曾林暉，熊增星，周曉晴，呂小麗，唐麗君*

江西省檢驗檢測認證總院食品檢驗檢測研究院（南昌 330001）

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜或蜜露，與自身分泌物混合后經(jīng)充分釀造形成的天然甜味物質(zhì)[1]，其糖類和水分占蜂蜜質(zhì)量的70%～95%[2-3]，氨基酸、礦物質(zhì)，酚類物質(zhì)占蜂蜜質(zhì)量的5%[4]。由于酚類具有抗菌、消炎、抗氧化等生物學功能[5-6]，蜂蜜的市場需求越來越大，導致市場上蜂蜜質(zhì)量良莠不齊，因此急需開發(fā)更科學合理評定蜂蜜品質(zhì)的方法，以補充傳統(tǒng)評價方法的不足。

近年來，酚類物質(zhì)的成分分析、活性研究和溯源等[7-10]成為研究熱點，主要的分析方法有液相色譜法[11-12]、氣相色譜-質(zhì)譜法[13-14]和液相色譜-質(zhì)譜法[15-18]。蜂蜜中酚類物質(zhì)的富集凈化方法主要有大孔樹脂吸附法和固相萃取法，大孔樹脂吸附法處理步驟復雜且不夠環(huán)保[19-20]，對酚酸類物質(zhì)的保留能力偏弱[21]。Sun等[22]利用離子交換固相萃取柱富集蜂蜜中酚類物質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)萃取柱離子強度對組分的吸附有較大影響，但研究選用的標志物太少，評價的全面性不足。侯建波等[23]建立16種蜂蜜內(nèi)源性物質(zhì)的分析方法，但缺少對酚酸類組分的分析，且對蜂蜜中酚類物質(zhì)的研究缺少對其抗氧化能力的報道。

試驗考察了5種固相萃取柱對蜂蜜中15種酚類物質(zhì)的富集能力差異，建立了HPLC-MS/MS同時測定蜂蜜中15種常見酚類物質(zhì)的方法，并評價了蜂蜜中酚類物質(zhì)的抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

蜂蜜（江西汪氏蜜蜂園）；沒食子酸（含量99.5%）、綠原酸（含量99.8%）、表兒茶素（含量99.41%）、兒茶素（含量98.1%）、咖啡酸（含量99.97%）、蘆?。ê?8.24%）、p-香豆酸（含量98.58%）、阿魏酸（含量99.21%）、槲皮素（含量98.4%）、芹菜素（含量98.8%）、染料木素（含量99.72%）、山奈酚（含量98.5%）、短葉松素（含量99.98%）、白楊素（含量99.8%）、高良姜素（含量99.98%）：美國SIGMA公司；DPPH（福州飛勁生物科技有限公司）；FRAP試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；福林酚試劑（上海麥克林生化科技有限公司）；甲醇、甲酸（色譜純，美國霍尼韋爾公司）；硝酸鋁、醋酸鉀、碳酸鈉（均為國產(chǎn)分析純）。

Oasis HLB固相萃取柱（150 mg/6 mL）、Oasis MAX固相萃取柱（150 mg/6 mL）、Oasis WAX固相萃取柱（150 mg/6 mL）、Oasis MCX固相萃取柱（150 mg/6 mL）、Oasis SAX固相萃取柱（150 mg/6 mL）：美國沃特世公司。

安捷倫6495A液相色譜-質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）；UV-2600紫外可見光分光光度計（日本島津公司）；ELx800光吸收酶標儀（美國伯騰儀器公司）；SL8離心機（美國Thermo Fisher公司）；PHS-3C pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；Quintix 213-1 CN電子分析天平（德國賽多利斯集團）；Vortex Genie 2多用途渦旋混合器（美國Scientific Industries公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液的配制

1.2.1.1 標準儲備液的配制

精密稱取約5 mg各標準物質(zhì)，用甲醇溶解并定容至10 mL，于-18 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 混合標準溶液的配制

精密吸取一定體積的單標標準儲備液于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容。各物質(zhì)的質(zhì)量濃度均為1 μg/mL。

1.2.1.3 混合標準工作溶液的配制

分別吸取0.05，0.10，0.20，0.50，1.00和2.00 mL上述混合標準溶液于10 mL容量瓶中，用初始流動相定容，得不同濃度的系列標準工作溶液。

1.2.2 樣品的前處理

1.2.2.1 HLB固相萃取柱富集方法[24]

稱取10 g蜂蜜樣品溶解于50 mL蒸餾水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)至pH 2.0，離心后取上清液過HLB柱（使用前用3 mL甲醇，3 mL蒸餾水（pH 2.0）活化），用4 mL蒸餾水（pH 2.0）淋洗，吹出柱內(nèi)殘液，用5 mL 5%的甲酸-甲醇溶液洗脫后于40 ℃氮氣吹干，用2 mL甲醇溶解，待測。

1.2.2.2 MAX、SAX、WAX、MCX固相萃取柱富集方法[24]

稱取10 g蜂蜜樣品溶解于50 mL蒸餾水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)至pH 7.0，離心后取上清液過柱[使用前均用3 mL甲醇，3 mL蒸餾水（pH 7.0）活化]，用4 mL蒸餾水（pH 7.0）淋洗，吹出柱內(nèi)殘液，用5 mL 5%的甲酸-甲醇溶液洗脫后于40 ℃氮氣吹干，用2 mL甲醇溶解，待測。

1.2.2.3 回收率測定

稱取10 g蜂蜜樣品溶解于50 mL蒸餾水中，加入100 μL質(zhì)量濃度1 μg/mL的混合標準溶液，分別按照1.2.2.1和1.2.2.2進行前處理，按照以下條件進液相色譜-質(zhì)譜分析。

1.2.3 分析方法

1.2.3.1 色譜條件

色譜柱Shim-Pack Gist-HP（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進樣體積5 μL；梯度洗脫程序見表1。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源；掃描模式為負離子模式；監(jiān)測方式為多反應監(jiān)測（MRM）；干燥器溫度250 ℃；干燥器流速13 L/min；霧化氣壓力35 psi；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流速12 L/min；毛細管電壓3 500 V；其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 酚類物質(zhì)質(zhì)譜參數(shù)

1.2.4 抗氧化活性研究

1.2.4.1 DPPH自由基清除試驗[25]

以Trolox為陽性對照，分別測定5，10，15，20，25和30 μg/mL的Trolox和總黃酮濃度的蜂蜜提取液對0.2 mmol/L的DPPH自由基清除率。分別確定達到同一自由基清除率時Trolox和蜂蜜黃酮的濃度，濃度越低表明其自由基清除能力越強，即抗氧化能力越強。

在96孔板的各檢測孔內(nèi)分別加入100 μL 0.2 mmol/L的DPPH溶液，標準檢測孔內(nèi)加入100 μL各濃度的Trolox標準溶液；樣品檢測孔內(nèi)加入100 μL各濃度的蜂蜜酚類提取液，混合均勻后經(jīng)37 ℃避光30 min，用酶標儀于517 nm處測定吸光度。按式（1）計算自由基清除率，以清除率為縱坐標，樣品濃度為橫坐標做圖。

式中：A樣品為樣品吸光度；A空白為空白吸光度。

1.2.4.2 FRAP總抗氧化能力測定[26]

以Trolox為陽性對照，分別測定20，40，60，100，200和250 μg/mL的Trolox和總黃酮濃度的蜂蜜提取液對鐵離子的還原能力。繪制Trolox和蜂蜜黃酮的還原力曲線，同一濃度時吸光度越大，表示還原力越強。

在96孔板的各檢測孔內(nèi)分別加入180 μL的FRAP工作液，標準檢測孔內(nèi)加入10 μL各濃度的Trolox標準溶液；樣品檢測孔內(nèi)加入10 μL各濃度的蜂蜜酚類提取液，混合均勻后經(jīng)37 ℃避光30 min，用酶標儀于593 nm測定吸光度。以吸光度為縱坐標，樣品濃度為橫坐標作圖。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件作圖，所有數(shù)據(jù)均為3次重復試驗的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

酚酸和黃酮類化合物由于具有羥基的緣故，在正、負離子模式下都具有很好的響應強度。但是在正離子模式下產(chǎn)生的碎片離子較多，而在負離子模式下失去氫后產(chǎn)生穩(wěn)定的分子離子峰[M-H]-[27]，因此研究選定負離子模式。根據(jù)參考文獻[23, 27]，選定各目標組分的母離子后，利用目標物單個標準溶液優(yōu)化碎片離子和碰撞能，優(yōu)化后各目標物質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.2 色譜柱的選擇

研究Eclipse Plus C18RRHD（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Shim-Pack Gist-HP（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）和BEH HILIC（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）這3種色譜柱的分離情況。結(jié)果表明，目標物在RRHD柱上的保留時間較長，后續(xù)密集出峰，增大背景噪音，影響后續(xù)測定。待測物各組分在Gist-HP柱上均實現(xiàn)較好分離，特別是對于兒茶素和表兒茶素這種定量和定性離子都一致的同分異構(gòu)體，分離效果良好，而HILIC柱的分離效果和待測物的響應強度均弱于Gish-HP柱，可能是HILIC柱的固定相三唑基具有陰離子交換作用，此作用對酸性化合物有較強的保留能力。因此選擇Gist-HP柱進行待測物的分離，標準品和樣品的總離子流圖見圖1。

2.3 固相萃取柱的優(yōu)化

通過往樣品中加入一定濃度的混合標準溶液，按上述方法富集后，利用HPLC-MS/MS測定各組分含量，計算回收率，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，不同固相萃取柱對各組分的預富集能力差異極大，MCX柱對黃酮類組分吸附性能較好，對酚酸的吸附性能較差，其中沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、p-香豆酸的回收率分別只有58.1%，34.2%，44.4%和52.4%。離子交換柱的離子強度對目標物的回收率也有顯著影響，SAX柱對芹菜素、染料木素、山奈酚、白楊素的回收率只有77.4%，44.7%，70.9%和51.8%，遠低于其他固相萃取柱，具有離子強度越強、回收率越低的特點，且陰離子交換柱對槲皮素的預富集能力都不強。HLB柱對各組分的回收率介于77.5%～117.2%之間，表現(xiàn)出穩(wěn)定的吸附性能和較強的適用性，這是由于HLB柱的吸附劑具有親水和親脂的雙重保留特性[28]，對酚酸和黃酮都具有良好的吸附效果。這與文獻[29]中報道的MAX柱凈化效果和HLB柱相當?shù)慕Y(jié)論存在差異，可能是由于文獻中用于測試固相萃取柱回收率的組分較少，不具有普遍代表性，而且凈化過程也存在差異。

圖2 不同固相萃取柱對15種酚類物質(zhì)回收率的影響

2.4 方法學考察

2.4.1 線性范圍和靈敏度

將經(jīng)過前處理的樣品溶液在優(yōu)化后的條件下進HPLC-MS/MS分析。以峰面積為橫坐標，目標物濃度為縱坐標，建立標準曲線，各目標物在各自濃度范圍內(nèi)，R2值均大于0.995，并分別以信噪比3和10時，確定待測組分的檢出限和定量限，結(jié)果如表3所示。

表3 標準品的標準曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.4.2 回收率和精密度

由于樣品中不同程度地含有被測組分，且有些含量遠超過該物質(zhì)的定量限，因此有本底值的組分按照含量的0.5，1和5倍進行加標試驗，沒有本底值的組分按照定量限的1，2和10倍進行加標試驗，平行測定6次，結(jié)果見表4。方法的平均回收率為80.2%～113.5%，相對標準偏差為3.46%～7.32%，滿足蜂蜜中酚類物質(zhì)的定量分析要求。

表4 蜂蜜中15種酚類物質(zhì)的加標回收率試驗（n=6）

2.5 抗氧化活性測定

2.5.1 DPPH自由基清除能力

由圖3可知，DPPH自由基清除率隨著樣品濃度的升高而增高，在試驗濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)量效關(guān)系。相同濃度下Trolox的自由基清除能力較蜂蜜黃酮強，DPPH自由基清除率達到60%時所需要的Trolox和蜂蜜黃酮的質(zhì)量濃度分別為17.2和24.5 μg/mL，由此可知，蜂蜜黃酮具有較強的DPPH自由基清除能力，但弱于Trolox。

圖3 Trolox和蜂蜜黃酮對DPPH·的清除能力

2.5.2 FRAP總抗氧化能力

由圖4可知，在試驗濃度范圍內(nèi)，吸光度隨著蜂蜜黃酮和Trolox濃度的升高而增大，呈現(xiàn)量效關(guān)系。在相同濃度下，Trolox的還原能力強于蜂蜜黃酮，吸光度達到0.6時，所需的Trolox和蜂蜜黃酮的質(zhì)量濃度分別為123.2和182.8 μg/mL，由此可知，蜂蜜黃酮具有良好的總抗氧化能力，但弱于Trolox。

圖4 Trolox和蜂蜜黃酮總抗氧化能力

3 結(jié)論

試驗優(yōu)化固相萃取凈化、色譜分離、質(zhì)譜定性條件，將固相萃取與液相色譜-質(zhì)譜相結(jié)合，建立同時測定蜂蜜中15種酚類物質(zhì)的檢測方法。方法前處理簡單、快速，可高效測定蜂蜜中的酚類物質(zhì)，為更科學合理評定蜂蜜品質(zhì)提供技術(shù)支撐。利用HLB固相萃取柱富集得到的蜂蜜酚類物質(zhì)具有較強的DPPH自由基清除能力和FRAP總抗氧化能力，表明蜂蜜是一種優(yōu)良的天然抗氧化資源。