarvester在線軟件計算，當Delta值最大時，對應(yīng)的K值為最優(yōu)分組數(shù)為2組(圖4)。當K=2時，5個群體被分為紅綠兩組(圖4)。P1、P2和P5綠色所占比例較高，P3和P4紅色比例較高，與聚類分析基本一致。

圖4 南京椴5個群體的遺傳結(jié)構(gòu)Fig.4 Genetic structure of five T. miqueliana populations

3 討 論

SSR引物的欠缺制約了椴樹屬植物群體分子層面的研究。本研究使用的SSR引物均表現(xiàn)出良好的多態(tài)性，多態(tài)性信息含量(CPIC)均大于0.5，根據(jù)Botstein等[27]對多態(tài)性的定義，15對引物均屬于高多態(tài)性引物；15對SSR引物的平均特異基因型比率(R1)達到了45.73%，其中B485、C3235、B2405、B2410引物的特異帶型組合較多，平均特異基因型比率都超過了60%，可為南京椴種質(zhì)鑒定、品種選育及指紋圖譜構(gòu)建等方面提供該技術(shù)支撐。

一般認為，群體遺傳分化系數(shù)(Gst)在0～0.05時，群體存在較小的遺傳分化；Gst在0.05～0.15時，群體具有中等程度的遺傳分化[28]。南京椴群體遺傳分化系數(shù)為0.03，群體間的遺傳分化較低。同時93個體聚類及PCoA結(jié)果進一步驗證了南京椴野外群體間并未形成明顯的分化，表明群體間必然存在連續(xù)的基因流，這可能是由于長距離的花粉傳播，或作為佛教“菩提樹”，人類活動促使不同地區(qū)南京椴群體的交流。比較15對引物的遺傳分化系數(shù)(Gst)，僅有3對引物Gst大于0.05，說明所檢測的大部分位點分化程度都較低，這與Hao等[29]、范英明等[22]報道的北沙柳和華北落葉松群體分化結(jié)果一致，即群體存在較小的遺傳分化，進一步證實遺傳分化程度低是南京椴群體的內(nèi)在特征，而非引物選擇導致的。同時，AMOVA分析結(jié)果表明，南京椴的群體內(nèi)變異(96%)遠大于群體間變異(4%)，結(jié)合群體遺傳分化分析結(jié)果，證明南京椴群體內(nèi)遺傳多樣性遠大于群體間，這與Hamrick等[30]總結(jié)的木本植物遺傳結(jié)構(gòu)特征一致，主要原因為南京椴等木本植物壽命長、抗逆性強、異交授粉結(jié)實，同時人類活動在一定程度上影響了其群體間的遺傳分化。

比較各群體遺傳多樣性發(fā)現(xiàn)：綜合基因豐富度(Gloc)與期望雜合度(He)結(jié)果表明，安徽蜀山和浙江天臺山群體的遺傳多樣性較低；而江蘇寶華山群體和牛首山群體遺傳多樣性水平較高。這與湯詩杰等[2-3]基于ISSR和RAPD標記分析的南京椴遺傳多樣性的研究結(jié)果基本一致。群體聚類結(jié)果表明，江蘇寶華山與江蘇牛首山群體聚為一支，安徽皇藏峪與安徽蜀山群體聚為一支，浙江天臺山歸為單獨一支；Structure群體結(jié)構(gòu)分析則將5個南京椴群體分為兩組，其中浙江天臺山、江蘇寶華山和江蘇牛首山群體為同一組，安徽皇藏峪和安徽蜀山群體分為一組，結(jié)果與聚類分析基本一致。

本研究在湯詩杰等[2-3]的研究基礎(chǔ)上進一步擴大采樣范圍，補充收集了浙江天臺山和安徽蜀山群體內(nèi)大徑級個體，基本覆蓋南京椴的主要分布區(qū)域江蘇、安徽和浙江3省。同時在采樣過程中通過對徑級的觀察，發(fā)現(xiàn)南京椴大徑級個體主要分布于寶華山和皇藏峪。同時結(jié)合湯詩杰等[31-32]對南京椴種群結(jié)構(gòu)的調(diào)查，顯示寶華山群體和皇藏峪群體中，胸徑大于22.5cm的個體數(shù)最多。因此，綜合遺傳多樣性，聚類分析及Structure分析結(jié)果，推斷南京椴引種栽培可能起源于寶華山和皇藏峪。Mental檢驗否定了南京椴遺傳距離與地理距離的相關(guān)性，表明南京椴群體的擴張，并非以某個種群為中心向外擴張，更多的是由于人工栽植過程中種子的傳播引起。但南京椴群體間遺傳化較低，今后的研究過程仍需進一步擴大野外群體采樣范圍，采用覆蓋度更高的標記進一步補充證實南京椴引種栽培中心進而探究南京椴群體起源。

天然群體高水平遺傳多樣性是生物多樣性的基礎(chǔ)和核心，是野外群體能夠穩(wěn)定存在并發(fā)展的基礎(chǔ)，物種群體的穩(wěn)定性和進化潛力與其遺傳多樣性有密切的關(guān)系[33]。通過對物種遺傳多樣性及種群間的親緣關(guān)系研究可以提出較為有效的保護措施，例如有研究者對麻花艽(Gentiana straminea)進行遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)遺傳分化系數(shù)較低，提出建立保護區(qū)的措施保護野外種群[34]。李乃偉等[35]通過對南方紅豆杉(Taxus wallichianavar.mairei)的遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)南方紅豆杉各居群間遺傳距離與這些居群的地理生境有關(guān)，可以選擇環(huán)境較好的區(qū)域?qū)ζ溥M行遷地保護。本研究發(fā)現(xiàn)南京椴群體具有較大的遺傳進化潛力，因此遺傳因素并不是南京椴群體數(shù)量減小的主要原因。主要原因可能是南京椴野外繁育瓶頸(異交授粉，結(jié)實率低，種子傳播受限、萌發(fā)困難，幼苗對環(huán)境適應(yīng)性差和生境郁閉度高等因素)及人為干擾。因此，在南京椴野外群體保護過程中，通過設(shè)立保護區(qū)，防止人為擾動；同時對遺傳多樣性較高的寶華山及皇藏峪群體加強保護，采取野外放置蜂箱的方式，促進群體內(nèi)的異交；并通過人工輔助育苗技術(shù)進行幼苗的繁育，最終在保護區(qū)域內(nèi)選取合適的生境進行移栽，實現(xiàn)種質(zhì)的回歸與更新。

本研究基于EST-SSR標記對江蘇寶華山、牛首山，安徽皇藏峪、蜀山和浙江天臺山5個南京椴天然群體進行了遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示南京椴群體均具有豐富的遺傳多樣性，其中寶華山群體和皇藏峪群體多樣性較高，推測這兩個群體為南京椴引種起源中心；然而南京椴群體間未形成明顯的分化，未形成離群的群體，表明南京椴群體間可能存在較為廣泛的基因交流；群體的地理距離與遺傳距離無相關(guān)性，推測南京椴群體擴散的過程中主要是通過人類活動帶來的種子基因流。依據(jù)上述研究結(jié)果，確立了寶華山和牛首山為優(yōu)先保護群體，提出通過在棲息地建立保護區(qū)，加大群體內(nèi)植株異交，并采用人工繁育及種質(zhì)回遷的方式保護野外群體。