王超，張英華，張杰，李珍愛，李海軍,2,3*

1.山東福瑞達生物科技有限公司（臨沂 276700）；2.山東福瑞達醫(yī)藥集團公司（濟南 250101）；3.山東省藥學(xué)科學(xué)院（濟南 250101）

乳酸鏈球菌素（Nisin）是一種陽離子多肽，具有廣泛的抗菌活性，可有效地抑制大多數(shù)革蘭氏陽性細菌，對其孢子有強烈的抑制作用且對人體無副作用，因此作為一種安全和天然的防腐劑被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中[1-2]。Nisin于1969年被糧農(nóng)組織與世界健康組織（FAO/WHO）確定為安全的食品添加劑，已被50多個國家用作食品防腐劑[3]。但與化學(xué)制品相比，由于受控與菌種發(fā)酵能力以及企業(yè)生產(chǎn)成本的約束，Nisin還未得到更廣泛、充分的應(yīng)用。

Nisin在酸性（pH 2.0或更低）條件會有更高的活性，但乳酸鏈球菌在中性環(huán)境下才能更好地生長和代謝。Nisin在工業(yè)生產(chǎn)中，通過添加堿來中和發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乳酸，然而外界環(huán)境pH升高會導(dǎo)致Nisin的降解[4]。許多研究致力于優(yōu)化Nisin的生產(chǎn)，如改變發(fā)酵條件，包括Nisin培養(yǎng)基中的濃度、高乳酸積累、低生物量形成[5-8]、轉(zhuǎn)移Nisin表型（轉(zhuǎn)移結(jié)合質(zhì)粒）[9-10]、過表達Nisin生物合成基因集群[11-12]等方面，盡管做了上述很多方面的改進，但乳酸鏈球菌正常生長的pH與最適Nisin的pH的矛盾依舊存在?，F(xiàn)在提供一個更合理的通過增強菌株的耐酸性（消耗H+）有效提高Nisin活性的策略，研究利用合成生物學(xué)技術(shù)來強化asnH基因的表達，能夠提高乳酸鏈球菌的耐酸性以及提高Nisin的產(chǎn)量，為后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

E.coliDH5α（武漢淼靈生物科技有限公司）；質(zhì)粒pMG36e（武漢淼靈生物科技有限公司）；Streptococcus lactis（山東福瑞達生物科技有限公司）；同源重組酶購自（Vazyme）。

移液器（德國Eppendorf）；DYY-IOC型電泳儀（北京六一儀器廠）；FM70雪花制冰機（北京長流科學(xué)儀器公司）；Osterode臺式高速冷凍離心機（BIOFUGE）；Sorvall RC-6型高速冷凍離心機（Thermo Fisher）；梯度PCR儀（德國Eppendorf AG）；實時熒光定量PCR儀（Thermo Fisher Quant-StudioTM3）；pH計（METTLER TOLEDO FE28-standard）；超凈工作臺（智誠超凈工作臺ZHJHC1112C）；電轉(zhuǎn)化儀（BIO-RAD MicroPulserTM）；Gel DocTMXR+凝膠成像儀（BIO-RAD）。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pMG36e-asnH的構(gòu)建與表達

1.2.1.1 細菌菌株，質(zhì)粒和生長條件

研究中使用的菌株和質(zhì)粒除非另有說明，否則乳酸鏈球菌在30 ℃的種子培養(yǎng)基中生長，大腸桿菌生長在LB培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)，紅霉素對于大腸桿菌為800 μg/mL，對于乳酸鏈球菌為200 μg/mL。種子培養(yǎng)基（wt/vol）的準備：酵母提取物（1.5%），蛋白胨（1.5%），KH2PO4（2.0%），蔗糖（2.0%），NaCl（0.15%）和MgSO4·7H2O（0.015%），pH 7.0。乳酸在酸脅迫試驗中調(diào)節(jié)的酸脅迫培養(yǎng)基（pH 7.0，6.0，5.0和4.0）僅用蛋白胨（2%）和氯化鈉（0.1%）。Nisin中瓊脂擴散生物測定的培養(yǎng)基（wt/vol）活性測定方法：胰蛋白（0.8%），酵母提取物（0.25%），葡萄糖（0.5%），Na2HPO4（0.2%），NaCl（0.5%）和瓊脂粉（1.5%）。

1.2.1.2 重組質(zhì)粒pMG36e-asnH的構(gòu)建

根據(jù)GenBank報道的asnH的基因序列在結(jié)合pMG36e表達載體的開放閱讀框，在多克隆位點處的酶切位點進行引物設(shè)計，上游引物asnH-F：5’-TCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATGTGTGGAATTGTCGGCTTTAT-3’，下游引物asnH-R：5’-TGCAAGCTTGCATGCCTGCAGTTAAAAATTAACCACAGCAGGTTTTT-3’。擴增程序：95 ℃，3 min；95 ℃，15 s；60 ℃，15 s；72 ℃，1 min；30個循環(huán)；72 ℃，5 min。

1.2.1.3 熒光定量PCR技術(shù)

對于實時qPCR分析，使用Primer Express 5.0軟件設(shè)計了基因特異性引物（a和b）。用于qRT-PCR的寡核苷酸：a，5’-TTCTTCTCGCAAAACCAGTC-3’；b，5’-GCATACAGCGGAACAAAT-3’。分別提取不同pH發(fā)酵培養(yǎng)基（pH 7.0，6.0，5.0和4.0）中的乳酸鏈球菌的RNA進行RT-qPCR。PCR的參數(shù)：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；50 ℃，10 s；72 ℃，20 s；55個循環(huán)；72 ℃，5 min。

1.2.2 耐酸測試

菌株在50 mL種子培養(yǎng)基中30 ℃下生長靜置培養(yǎng)8 h。然后通過以8 000g離心收集細胞，用0.9% NaCl洗滌2次，重懸于50 mL酸性壓力培養(yǎng)基（pH 7.0，6.0，5.0和4.0）靜置培養(yǎng)3 h。用生理鹽水在1.5 mL離心管中進行梯度稀釋，充分混勻，然后將它們分別涂布于固體平板中，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，統(tǒng)計各個平板上菌落數(shù)。

1.2.3 乳酸鏈球菌素效價的測定參見食品安全國家標準GB 1886.231—2016《食品添加劑 乳酸鏈球菌素》[13]。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)方法

1.2.4.1 碳源對Nisin效價的影響

將FRH種子培養(yǎng)液5%的接種量分別接種于含20 g/L的蔗糖、葡萄糖、乳糖、淀粉及果糖作為唯一碳源的液體發(fā)酵培養(yǎng)基（50 mL/250 mL）中，其他各成分不變，于30 ℃靜置培養(yǎng)18 h。依次取培養(yǎng)Nisin發(fā)酵效價。

1.2.4.2 氮源對Nisin效價的影響

將FRH種子培養(yǎng)液5%的接種量分別接種于含15 g/L的不同比例的酵母粉、牛肉膏和玉米漿粉為氮源的液體發(fā)酵培養(yǎng)基（50 mL/50 mL）中，其他各成分不變，于30 ℃靜置培養(yǎng)18 h。依次取培養(yǎng)Nisin發(fā)酵效價。

1.2.4.3 磷酸鹽對Nisin效價的影響

以選出的培養(yǎng)基組分為基礎(chǔ)，在保持其他組分不變的條件下，只調(diào)整其中的磷酸鹽，配制成新的發(fā)酵培養(yǎng)基，研究考察Na2HPO4、NaH2PO4、K2HPO4、KH2PO4、(NH4)2HPO4、NH4H2PO4對FRH產(chǎn)Nisin效價的影響。選擇質(zhì)量濃度5，10，15，20，25和30 g/L，對最佳磷酸鹽的添加量進行考察優(yōu)化。

1.2.4.4 Mg2+對Nisin效價的影響

Mg2+以MgSO4的形式加到培養(yǎng)基中，Mg2+質(zhì)量濃度設(shè)為0.01，0.02，0.03，0.05，0.06和0.1 g/L，考察Mg2+對FRH重組菌生產(chǎn)Nisin的影響。

1.2.5 Box-Behnken研究設(shè)計

響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）以回歸方程作為函數(shù)估算工具，在多因子試驗中，將響應(yīng)值（因變量）與因子（自變量）之間的相互關(guān)系用二階多項式擬合，實現(xiàn)兩者關(guān)系的函數(shù)化，將其交互作用進行優(yōu)化與評價來確定生物過程的最佳培養(yǎng)條件[14]。研究選取對構(gòu)建的FRH菌株產(chǎn)Nisin會有影響的3個關(guān)鍵因子玉米漿濃度、蔗糖濃度、KH2PO4濃度等進行試驗設(shè)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pMG36e-asnH的構(gòu)建與表達

2.1.1 重組質(zhì)粒pMG36e-asnH的構(gòu)建

以乳酸鏈球菌基因組為模板，進行PCR擴增并進行測序，結(jié)果如圖1（A）所示。連接片段大小為1 874 bp，登錄GenBank比對片段與L.lactisasnH的同源性，結(jié)果為100%，確定該片段為asnH的基因序列。通過同源重組的方法進行連接，挑取單克隆進行PCR驗證，通過酶切驗證（圖1 B）及DNA測序證實。通過電穿孔轉(zhuǎn)化的方法得到pMG36e-asnH（FRH）重組菌株。

圖1 重組質(zhì)粒pMG36e-asnH的構(gòu)建

2.1.2 熒光定量PCR技術(shù)

對原始菌株與FRH菌株中的asnH基因進行RTPCR，結(jié)果如圖2所示。asnH基因在重組菌中6，9，12 h的表達量均顯著高于原始菌株，表達量分別提高0.12，1.26和2.39倍，說明asnH基因的導(dǎo)入明顯促進了asnH基因的過量表達。

圖2 原始菌（CK）和重組菌（FRH）的asnH在不同時間的表達量

2.2 耐酸測試

在Nisin生產(chǎn)過程中，酸脅迫已被證明是一種主要的限制性因素。如圖3所示，隨著pH的降低，酸性增強，野生菌株和FRH菌株的存活率都會發(fā)生一定程度的下降，但是在pH 4.0的條件下FRH菌株的存活率明顯的高于對照菌株，達到2.5倍。結(jié)果表明，過表達asnH使乳酸鏈球菌在應(yīng)對極端酸性環(huán)境方面起到了較為顯著的調(diào)節(jié)作用。

圖3 原始菌（CK）和重組菌（FRH）在不同pH下的存活率

2.3 乳酸鏈球菌素效價的測定

乳酸鏈球菌素效價的測定參照GB 1886.231—2016《食品添加劑 乳酸鏈球菌素》[13]。

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)方法

2.4.1 碳源對Nisin效價的影響

圖4顯示，在發(fā)酵培養(yǎng)基中碳含量相同的情況下，碳源為蔗糖時FRH菌株發(fā)酵產(chǎn)Nisin效價最高，達到6 359 IU/mL，蔗糖可以作為FRH發(fā)酵產(chǎn)Nisin的最適碳源。

圖4 碳源對Nisin效價的影響

2.4.2 氮源對Nisin效價的影響

圖5顯示，在發(fā)酵培養(yǎng)基中復(fù)合氮源按照不同比例添加，氮源組分按照酵母粉、牛肉膏、玉米漿粉質(zhì)量比1∶1∶2，即酵母粉、牛肉膏、玉米漿粉的含量分別為5，5和10 g/L時，F(xiàn)RH菌株的發(fā)酵產(chǎn)Nisin效價最高，達到6 859 IU/mL。

圖5 氮源對Nisin效價的影響

2.4.3 磷酸鹽對Nisin效價的影響

圖6（A）顯示，比較6種不同的磷酸鹽對FRH發(fā)酵產(chǎn)Nisin效價的影響，培養(yǎng)基中最優(yōu)磷酸鹽為KH2PO4。研究不同濃度KH2PO4對Nisin發(fā)酵效價的影響，結(jié)果如圖6（B）所示。開始時Nisin效價隨著KH2PO4濃度的增加而升高，當KH2PO4添加量達到15 g/L后，繼續(xù)添加KH2PO4，Nisin效價不再提高，KH2PO4添加量15 g/L時FRH重組菌發(fā)酵產(chǎn)Nisin效價為7 198 IU/mL。

圖6 磷酸鹽對Nisin效價的影響

2.4.4 Mg2+對Nisin效價的影響

圖7顯示：發(fā)酵培養(yǎng)基中Mg2+添加量在0～0.02 g/L的范圍時，Nisin效價增加較為明顯；Mg2+添加量范圍為0.02～0.05 g/L時，Nisin效價基本保持不變；Mg2+添加量大于0.05 g/L，Nisin效價反而下降。發(fā)酵培養(yǎng)基Mg2+的最適添加量為0.02 g/L，Nisin的效價為7 216 IU/mL。

圖7 不同Mg2+對Nisin效價的影響

2.5 Box-Behnken研究設(shè)計

Box-Behnken試驗因素及水平編碼見表1，結(jié)果見表2。

表1 Box-Behnken試驗因素及水平編碼

表2 Box-Behnken因素水平研究設(shè)計及結(jié)果

從表3的數(shù)據(jù)利用Design-Expert軟件擬合得到多元回歸模型：Y=7 013.10+81.80X1+317.50X2+394.00X3-106.00X1X2+143.50X1X3+68.25X2X3+58.58X12-314.92X22-391.42X32，其中X1、X2、X3分別代表玉米漿、蔗糖、K2HPO4編碼水平?？梢钥闯觯Ｐ蚉值達到0.005 6（P＜0.05），其顯著性大于95%，同時失擬項P值為0.088 1（P＞0.05），不顯著，說明模型的回歸性良好，這些結(jié)果反映了設(shè)計的Box-Behnken試驗?zāi)軌蜉^好地模擬出真實試驗進行的發(fā)酵培養(yǎng)基最佳組合的情況預(yù)測。

表3 回歸模型方差分析

3 結(jié)論與討論

Nisin的產(chǎn)生與生物質(zhì)密切相關(guān)，細胞生長遲緩會降低細胞生物量并限制Nisin的產(chǎn)生。研究表明酸相關(guān)模塊的過度表達通過增強抗酸能力確保了Nisin的收獲[15-16]。微生物在酸性環(huán)境中的生存主要取決于其廣泛的耐酸機制，通過改變緩沖能力來改善細胞內(nèi)pH（pHi），這個過程是通過質(zhì)子動力（PMF）泵出質(zhì)子，通過刺激堿消耗質(zhì)子排出[17]或通過改變細胞膜成分[18]，從而保護細胞免受酸損傷，pHi穩(wěn)態(tài)這個過程伴隨著受損蛋白質(zhì)/DNA的修復(fù)[19-20]。此次試驗采用基因工程技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒PMG36e-asnH，經(jīng)電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)至乳酸鏈球菌中得到1株穩(wěn)定高產(chǎn)Nisin的重組菌FRH，實時熒光定量 PCR技術(shù)確定asnH基因過量表達，增加的D-Asp酰胺化水平可以提高乳酸鏈球菌抵抗酸脅迫的能力，通過這種方法，菌株能夠避免細胞裂解并在酸性環(huán)境中頑強生長。

通過單因素研究和響應(yīng)面法優(yōu)化重組菌的發(fā)酵培養(yǎng)基組分，結(jié)果表明重組菌株FRH在優(yōu)化后的培養(yǎng)基的發(fā)酵水平比原始菌提高了27.2%。研究為Nisin的發(fā)酵菌種改造提供新的研究方法以及為發(fā)酵生產(chǎn)提供參考。