許尨，鄭麗君，馬海然*，李洪亮，胡鵬麗，趙婧茹

1.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司（呼和浩特 011500）；2.蒙牛高科乳制品（北京）有限責(zé)任公司（北京 101100）；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)乳品與奶牛繁育生物工程技術(shù)企業(yè)重點實驗室（呼和浩特 011500）

長期飲酒或是短期內(nèi)大量飲酒都會造成人體肝臟的損傷甚至是肝臟致病影響，酒精性肝病主要包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、肝纖維化、肝硬化和肝癌。隨著生活水平的不斷提升，酒精消費的人群不斷年輕化，對于肝臟的損傷也引起人們的關(guān)注度，在有效預(yù)防早期酒精性肝病損傷上還缺乏有效治療藥物。

葛根在我國有悠久的使用歷史，葛根為豆科植物野葛、甘葛或粉葛的干燥根，是生活中較常見的藥食兩用資源?！吨袊幍?010》中記載，葛根味甘、辛，性涼，歸胃、肺經(jīng)，有解肌退熱、透疹、生津止渴、升陽止瀉等功效[1]。葛根在治療心血管疾病，抗氧化，抗糖尿病，抗腫瘤，對抗神經(jīng)系統(tǒng)、骨系統(tǒng)疾病的作用，抗炎癥等方面有很好療效，針對功能機(jī)理的研究不斷開展[2-3]。姜黃屬于姜科姜黃屬植物姜黃的根莖，我國主要產(chǎn)地為四川、江西、福建等地，主要成分為姜黃類化合物，對姜黃的研究主要在其抗炎癥治療效果上。

針對葛根、姜黃的藥理作用進(jìn)行研究，試驗將葛根與姜黃按照一定比例進(jìn)行搭配使用，應(yīng)用在食品加工中，旨在開發(fā)一款具有保肝解酒效果的混合物，并進(jìn)行動物試驗驗證其效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 測試樣品制備

葛根姜黃復(fù)合物內(nèi)容物組分：以葛根素為指標(biāo)，葛根素含量控制在15%，以姜黃素為指標(biāo)，姜黃素含量控制在30%，以檸檬酸、甜味劑、復(fù)合維生素為輔助成分。100 g混合物為例，葛根1.3 g、姜黃0.2 g、白砂糖15.0 g、檸檬酸0.3 g、復(fù)合維生素0.2 g、水83.0 g。

1.1.2 試驗動物

CD（SD）大鼠140只[北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，SPF級，雌雄各半，質(zhì)量合格證號1100111911077830，體重180～210 g，生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2016-0011]；試驗動物房為屏障系統(tǒng)+IVC籠盒[使用許可證號SYXK（京）2017-0033，溫度20～25 ℃，相對濕度45%～65%]；動物飼料、墊料（均由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供）。

1.1.3 主要儀器和試劑

蓋玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司）；一次性注射器（江蘇正康醫(yī)療器械有限公司）；灌胃針（上海起發(fā)實驗試劑有限公司）；電子天平（梅特勒托利多）；超凈工作臺（廣州靈潔空氣凈化設(shè)備制造有限公司）；氯胺酮戊和巴比妥鈉[西寶生物科技（上海）股份有限公司]；紅星二鍋頭（53%，北京紅星股份有限公司）；無水乙醇、二甲苯、鹽酸、氨水、中性樹膠（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；高效切片石蠟（上海華永石蠟有限公司）；蘇木素-伊紅染液、載玻片（武漢賽維爾生物科技有限公司）；藤茶、力克、姜黃之力（市售）。

1.2 試驗方法

1.2.1 大鼠酒精耐受試驗（表1）

表1 酒精耐受測試試驗

取大鼠若干只，隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半，試驗前禁食1夜（12 h）。各組分別用白酒5，7，10，15和20 mL/kg體重灌服，觀察大鼠活動及死亡情況，重復(fù)3次，記錄內(nèi)大鼠的死亡只數(shù)。

1.2.2 大鼠防醉酒試驗

將大鼠隨機(jī)分為生理鹽水、試驗低劑量組、試驗高劑量組、陽性對照組1（藤茶組）、陽性對照組2（力克）、陽性對照組3（姜黃之力），每組20只。根據(jù)試驗確定大鼠酒精耐受量，確定灌酒量、灌藥量如表2所示。灌藥30 min后，各組均灌胃白酒，每只灌酒量為確定的醉酒量。每只大鼠灌胃結(jié)束，把大鼠進(jìn)行顛倒放置，即四肢朝上、背部朝下，觀察其翻正反射的情況。醉酒判定標(biāo)準(zhǔn)：翻正反射消失并且持續(xù)30 s，為醉酒，記錄翻正消失的時間稱為耐受時間。

表2 樣品防醉測試試驗

1.2.3 大鼠酒精代謝解酒試驗

將大鼠隨機(jī)分為生理鹽水、試驗低劑量組、試驗高劑量組、陽性對照組1、陽性對照組2、陽性對照組3，每組20只。根據(jù)試驗確定大鼠酒精耐受量，確定灌酒量，灌藥量如表3所示。各組灌藥30 min后，均灌胃白酒，每只灌酒量為確定的醉酒量。觀察大鼠活動情況，以大鼠后腹拖地、爬行不穩(wěn)、閉眼懶動等為睡眠（醉酒）指標(biāo)，以四肢靈活、行動自如、精神恢復(fù)為蘇醒（醒酒）指標(biāo)。記錄大鼠入睡醉酒時間和蘇醒醒酒時間。

表3 樣品解酒測試試驗

1.2.4 酒精性肝損傷試驗

1.2.4.1 肝損傷模型

取140只SD大鼠，隨機(jī)分成7組，每組20只，雌雄各半，分別為生理鹽水、試驗低劑量組、試驗高劑量組、陽性對照組1、陽性對照組2、陽性對照組3及空白對照組。每天每組分別用樣品灌胃（劑量如表4所示），30 min后均以0.07 mL/10 g體重白酒灌胃，連續(xù)不間斷灌胃30 d。

表4 樣品肝損傷測試試驗

1.2.4.2 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定

從大鼠頸動脈取血，采用IFCC推薦法，測定血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT，谷丙轉(zhuǎn)氨酶）含量。

1.2.4.3 肝臟病理學(xué)切片觀察

將大鼠解剖，取出部分肝臟，采用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，間斷連續(xù)切片，切片厚5 μm，HE染色，光鏡下觀察。

顯微鏡下仔細(xì)觀察每張組織切片并記錄組織學(xué)變化。組織病變程度采用五級分法：無病變或極少量病變計分為0，標(biāo)注-；有輕度病變或少量病變計分為1，標(biāo)注+；有中度病變或中等量病變計分為2，標(biāo)注++；有重度病變或多量病變計分為3，標(biāo)注+++；有極重度病變或大量病變計分為4，標(biāo)注++++。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠酒精耐受試驗

對大鼠進(jìn)行不同酒精梯度灌胃試驗，結(jié)果顯示如表5。酒精量超過10 mL/kg出現(xiàn)半數(shù)致死量，大鼠不耐受，大鼠灌胃控制在5 mL/kg時，雖然全部存活，但存在未酒醉現(xiàn)象，而控制酒精量在7 mL/kg時，大鼠基本全部存活，同時出現(xiàn)醉酒現(xiàn)象，大鼠爬行不穩(wěn)、后腹拖地、毛松散、閉眼不動。

表5 灌酒后大鼠存活數(shù) 單位：只

2.2 大鼠防醉酒試驗

從表6可見：與空白組相比，試驗組低、高劑量組能顯著提升大鼠的耐受時間，延長大鼠的醉酒潛伏期。進(jìn)一步分析比較發(fā)現(xiàn)，試驗低、高劑量組耐受時間比陽性對照組1，2和3效果明顯，試驗高劑量組比陽性對照組1，2和3耐受時間提高113.6%，148.6%和132.2%，結(jié)果表明葛根和姜黃復(fù)合物可提升大鼠酒精耐受程度，延緩醉酒時間。這主要是葛根中的主要功能成分葛根素延緩胃排空時間，減緩酒精的吸收速度，降低腸壁的通透性，減少胃黏膜的滲透性，酒精進(jìn)入血液時間延長，從而減少對神經(jīng)系統(tǒng)的刺激和損傷[4-6]。

表6 大鼠酒精耐受時間

2.3 大鼠酒精代謝解酒試驗

從表7可見：與生理鹽水組相比，試驗組低、高劑量組能顯著縮短大鼠的醉酒時間和蘇醒時間。進(jìn)一步分析比較發(fā)現(xiàn)，高劑量組醉酒時間比生理鹽水組降低23.6%，入睡大鼠數(shù)量減少，醒酒效果顯著，與對照組1，2和3相比，高劑量組效果顯著優(yōu)于所有對照組。結(jié)果表明葛根和姜黃復(fù)合物可延長醉酒潛伏期，顯著縮短醒酒時間，減少大鼠入睡數(shù)量。這可能是因為葛根素在酒精代謝途徑中提高乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶的活性，加速酒精代謝，同時抑制線粒體中細(xì)胞色素P450的活性，減少活性氧的產(chǎn)生[7-10]。

表7 復(fù)合物對酒精代謝的影響

2.4 酒精性肝損傷試驗

2.4.1 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定

血清中ALT和AST活性是醫(yī)學(xué)臨床上通過生化法檢查肝功能的常規(guī)指標(biāo)，用于判斷肝臟是否受到損害。血清AST和ALT活性升高，AST/ALT＞2，平紅細(xì)胞容積（MCV）升高等是酒精性肝病的特征臨床診斷指標(biāo)。

由圖1可知，與空白組相比，酒精可導(dǎo)致生理鹽水組大鼠血清中ALT活性升高，存在顯著性差異。與生理鹽水組相比，各試驗組、陽性組2和3可有效降低ALT活性，甚至降低至空白組以下，試驗組高低劑量組顯著低于空白組，表明試驗組可能具有較好的護(hù)肝效果。

圖1 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶含量

2.4.2 肝切片

試驗組HE切片統(tǒng)計結(jié)果見表8。

表8 HE切片診斷結(jié)果

在光鏡下觀察肝組織HE切片發(fā)現(xiàn)，空白組大鼠（見圖2）肝小葉結(jié)構(gòu)整齊，以中央靜脈為中心肝板組織肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，胞質(zhì)疏松淡染，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤。生理鹽水組（見圖3）組織局部可見膠原纖維橋接形成（黑色箭頭），局部匯管區(qū)可見較多炎性細(xì)胞灶狀浸潤（虛線箭頭）。試驗低劑量組（見圖4）組織肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，可見少量肝細(xì)胞輕度顆粒變性（粗箭頭），胞質(zhì)疏松淡染，可見少量肝細(xì)胞脂肪變性（黑色箭頭），胞質(zhì)中含有大小不一的脂肪空泡，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤。試驗高劑量組（見圖5）組織可見個別肝細(xì)胞脂肪變性（黑色箭頭），胞質(zhì)中含有大小不一的脂肪空泡，局部肝小葉中偶見炎性細(xì)胞浸潤小灶（虛線箭頭），局部匯管區(qū)周圍可見膽管細(xì)胞增生（粗箭頭）。陽性對照組1（見圖6）組織可見較多肝細(xì)胞輕中度顆粒變性（黑色箭頭），胞質(zhì)疏松淡染，局部靜脈周圍可見纖維橋接形成（粗箭頭），未見明顯炎性細(xì)胞浸潤。陽性對照組2（見圖7）組織可見大量肝細(xì)胞中度顆粒變性（黑色箭頭），胞質(zhì)疏松淡染，匯管區(qū)可見膽管細(xì)胞和纖維細(xì)胞增生，局部可見肝細(xì)胞壞死灶（粗箭頭），胞核消失、碎裂，胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)，肝小葉中可見少量炎性細(xì)胞浸潤小灶（虛線箭頭）。陽性對照組3（見圖8）組織肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，局部靜脈周圍偶見炎性細(xì)胞浸潤（虛線箭頭），局部匯管區(qū)膽管細(xì)胞增生，伴膠原纖維增生（黑色箭頭）。

圖2 空白組（a）和空白組（b）大鼠肝組織切片HE×20

圖3 生理鹽水組（a）和生理鹽水組（b）大鼠肝組織切片HE×20

圖4 試驗低劑量組（a）和試驗低劑量組（b）大鼠肝組織切片HE×20

圖5 試驗高劑量組（a）和試驗高劑量組（b）大鼠肝組織切片HE×20

圖6 陽性對照組1（a）和陽性對照組1（b）大鼠肝組織切片HE×20

圖7 陽性對照組2（a）和陽性對照組2（b）大鼠肝組織切片HE×20

圖8 陽性對照組3（a）和陽性對照組3（b）大鼠肝組織切片HE×20

研究表明，高低劑量的葛根素均能有效緩解慢性酒精攝入和加速酒精代謝。酒精攝入可獨立促進(jìn)肝脂肪變性的發(fā)展，進(jìn)而發(fā)展為纖維化和肝硬化。相比以姜黃素和二氫楊梅素為主要功效成分的陽性對照組來說，葛根與姜黃復(fù)合物在預(yù)防酒精性肝損傷和加速酒精代謝上有顯著效果，可能原因是葛根素和姜黃素在干細(xì)胞酒精代謝通路上提升乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶的活性，同時抑制CYP2E1的活性，減少細(xì)胞中的活性氧產(chǎn)生，降低對細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化損傷[11-14]。

3 結(jié)論

試驗通過灌胃確認(rèn)大鼠酒精的耐受度并開展各試驗組及對照組，試驗發(fā)現(xiàn)高劑量組能顯著提升大鼠的耐受時間，延長大鼠的醉酒潛伏期，葛根和姜黃復(fù)合物可顯著縮短醒酒時間，減少大鼠入睡數(shù)量，復(fù)合物可有效抑制丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性，減輕肝細(xì)胞變性、腫脹，減少脂肪滴含量，有較好的護(hù)肝作用。葛根姜黃作為常用的藥食同源的食品原料，其中的功能成分和作用機(jī)理仍需要深度研究，多靶點、多成分的特點可廣泛應(yīng)用在食品加工中，滿足市場對功能性食品的需求。