杜強(qiáng)，吳林菁*，曾圣，陳飛雄，趙飛，王艷艷

1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所（貴陽(yáng) 550025）；

2.貴州省特種水產(chǎn)工程技術(shù)中心（貴陽(yáng) 550025）；3.貴州醫(yī)科大學(xué)（貴陽(yáng) 550025）

鯉科魚(yú)（Cyprinidae），屬鯉形目，全世界共有鯉科魚(yú)類(lèi)210屬3 700種以上。鯉科魚(yú)類(lèi)分布在底棲或水中層，為卵生，雜食、草食或肉食魚(yú)類(lèi)，是魚(yú)類(lèi)中分布最廣、種類(lèi)最多的一個(gè)科目[1]。我國(guó)自古有養(yǎng)殖鯉科魚(yú)的歷史，特別是在《中華人民共和國(guó)漁業(yè)法》確立“以養(yǎng)為主”的漁業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略以來(lái)，極大地促進(jìn)養(yǎng)殖技術(shù)發(fā)展，養(yǎng)殖產(chǎn)量和出口規(guī)模大幅提高，在水產(chǎn)品養(yǎng)殖和出口貿(mào)易中占據(jù)重要地位[2]。21世紀(jì)以來(lái)，中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展，據(jù)2020年《中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》數(shù)據(jù)，鯉科魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)量超過(guò)全國(guó)淡水養(yǎng)殖主要魚(yú)類(lèi)總產(chǎn)量的76%，是中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖主要品種[1]。伴隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，隨之出現(xiàn)品質(zhì)不一等問(wèn)題，這一定程度上制約了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的整體發(fā)展。

水產(chǎn)品的品質(zhì)質(zhì)量分析主要依靠單項(xiàng)指標(biāo)按照國(guó)標(biāo)檢測(cè)分析，該定量分析方法在全面反映其品質(zhì)方面穩(wěn)定性存在不知。相較于單項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)，逐一檢測(cè)分析所需試驗(yàn)試劑較多、操作者判別差異及較長(zhǎng)試驗(yàn)周期，指紋圖譜結(jié)合色譜和光譜等技術(shù)能獲得水產(chǎn)品品化學(xué)成分的特征譜圖，是水產(chǎn)品產(chǎn)地鑒別、真?zhèn)舞b別、優(yōu)劣鑒別的有效工具，還可用于生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)量控制，包括追蹤化學(xué)成分的變化、監(jiān)測(cè)各批次產(chǎn)品質(zhì)量的一致性和穩(wěn)定性[3-4]。高效液相色譜是研究指紋圖譜應(yīng)用最廣泛的方法之一，具有分離效能高、分析速度快及儀器自動(dòng)化等特點(diǎn)，被應(yīng)用于大多數(shù)的非揮發(fā)、熱不穩(wěn)定的化合物的研究，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物藥材品質(zhì)研究中[2-3]，在部分特色水產(chǎn)品[如大黃魚(yú)（Larimichthys crocea）、馬糞海膽（Hemicentrotus pulcherrimus）和鮑魚(yú)（Abalone）等][4-8]的質(zhì)量控制和產(chǎn)地溯源中也可見(jiàn)報(bào)道。

因此，試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)部分鯉科魚(yú)樣品，建立相關(guān)鯉科魚(yú)HPLC指紋圖譜，并通過(guò)聚類(lèi)分析、主成分分析對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，旨在為水產(chǎn)品質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國(guó)）；EYELA FD-1000真空冷凍干燥機(jī)[西崎貿(mào)易（成都）有限公司]；KQ-250B超聲清洗機(jī)（上海五久自動(dòng)化設(shè)備有限公司）；BSA323S電子天平（上海皖衡電子儀器有限公司）。

甲醇、乙酸乙酯[均為分析純，科密歐試劑公司（天津）]；乙腈[色譜純，天地公司（美國(guó)）]。試驗(yàn)所用樣品經(jīng)貴州省水產(chǎn)研究所李正友研究員鑒定為鯉科類(lèi)魚(yú)Cyprinus，分別采集于貴州省內(nèi)遵義、銅仁、畢節(jié)等地（表1）。

表1 鯉科魚(yú)的來(lái)源、相似度

1.2 色譜條件

采用Diamousil plus C18-A（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫：0～7 min，38% A；7～15 min，38%～81% A；15～35 min，81%～94% A；35～40 min，94%～100% A。在波長(zhǎng)230 nm、進(jìn)樣量20 μL、柱溫30℃、流速0.6 mL/min條件下進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 供試品溶液的制備

將魚(yú)體背部肌肉冷凍干燥24 h后，打粉過(guò)0.250 mm孔徑（60目）篩；稱(chēng)取1 g肌肉粉末，用乙酸乙酯定容至50 mL，超聲提取30 min，過(guò)濾，濾液水浴60 ℃揮干溶劑，取10 mL乙腈溶解濾渣，超聲萃取20 min，按5 000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)0.46 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

1.4 方法學(xué)考察

參照以往對(duì)HPLC圖譜研究方法，按表2分別進(jìn)行相關(guān)項(xiàng)目。

表2 HPLC指紋考察項(xiàng)目及結(jié)果

接表2

2 結(jié)果與分析

2.1 指紋圖譜的建立

將記錄好的13批鯉科魚(yú)肌肉供試品（溶液）HPLC圖譜以一定格式（AIA）順序?qū)搿吨兴幧V指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012A版》[9]軟件，以S1號(hào)樣品的圖譜為參照?qǐng)D譜，時(shí)間漂移值設(shè)定為0.1，選用中位數(shù)法自動(dòng)匹配譜峰，并生成相關(guān)圖譜（圖1）。所得圖譜中，以共有的15號(hào)色譜峰為參比峰，以其保留時(shí)間為1，選擇峰面積較大峰位較居中的圖譜，確定18個(gè)共有指紋峰，并對(duì)其相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行計(jì)算（SRSD值均＜3.0%），符合指紋圖譜的分析要求[10]，見(jiàn)表3和表4。

圖1 試驗(yàn)鯉科魚(yú)的HPLC對(duì)照?qǐng)D譜（A）及疊加特征圖譜（B）

表3 試驗(yàn)鯉科魚(yú)指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表4 試驗(yàn)鯉科魚(yú)指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積

接表4

2.2 相似度評(píng)價(jià)

以對(duì)照?qǐng)D譜的相似度為1，分別對(duì)照樣品HPLC圖譜的相似度（結(jié)果見(jiàn)表1）。與對(duì)照組圖譜相比，13批鯉魚(yú)樣品的相似度在0.861～0.990之間，表明各產(chǎn)地鯉魚(yú)品質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，如圖1疊加HPLC特征圖譜所示，試驗(yàn)鯉魚(yú)的主要組成成分基本相同，但各組成成分在含量上有一定的差異。其中樣品S5，S7和S8（貴州惠水）的相似度比較低，另外9個(gè)批次的鯉科魚(yú)相似度較高（相似度＞0.9）。

2.3 聚類(lèi)分析

聚類(lèi)分析是一種廣泛應(yīng)用于植物、中藥材、動(dòng)物鑒別、品種分類(lèi)和質(zhì)量評(píng)價(jià)等方面的研究分析方法[11-12]，通過(guò)該方法探討對(duì)比試驗(yàn)樣本之間的相關(guān)度及品質(zhì)差異是常用的研究手段。

從指紋圖譜中共有色譜峰代表分析樣品均含有的化學(xué)成分，所在峰面積表示相應(yīng)的成分含量。試驗(yàn)采用組間連接法，通過(guò)余弦距離計(jì)算樣品間距離，在SPSS 19.0軟件中將各樣品共有峰面積作為變量導(dǎo)入，對(duì)13批鯉科魚(yú)樣品運(yùn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析，結(jié)果如圖2所示。判別條件距離為25時(shí)，試驗(yàn)所分析的13批鯉科魚(yú)樣品被分為兩類(lèi)，其中S5，S6，S7，S8和S13聚為一類(lèi)，其余8個(gè)產(chǎn)地樣品歸為另一類(lèi)。因此，采用HPLC指紋圖譜，結(jié)合聚類(lèi)分析和相似度分析可為初步判斷所用鯉科類(lèi)所屬種類(lèi)提供參考，但未能區(qū)分不同產(chǎn)地的鯉科魚(yú)。

圖2 鯉科魚(yú)HPLC 指紋圖譜共有峰峰面積的聚類(lèi)分析

2.4 主成分分析

2.4.1 主成分因子特征值、方差貢獻(xiàn)率分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)試驗(yàn)樣品主成分因子分析，結(jié)果見(jiàn)表5。以特征值＞1為標(biāo)準(zhǔn)，其中前5個(gè)主成分因子的特征值分別為9.025，2.675，2.225，1.287和1.040，方差貢獻(xiàn)率分別為50.141%，14.861%，12.361%，7.152%和5.778%，累積方差貢獻(xiàn)率為90.292%＞90%，說(shuō)明通過(guò)引用前5個(gè)主成分即可代表樣品94%以上的信息，證明該組數(shù)據(jù)有突出的成分可以依據(jù)，適用于主成分分析。故通過(guò)前5個(gè)主成分因子分別對(duì)13批鯉魚(yú)樣品的共有成分進(jìn)行評(píng)價(jià)，詳見(jiàn)表6。由表6可知，主成分因子1可反映成分9，10，11，12，13，14，15，16，17和18的信息，主成分因子2可反映成分1，2，3，4和6的信息，主成分因子3可反映成分2，3和9的信息，主成分因子4可反映成分1，7，8和9的信息，主成分因子5可反映成分4和8的信息。以上述因子作變量繪制載荷圖（圖3）。由圖3可知，載荷圖結(jié)果與初始因子載荷矩陣結(jié)果相同，距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)的點(diǎn)為主成分因子1，2，3，4和5中權(quán)重值較大的成分。

表5 5個(gè)主成分因子的特征值和方差貢獻(xiàn)率

表6 旋轉(zhuǎn)后的主因子載荷矩陣表

圖3 載荷圖

2.4.2 綜合質(zhì)量評(píng)分

通過(guò)5個(gè)主成分因子對(duì)13批鯉魚(yú)樣品進(jìn)行綜合評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)表7。主成分因子綜合得分（major factor synthesis score，MFSC）中S9號(hào)鯉魚(yú)樣品（正安縣正南河）最高，該批樣品中1和9～18共11個(gè)主成分的含量相對(duì)較高，相對(duì)而言整體質(zhì)量較好[13]。

表7 主成分因子得分及排序

3 討論

3.1 提取方法的考察

參照水產(chǎn)品指紋圖譜相關(guān)研究，試驗(yàn)對(duì)70%甲醇、甲醇、乙醇等6種提取溶劑進(jìn)行篩選，得出以乙醇提取的樣品溶液圖譜出峰信息量較大，且基線(xiàn)較為平穩(wěn)?？疾旎亓骱统曁崛?種提取方式，結(jié)果表明2種方式得出的色譜圖差異不大，由于回流提取耗時(shí)較長(zhǎng)、步驟較繁瑣，所以選定超聲方法進(jìn)行提取；超聲提取方面，考察30 min（超聲1次），50 min（超聲2次，第1次30 min、第2次20 min）以及120 min（超聲4次，每次30 min）3個(gè)提取時(shí)間，對(duì)比得出超聲提取80 min（超聲2次，第1次30 min、第2次20 min）的提取效果圖譜信息更完整。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

試驗(yàn)通過(guò)對(duì)比乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.05%磷酸、乙腈-0.01%磷酸這4種流動(dòng)相洗脫體系，得出以乙腈-0.01%磷酸體系的效果較好（色譜峰的峰形和分離度較好、色譜峰較多）。比較2種高效液相色譜柱Diamousil plus C18-A（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Agilent ZORBAX SB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）的色譜圖，結(jié)果顯示Diamousil plus C18-A（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱的分離度和峰形效果較好，圖譜基線(xiàn)較平穩(wěn)。分別考察柱溫20～35 ℃時(shí)對(duì)色譜峰分離度的影響，得出柱溫30 ℃時(shí)效果較佳。比較流速0.6～1.2 mL/min對(duì)色譜圖峰形的影響，結(jié)果以0.6 mL/min時(shí)的峰形更對(duì)稱(chēng)。對(duì)波長(zhǎng)210，230，254，280，310和360 nm進(jìn)行考察，對(duì)比得出在230 nm下圖譜中各色譜峰響應(yīng)值更高，基線(xiàn)較為平穩(wěn)，整體信息更全面，故選擇230 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 相似度、聚類(lèi)分析及主成分分析討論

來(lái)源于不同產(chǎn)地的鯉科魚(yú)HPLC指紋圖譜有18個(gè)共有峰，從結(jié)果來(lái)看，三者（相似度、得分圖及綜合得分）相互印證，相似度較低的S7樣品（貴州惠水縣養(yǎng)殖的黃河鯉），得分圖中較離群，綜合得分較差，排名靠后。結(jié)合得分圖情況，13批鯉科魚(yú)主成分有一定差異，同一品種不同產(chǎn)地的樣品魚(yú)如S3和S12（野生裂腹魚(yú)）存在一定差異，而同一品種在不同產(chǎn)地的樣品魚(yú)如S1和S9、S5和S13（中華倒刺鲃、清水江鯉）的品質(zhì)相似，同一品種、同一地點(diǎn)的樣品魚(yú)如S5和S13（清水江鯉）相似度存在差異。這與聚類(lèi)分析結(jié)果有一定差異，原因可能是主成分分析以絕對(duì)峰面積為主，而聚類(lèi)分析主要是以相對(duì)峰面積為主。當(dāng)然，魚(yú)類(lèi)品質(zhì)的影響因素是多方面的，比如環(huán)境、餌料、生長(zhǎng)年限等，因此建立水產(chǎn)品特有專(zhuān)屬性和特征性的評(píng)價(jià)體系是很有必要的。綜合此次試驗(yàn)聚類(lèi)分析和主成分分析的結(jié)果，結(jié)合圖譜峰面積數(shù)據(jù)，可把這13批鯉科魚(yú)分為三類(lèi)，第一類(lèi)為S1，S8和S9，第二類(lèi)為S4，S10，S11和S12，第三類(lèi)為S2，S3，S5，S6，S7和S13。相對(duì)來(lái)說(shuō)此次試驗(yàn)樣品魚(yú)品質(zhì)質(zhì)量排序?yàn)榈谝活?lèi)＞第二類(lèi)＞第三類(lèi)。

3.4 鯉科魚(yú)指紋圖譜評(píng)價(jià)

影響水產(chǎn)品品質(zhì)的因素主要包括種質(zhì)特性、養(yǎng)殖環(huán)境、飼喂餌料及生理狀態(tài)[14-15]。鯉科魚(yú)類(lèi)是我國(guó)養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)之一，而由于遺傳品種及養(yǎng)殖技術(shù)等差異，市場(chǎng)上售賣(mài)的鯉科魚(yú)的口感和價(jià)格差異較大，在此過(guò)程中難免出現(xiàn)濫竽充數(shù)，將養(yǎng)殖品作為野生品出售的情況，這嚴(yán)重影響了市場(chǎng)的合理發(fā)展。因此，對(duì)于水產(chǎn)品尤其是特色經(jīng)濟(jì)鯉科魚(yú)類(lèi)建立一種可行的方法來(lái)判斷區(qū)別魚(yú)類(lèi)品質(zhì)和質(zhì)量控制很有必要。隨著人類(lèi)社會(huì)對(duì)水產(chǎn)品需求量的增大及食品安全意識(shí)的加強(qiáng)，水產(chǎn)品品質(zhì)質(zhì)量控制越顯重要。結(jié)合以往關(guān)于有效的食藥品質(zhì)量控制模式研究，指紋圖譜作為因具有科學(xué)的理論依據(jù)和實(shí)踐累積獲得食品藥品質(zhì)量控制業(yè)界的一致認(rèn)可[16-17]。指紋圖譜的優(yōu)勢(shì)在于在主成分未明確情況下，仍可以得到可靠充分的含量類(lèi)別和數(shù)量信息，從而控制食藥品質(zhì)量[18-19]。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[20-25]報(bào)道，不同生長(zhǎng)環(huán)境和養(yǎng)殖方式的水產(chǎn)品在脂肪酸、磷脂等成分含量方面差異明顯，而這些差異在HPLC圖譜中有所體現(xiàn)，這與以往對(duì)其他水產(chǎn)品的研究中得出的結(jié)果相同。所以，HPLC指紋圖譜可以很好地彌補(bǔ)常規(guī)品質(zhì)質(zhì)量控制方法的缺陷，應(yīng)用于水產(chǎn)品的產(chǎn)品質(zhì)質(zhì)量控制。

4 結(jié)論

試驗(yàn)根據(jù)鯉科魚(yú)肌肉中化學(xué)組成物質(zhì)種類(lèi)和含量差異建立其指紋圖譜，結(jié)合相似度分析、聚類(lèi)分析，為鯉科魚(yú)品質(zhì)質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。在特色經(jīng)濟(jì)鯉科魚(yú)的養(yǎng)殖銷(xiāo)售過(guò)程中，能較好地區(qū)分養(yǎng)殖品質(zhì)量，規(guī)范水產(chǎn)品行業(yè)發(fā)展。然而，試驗(yàn)所用的樣品數(shù)和產(chǎn)地來(lái)源相對(duì)較少，具有一定局限性，后續(xù)可通過(guò)擴(kuò)大樣本量，收集全國(guó)各地不同產(chǎn)地樣品，進(jìn)一步完善相關(guān)試驗(yàn)因子，從而對(duì)鯉科魚(yú)的質(zhì)量進(jìn)行更全面的評(píng)價(jià)和控制，更好地為水產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展保駕護(hù)航。