葛城，張浩，劉鋼，詹勝群，周榮杰*

澳優(yōu)乳業(yè)（中國）有限公司（長沙 410200）

嬰配乳粉作為嬰幼兒主要食物來源之一[1]，其安全性備受關注，其中孕激素類就是受到關注的熱點之一。嬰配乳粉中孕激素可分為外源性和內源性[2-4]，外源性孕激素可能是環(huán)境因素引入，也可能是為了提高奶牛產量或進行治療而人為注射引入[5]，內源性為奶牛自身在產奶過程中所分泌。孕激素的攝入將對嬰幼兒生長發(fā)育造成嚴重影響，因此對其檢測、監(jiān)控尤為重要。

食品中各種激素殘留檢測方法有高效液相色譜法[6-11]、氣相色譜法[13-14]、超高效液相色譜串聯(lián)質譜法[15-23]、氣相色譜質譜法[24-25]、酶聯(lián)免疫法[26,29]等。其中高效液相色譜法和氣相法靈敏度低，對牛奶樣品同時檢測多種激素的要求尤顯不足；氣相色譜質譜法需要通過衍生得到易于揮發(fā)的穩(wěn)定衍生物才可測定，操作復雜；酶聯(lián)免疫法是利用抗原和抗體的免疫反應進行測定的分析方法，方法選擇性強、檢出限低，但存在假陽性等問題，一般用于篩查；超高效液相色譜法串聯(lián)質譜法選擇性強、靈敏度高，通過碎片離子信息可降低發(fā)生假陽性概率，因此可用該方法檢測食品中多種激素殘留。

試驗通過建立同時檢測嬰配乳粉中多種孕激素殘留的UPLC-MS/MS法，采用乙腈沉淀、HLB固相萃取柱凈化，能對乳粉基質中的9種孕激素進行有效分析和測定，為嬰幼兒配方乳粉風險監(jiān)控方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

50 mL離心管（美國Corning公司）；Oasis? HLB固相萃取柱（200 mg/6 mL，美國Waters公司）；電動連續(xù)分液器（E3x，量程1 μL～50 mL，德國Eppendorf公司）；嬰幼兒配方乳粉（市售）。

甲醇、甲酸（液質級，德國CNW公司）；乙腈、正己烷（色譜級，德國CNW公司）。

炔諾酮標準品、21α-羥基孕酮標準品、17α-羥基孕酮標準品、甲基炔諾酮標準品、甲羥孕酮標準品、乙酸甲地孕酮標準品、甲羥孕酮乙酸酯標準品、孕酮標準品（純度均大于97%，德國Dr.E Hrenstorfer Gmbh公司）；乙酸氯地孕酮標準品（純度98.3%，壇墨質檢標準物質中心）；炔諾孕酮-d6、甲羥孕酮-d3、甲地孕酮乙酸酯-d3同位素內標（加拿大Toronto Research Chemicals）；美倫孕酮-d5同位素內標（北京BePure標準品公司）；炔諾酮-13C2同位素內標（英國劍橋同位素實驗室）；孕酮-d9同位素內標（美國Sigma-Aldrich公司）。

1.2 儀器與設備

Thermo Endura高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質譜儀（配備ESI源，美國Thermo Fisher公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）；離心機（3K15，德國Sigma公司）；電子天平（ME204E，METTLER TOLEDO）。

1.3 試驗方法

1.3.1 溶液配制

各孕激素標準儲備液（1.0 mg/mL）：分別準確稱取10.0 mg標準品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，在-18 ℃以下保存。

各孕激素同位素內標儲備液（0.1 mg/mL）：分別準確稱取1.0 mg同位素內標標準品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，在-18 ℃以下保存。

同位素內標混合液：移取0.2 mL炔諾酮-13C2儲備液、0.1 mL其余5種同位素內標儲備液于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋、定容至刻度，在-18 ℃以下保存。

孕激素混合標準工作液：移取0.5 mL炔諾酮標準儲備液、0.2 mL其余8種孕激素標準儲備液于10 mL容量瓶中，用1∶1甲醇水稀釋、定容，得到標準中間液Ⅰ；將標準中間液Ⅰ用1∶1甲醇水稀釋10倍得到標準中間液Ⅱ；將標準中間液Ⅱ用1∶1甲醇水稀釋20倍得到標準中間液Ⅲ。分別移取0.1，0.2，0.5和1 mL的標準中間液Ⅲ及0.1和0.2 mL標準中間液Ⅱ于6個10 mL容量瓶中，移取1 mL同位素內標混合液，用1∶1甲醇水定容，最終得到9種孕酮混合標準工作溶液。其中，炔諾酮質量濃度分別為2.5，5.0，12.5，25.0，50.0和100.0 ng/mL，其余8種孕激素質量濃度為1.0，2.0，5.0，10.0，20.0和40.0 ng/mL，同位素內標中炔諾酮-13C2質量濃度為20.0 ng/mL，其余5種內標均質量濃度為10.0 ng/mL。

1.4 樣品前處理

稱取5 g乳粉樣品于離心管中，加入100 μL內標溶液和5 mL 40 ℃溫水，渦旋混勻10 min，加入20 mL乙腈，渦旋提取20 min，于2 ℃以9 500 r/min離心10 min。轉移上清液至另一離心管中，上清液分別用15 mL乙腈飽和的正己烷除脂2次后，將乙腈層轉移至潔凈燒杯中，加入75 mL純水，混勻得到樣液。樣液全部過經活化后的凈化柱凈化、富集，用6 mL 10%甲醇水溶液淋洗、6 mL甲醇洗脫，洗脫液全部收集于試管中，氮吹至干，用1 mL 1∶1甲醇水溶液溶解殘渣得到樣液，經0.22 μm有機濾膜過濾后上機分析。

1.5 色譜條件與質譜條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱Waters Acquity BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流速0.300 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量10 μL；流動相A為0.1%甲酸水，流動相B為甲醇，梯度洗脫：0～8 min，A由50%變?yōu)?6%，8～11 min，A由36%變?yōu)?6%，11～12.5 min，A變?yōu)?%并保持2 min，在0.5 min內A由0變?yōu)?0%，并保持2 min，整個洗脫過程耗時17 min。

1.5.2 質譜條件

正離子模式電壓3 600 V；鞘氣40 Arb；輔助氣5 Arb；尾吹氣0 Arb；離子傳輸管溫度350 ℃；蒸發(fā)溫度300 ℃；碰撞氣1.5 mTorr；Dwell時間25 ms。

2 結果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

為使檢測方法能有良好的精密度和靈敏度，需對所有目標物質及其內標進行質譜條件優(yōu)化以獲得最佳質譜參數(shù)。稀釋所有孕激素和同位素標準儲備液配制成質量濃度1 000 ng/mL的工作液用于優(yōu)化質譜條件。該工作液通過蠕動泵進樣、正離子模式進行Q1全掃描，找到對應物質母離子。對各母離子設置不同電噴霧電壓、鞘氣、輔助氣以獲得母離子最高響應的參數(shù)，結合所有母離子參數(shù)確定離子源最終參數(shù)。在此參數(shù)下對母離子進行二級質譜掃描，設置碰撞氣體相關參數(shù)，優(yōu)化得到各母離子對應的碎片離子信息及其參數(shù)，選取豐度較高的碎片離子為定性離子和定量離子。質譜優(yōu)化結果見表1。

在所優(yōu)化得到的質譜條件下進行標準工作溶液的測試，采用1.5中的色譜條件，所有15種目標物質均有良好的響應與分離度，譜圖見圖1。

圖1 孕激素標準工作溶液提取離子色譜圖

2.2 提取步驟的優(yōu)化

嬰幼兒配方乳粉基質復雜，蛋白質、脂肪含量較高，為充分提取目標9種孕激素，需對蛋白質進行沉淀去除。乳粉中蛋白質沉淀的方式有多種，其中添加有機試劑沉淀是最為快捷的方法之一。用于沉淀蛋白的有機試劑有甲醇、乙腈、三氯乙酸、三氯甲烷等，考慮到孕激素的溶解性及化學試劑的毒害性，僅對甲醇和乙腈進行比對試驗。乳粉樣品用水溶解后，加入適量甲醇或乙腈，使得有機試劑與水體積比4∶1，渦旋使溶液充分混合，離心后發(fā)現(xiàn)，加入乙腈的樣品可得到澄清的清液，而加入甲醇的樣品得到的液體相對較為渾濁。經后續(xù)稀釋，過凈化柱發(fā)現(xiàn)，加入甲醇的樣品過柱速度慢，且大部分樣品堵塞凈化柱，無法進行后續(xù)試驗，而加入乙腈的樣品則可順利過柱。因此選用乙腈作為蛋白質沉淀劑。

另外，在沉淀蛋白的步驟中，樣液經離心后發(fā)現(xiàn)存在一層油脂層，在轉移時為避免將油脂層混入其中而增加干擾，試驗還添加去除油脂的步驟，即采用飽和乙腈的正己烷溶液對離心后的清液進行2次萃取，棄去正己烷層后最終得到待凈化樣液。

2.3 凈化柱的選擇

參考GB/T 21981—2008《動物源食品中激素多殘留檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法》，涉及的9種孕激素可采用ENVI-Carb串聯(lián)氨基柱進行凈化，但該步驟操作較為繁瑣。HLB柱為親水親脂通用型固相萃取柱，也可考慮使用該柱進行凈化樣液。為此比對2種凈化柱的試驗效果，結果如圖2所示。試驗結果表明，采用HLB固相萃取柱柱能使孕酮和孕酮-d9有更高的回收（峰面積更高），對于除孕酮和孕酮-d9以外的其余8種孕激素和其對應同位素內標，采用ENVI-Carb串聯(lián)氨基柱和采用HLB固相萃取柱并無顯著差異；另外，數(shù)據(jù)還顯示采用HLB進行凈化，9種孕激素和6種同位素內標的重復性基本上均優(yōu)于采用ENVI-Carb串聯(lián)氨基柱進行凈化（HLB的RSD更?。?。考慮到采用ENVI-Carb串聯(lián)氨基柱還需使用到易揮發(fā)的二氯甲烷，因此，選擇HLB固相萃取柱進行凈化、富集。

圖2 不同凈化柱效果比對

2.4 基質效應考察

為考察基質效應，對嬰幼兒配方乳粉和試劑空白同步進行加標，并在優(yōu)化后的條件下進行測試并記錄所有物質的峰面積，結果發(fā)現(xiàn)在嬰幼兒配方乳粉中加標所測得的峰面均顯著小于試劑空白加標樣品的峰面積，表明嬰幼兒配方乳粉基質具有較強的抑制作用，這可能是由于孕激素極性較小，而通過前處理提取后樣液中含有較多其他弱極性物質，在正離子模式下這些雜質產生的正離子物質與孕激素產生競爭而導致的結果。因此在定量方式上應采用內標定量才能更加準確。

2.5 酶解比對試驗

在食品中，各種激素在乳粉中可能會以葡萄糖醛酸結合態(tài)形式和硫酸酯形式存在，因此GB/T 21981—2008《動物源食品中激素多殘留檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法》在對食品進行前處理過程中添加β-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶對樣品進行酶解。然而，有研究表明[30]，乳粉中的雌酮、17β-雌二酮、雌二醇和雌三醇等激素存在葡萄糖醛酸結合態(tài)形式和硫酸酯形式，而且占比較高，因此添加β-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶可顯著提高乳粉中雌激素測定結果，然而對于乳粉中的孕激素，有研究表明[31-32]是否添加β-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶進行酶解對結果影響不大。為探究試驗方法測定乳粉中的9種孕激素是否需要添加β-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶，設置酶比對試驗：試驗組（酶解）+空白組（不酶解）。試驗結果如表2所示。

表2 酶解比對試驗結果 單位：μg/kg

結果顯示，試驗組和空白組中，炔諾酮、21α-羥基孕酮、甲基炔諾酮、甲羥孕酮、乙酸甲地孕酮、乙酸氯地孕酮、甲羥孕酮乙酸酯這7種孕激素均未檢出（炔諾酮＜1.0 μg/kg，其余6種＜0.4 μg/kg），17α-羥基孕酮和孕酮均有檢出，但17α-羥基孕酮低于定量限，為比對酶解的影響，仍將該孕激素的結果納入分析。經SPSS軟件進行分析，17α-羥基孕酮的試驗組和對照組的檢測結果無顯著性差異（t=1.342，P=0.228＞0.05），孕酮的試驗組和對照組檢測結果也無顯著性差異（t=1.138，P=0.298＞0.05），因此可以認為添加β-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶對試驗測定的9種孕激素不會造成顯著性影響。

2.6 方法學驗證

2.6.1 線性、定量限和檢出限

在優(yōu)化后的儀器條件下依次注入混合標準工作溶液3次，以目標孕激素與其對應內標的峰面積之比為縱坐標，目標孕激素的濃度為橫坐標作圖，得到9種孕激素的標準曲線。結果顯示，9種孕激素在其線性范圍內有良好的線性關系，判定系數(shù)均滿足R2＞0.995。通過在空白樣品中逐步減少加標量，平行試驗10次，直至所得目標物質的含量小于rSN=10得到方法定量限，小于rSN=3得到方法檢出限。9種孕激素的線性范圍、檢出限、定量限見表3。

2.6.2 正確度和精密度

方法的正確度通過加標回收進行考察。對樣品進行10次低（SLOD）、3次中（2×SLOD）、3次高（10×SLOD）3個水平進行加標測試，其中，炔諾酮的加標量分別為1，2和10 μg/kg，其余8種孕激素的加標量分別為0.4，0.8和4 μg/kg。10次低濃度水平加標測試數(shù)據(jù)為精密度測試數(shù)據(jù)，所有濃度水平的加標測試數(shù)據(jù)為正確度數(shù)據(jù)。結果見表3。9種孕激素在各自線性范圍內的加標回收率及精密度滿足GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規(guī)范 食品理化檢測》的要求。

2.7 實際樣品檢測

采用所建立的方法對市售嬰幼兒配方乳粉樣品進行檢測，結果如表2所示。實際樣品中僅檢出17α-羥基孕酮（含量為0.219 6～0.346 4 μg/kg，低于定量限0.4 μg/kg）及孕酮（含量為3.034 1～3.834 1 μg/kg，高于定量限0.4 μg/kg），炔諾酮、21α-羥基孕酮、甲基炔諾酮、甲羥孕酮、乙酸甲地孕酮、乙酸氯地孕酮、甲羥孕酮乙酸酯均未檢出。檢測結果在市場調查范圍以內。

3 結論與討論

采用超高效液相色譜串聯(lián)質譜法建立嬰幼兒配方乳粉中9種孕激素的檢測方法。方法考察樣品前處理中采用不同有機沉淀劑、不同凈化柱對結果的影響，以及β-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶對檢測結果的影響。研究表明，采用乙腈作為蛋白質沉淀劑、HLB固相萃取柱進行富集和凈化能獲得良好效果；采用β-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶酶解與不進行酶解對于這9種孕激素來說并無顯著影響。該方法操作簡單、便捷，同時有良好的準確性和精密度，定量限低，適用于嬰幼兒配方乳粉中這9種孕激素殘留的測定，可為食品安全監(jiān)控提供參考。