翁子依，段義君，肖瑞，楊慧杰，糜志遠(yuǎn)，張佳*

湖北工業(yè)大學(xué)（武漢 430068）

金銀花為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonicaThunb.）的干燥花蕾或帶初開的花[1]，在我國主要產(chǎn)于華東、中南、西南及河北、山西、遼寧、陜西、甘肅等地。金銀花的藥源植物的花、莖、葉均可入藥。性味甘、寒，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效。金銀花常用于外感咳嗽發(fā)熱、敗血癥、腮腺炎、麻疹、菌痢、腸炎、闌尾炎、中暑感冒、外傷感染、腸道傳染等疾病[2]。金銀花的主要化學(xué)成分有揮發(fā)油、有機(jī)酸、黃酮類及三萜類，金銀花化學(xué)成分復(fù)雜，具有多種功能性成分，主要包括有機(jī)酸類、揮發(fā)油、黃酮及其苷類[3-4]。金銀花中抗菌消炎的主要成分為有機(jī)酸，其中綠原酸是主要有效成分[5]。綠原酸又名咖啡鞣酸，是一種廣泛存在于植物中的多酚類化合物[6]，具有抗菌[7-8]的作用。其藥理作用有抑菌[9]、抗病毒[10]、抗炎[11-12]解熱、抗氧化[13-14]、降血脂[15]、降血糖[16]、免疫調(diào)節(jié)[17]、抗腫瘤[18]等。此外，金銀花多糖對葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎有保護(hù)作用[19]，金銀花果膠可促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生，可能是治療阿爾茲海默病的潛在靶向藥物[20]。已有一些對綠原酸含量測定方法的文獻(xiàn)報道，鄭雪媚[21]利用高效液相色譜儀測定銀黃甘顆粒中金銀花有效成分綠原酸的含量。肖文平等[22]利用紫外分光光度法測定金銀花中綠原酸的含量。金銀花提取物綠原酸的藥代動力學(xué)報道較少，邢曉玲等[23]研究銀黃顆粒中綠原酸在大鼠血漿的藥代動力學(xué)。吳磊等[24]研究大鼠灌胃清熱養(yǎng)心顆粒后血漿中咖啡酸、綠原酸的藥代動力學(xué)。綠原酸的提取方法也各不相同，Xu等[25]基于高速切均質(zhì)機(jī)Ultra-Turrax的超聲波輔助提取金銀花中5種有機(jī)酸，Liu等[26]通過乙醇/鹽水溶液兩相法從金銀花中選擇性分離黃酮和糖類。試驗(yàn)使用甲醇超聲提取綠原酸，采用高效液相色譜法分別測定小鼠血漿、肝、腎中金銀花提取物含量變化，并對其進(jìn)行小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究，為更進(jìn)一步挖掘金銀花的藥用價值提供一定參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設(shè)備

Thermo Ultimate 3000型雙三元液相色譜儀、VWD-3100型雙光束可變波長紫外-可見檢測器、Wps-3000sl·Analytical型全自動進(jìn)樣器、變色龍工作站（美國Thermo Fisher公司）；TGL-16C型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；UPT-I-10T型超純水儀（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；BP121S型電子天平（德國賽多利斯集團(tuán)公司）；0.1～5 000 μL移液槍（德國Eppendorf公司）；QL-901型旋渦混合器（江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

金銀花購自武漢市金松大藥房；甲醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號110753-201817，中檢所對照品）；肝素鈉（≥180 USP，美國Sigma Aldrich公司）；乙腈（色譜純，德國CNW科技公司）；試驗(yàn)所用溶液為實(shí)驗(yàn)室自制超純水配制。

1.3 動物

昆明種小鼠[SPF級，體重30±2 g，許可證號SCXK（鄂）2021-0008，湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心]。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以V（甲醇）∶V（0.2%磷酸溶液）=12∶88為流動相；柱溫箱35 ℃；流速1.0 mL/min；檢測波長327 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 金銀花提取物制備

稱取200 g金銀花于燒杯中，加入1 000 mL水，回流提取5 h，紗布過濾，靜置12 h，棄去沉淀，提取液減壓濃縮至相對密度約1.7（50 ℃），放入鼓風(fēng)干燥箱干燥至水分低于5%。得到金銀花提取物。

2.2.2 樣品處理

金銀花提取物含量測定樣品：精密稱定0.1 g金銀花提取物固形物，置于具塞錐形瓶中，加入50 mL 50%甲醇，超聲5 min，移入100 mL容量瓶，用50%甲醇定容，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液待用。

血漿樣品處理：從小鼠眼球采集1 mL全血，置于加入抗凝血肝素的5 mL離心管，立即離心（12 000 r/min，10 min），取100 μL上清液于另一潔凈離心管，加入1 mL甲醇，超聲10 min，按12 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，所得濾液于棕瓶保存。

肝腎樣品處理：取約0.18 g小鼠肝腎組織于玻璃勻漿器中，加入1.5 mL生理鹽水后研磨成組織勻漿，渦旋5 min，立即離心（12 000 r/min，10 min），取100 μL上清液于另一潔凈離心管，加入1 mL甲醇，超聲10 min，按12 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，所得濾液于棕瓶保存。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品儲備液的制備

精密稱取0.05 g綠原酸于25 mL容量瓶內(nèi)，用50%甲醇溶解并定容，得到標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。

2.2.4 質(zhì)控樣品的制備

取適量綠原酸儲備液，加入空白血漿稀釋，按2.2.2的樣品處理方法處理，制成質(zhì)量濃度16，20和24 μg/mL的綠原酸血漿溶液，作為血漿質(zhì)控樣品。肝腎組織處理方法同血漿樣品，作為肝臟質(zhì)控樣品和腎臟質(zhì)控樣品。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 專屬性試驗(yàn)

分別取空白血漿樣品、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（20 μg/mL）、空白血漿，加100 μL綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到血漿專屬性系列溶液，肝腎組織專屬性溶液同血漿，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取20 μL續(xù)濾液注入色譜儀并記錄色譜圖。

測定圖譜如圖1～圖3所示。綠原酸保留時間在6.972 min，峰形正態(tài)分布，與其他峰分離良好，無內(nèi)源性物質(zhì)干擾，該方法專屬性良好。

圖1 血液專屬性HPLC圖

圖2 肝臟專屬性HPLC圖

圖3 腎臟專屬性HPLC圖

2.3.2 線性關(guān)系考察

將標(biāo)準(zhǔn)品儲備液稀釋成6個不同質(zhì)量濃度（在3～28 μg/mL范圍內(nèi)），分別為3，6，10，15，21和28 μg/mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取20 μL續(xù)濾液注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品綠原酸的濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性關(guān)系如圖4所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.923 7x-1.012 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4，表面血漿樣品綠原酸與主峰面積在3～28 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以信噪比rSN≥3和rSN≥10分別計算最低檢測限和定量限，最低檢測限和定量限分別為0.056 7 μg/mL和0.248 8 μg/mL，測定圖譜如圖5和圖6所示。

圖4 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 檢測限

圖6 定量限

2.3.3 精密度試驗(yàn)

取2.2.4制備的血漿質(zhì)控樣品、肝臟質(zhì)控樣品、腎臟質(zhì)控樣品，進(jìn)行日內(nèi)和日間分析。日內(nèi)分析是指在同一天5個不同時間重復(fù)測定同一樣品，日間分析是在連續(xù)的5 d內(nèi)重復(fù)測定同一樣品。平行測定3組，連續(xù)測定5 d，并記錄色譜圖，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差SRSD值，判斷精密度是否良好。

測量結(jié)果如表1，表2和表3所示。3種質(zhì)量濃度樣品的日內(nèi)精密度和日間精密度SRSD均小于2.5%，表明該方法準(zhǔn)確度和精密度均良好，符合生物樣品測定要求。

表1 血漿精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6，±S）

表1 血漿精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6，±S）

理論質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)日內(nèi)精密度 日間精密度測得質(zhì)量濃度/(μg·mL-1) SRSD/% 測得質(zhì)量濃度/(μg·mL-1) SRSD/%16 15.50±0.21 1.32 15.54±0.33 2.00 20 19.51±0.18 0.83 19.39±0.21 1.00 24 22.69±0.28 1.14 22.45±0.43 1.83

表2 肝臟精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6，±S）

表2 肝臟精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6，±S）

理論質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)日內(nèi)精密度 日間精密度測得質(zhì)量濃度/(μg·mL-1) SRSD/% 測得質(zhì)量濃度/(μg·mL-1) SRSD/%16 15.02±0.36 2.25 14.44±0.25 1.66 20 18.79±0.18 1.01 18.66±0.38 1.84 24 21.39±0.36 1.57 21.52±0.37 1.51

表3 腎臟精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6，±S）

表3 腎臟精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6，±S）

理論質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)日內(nèi)精密度 日間精密度測得質(zhì)量濃度/(μg·mL-1) SRSD/% 測得質(zhì)量濃度/(μg·mL-1) SRSD/%16 14.46±0.36 2.22 14.45±0.27 1.91 20 19.38±0.25 1.29 18.72±0.24 1.21 24 21.58±0.28 1.16 21.41±0.39 1.61

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取2.2.4制備的血漿質(zhì)控樣品、肝臟質(zhì)控樣品、腎臟質(zhì)控樣品，各6份，測定，分別記錄血漿質(zhì)控樣品、肝臟質(zhì)控樣品、腎臟質(zhì)控樣品的峰面積值，并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差SRSD，測定結(jié)果如表4所示。3種質(zhì)量濃度樣品的重復(fù)性SRSD均小于2.5%，表明該方法重復(fù)性良好，符合生物樣品測定要求。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n=6，±S）

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n=6，±S）

理論質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)血漿 肝臟 腎臟測得質(zhì)量濃度/(μg·mL-1) SRSD/% 測得質(zhì)量濃度/(μg·mL-1) SRSD/% 測得質(zhì)量濃度/(μg·mL-1) SRSD/%16 15.55±0.25 0.98 14.97±0.41 1.69 14.52±0.32 1.69 20 19.61±0.27 1.11 18.69±0.31 1.28 19.55±0.33 1.57 24 22.53±0.49 1.40 21.39±0.36 1.08 21.60±0.32 1.12

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別取2.2.4制備的血漿質(zhì)控樣品、肝臟質(zhì)控樣品、腎臟質(zhì)控樣品，各2份。一份置于室溫（25 ℃）保存，于0，1，2，3和6 h測定，記錄色譜圖；另一份于-20 ℃保存，于0，1，2，3和6 h測定，記錄色譜圖。計算血漿質(zhì)控樣品、肝臟質(zhì)控樣品、腎臟質(zhì)控樣品的SRSD，判斷穩(wěn)定性是否良好。

測定結(jié)果如表5，表6和表7所示。樣品在室溫（25 ℃）及凍融條件下穩(wěn)定性良好，各組織不同水平濃度在室溫（25 ℃）及冷凍保存后測得的SRSD分別在0.50%～2.65%和0.75%～1.74%范圍內(nèi)，說明該生物樣品的穩(wěn)定性符合生物樣品分析要求，樣品在室溫（25℃）和冷凍（-20 ℃）下均可放置6 h。

表5 血漿穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=6，±S）

理論質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)室溫 (25 ℃) 冷凍 (-20 ℃)測得質(zhì)量濃度/(μg·mL-1) SRSD/% 測得質(zhì)量濃度/(μg·mL-1) SRSD/%16 14.80±0.52 2.65 14.03±0.28 1.74 20 18.12±0.29 1.48 17.88±0.28 1.28 24 22.30±0.47 1.64 21.90±0.41 1.31

表6 肝臟穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=6，±S）

表6 肝臟穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=6，±S）

理論質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)室溫 (25 ℃) 冷凍 (-20 ℃)測得質(zhì)量濃度/(μg·mL-1) SRSD/% 測得質(zhì)量濃度/(μg·mL-1) SRSD/%16 14.39±0.19 1.28 14.01±0.13 0.75 20 18.17±0.24 0.92 17.93±0.18 0.85 24 22.61±0.32 1.05 22.21±0.41 1.41

表7 腎臟穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=6，±S）

表7 腎臟穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=6，±S）

理論質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)室溫 (25 ℃) 冷凍 (-20 ℃)測得質(zhì)量濃度/(μg·mL-1) SRSD/% 測得質(zhì)量濃度/(μg·mL-1) SRSD/%16 13.80±0.52 2.22 13.71±0.23 1.05 20 18.34±0.12 0.50 17.86±0.33 1.29 24 22.05±0.33 1.14 21.74±0.32 0.92

2.3.6 提取回收率試驗(yàn)

提取回收率反映生物樣品中目標(biāo)化合物的提取效率，是評價生物樣品分析方法的重要指標(biāo)之一[27]。取2.2.4制備的血漿質(zhì)控樣品、肝臟質(zhì)控樣品、腎臟質(zhì)控樣品，每個濃度平行測定3次，記錄色譜圖，峰面積帶入回歸方程得到溶液濃度，測得濃度與理論標(biāo)準(zhǔn)濃度的比值即為相對回收率。

測定結(jié)果如表8所示。血漿、肝臟、腎臟的平均提取回收率為92.42%，91.95%和89.86%，證明該方法提取回收率良好，符合生物樣品分析方法的要求。

表8 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6，±S）

表8 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6，±S）

度/(μg·mL-1) 質(zhì)控樣品 測得質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)樣品質(zhì)量濃平均提取回收率/% SRSD/%16 血漿 14.76±0.25 92.25 2.04肝臟 14.41±0.12 90.08 1.00腎臟 13.73±0.32 85.79 2.83 20 血漿 18.21±0.27 91.05 1.81肝臟 18.18±0.18 90.92 1.19腎臟 18.28±0.05 91.42 0.33 24 血漿 22.55±0.13 93.96 0.73肝臟 22.77±0.10 94.86 0.52腎臟 22.05±0.24 91.86 1.35

2.4 藥代動力學(xué)研究

取66只雌雄各半的小鼠，隨機(jī)分為兩大組，各大組再分為3小組，每小組11只。給藥前禁食12 h，金銀花提取物用適量水溶解，經(jīng)灌胃給藥，給藥劑量按綠原酸計為100 mg/kg和20 mg/kg高、低2種濃度，給藥容量為0.1 mL/kg，給藥后于0，5，10，15，20，30，60，90，120，150和180 min進(jìn)行取樣，于1.2.3的樣品方法處理，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取20 μL續(xù)濾液注入色譜儀并記錄色譜圖，藥動學(xué)參數(shù)用DAS 2.0軟件進(jìn)行計算和處理。

用建立的分析方法進(jìn)行綠原酸的藥代動力學(xué)研究。根據(jù)各時間點(diǎn)測定血液、肝臟、腎臟的藥物濃度繪制“藥物濃度-時間”曲線，如圖7～圖9所示，數(shù)據(jù)通過DAS 2.0藥動學(xué)程序進(jìn)行擬合。

圖7 小鼠2種劑量灌胃后血液中綠原酸濃度-時間曲線

圖8 小鼠2種劑量灌胃后肝臟中綠原酸濃度-時間曲線

圖9 小鼠2種劑量灌胃后腎臟中綠原酸濃度-時間曲線

綠原酸在血漿和肝臟中有吸收，在腎臟中幾乎無吸收。根據(jù)非房室模型統(tǒng)計矩參數(shù)的方法，計算主要動力學(xué)參數(shù)，如表9和表10所示。

表9 2種劑量灌胃后，綠原酸在小鼠體內(nèi)動力學(xué)參數(shù)（血漿）（n=3，±S）

統(tǒng)計矩參數(shù) 劑量20 mg/kg 100 mg/kg AUC(0-t)/(mg·L-1·h-1) 0.994±0.063 5.672±0.055 AUC(0-∞)/(mg·L-1·h-1) 1.007±0.063 5.759±0.515 MRT(0-t)/h 0.568±0.046 0.676±0.029 MRT(0-∞)/h 0.593±0.045 0.722±0.025 t1/2z/h 0.490±0.016 0.490±0.032 Tmax/h 0.159±0.017 0.167±0.037 VZ/(L·kg-1) 14.134±1.372 12.269±0.898 CLZ/(L·h-1·kg-1) 19.934±1.290 17.366±0.155 Cmax/(mg·L-1) 2.155±0.010 9.451±0.228

表10 2種劑量灌胃后，綠原酸在小鼠體內(nèi)動力學(xué)參數(shù)（肝臟）（n=3，±S）

表10 2種劑量灌胃后，綠原酸在小鼠體內(nèi)動力學(xué)參數(shù)（肝臟）（n=3，±S）

統(tǒng)計矩參數(shù) 劑量20 mg/kg 100 mg/kg AUC(0-t)/(mg·L-1·h-1) 0.652±0.028 3.847±0.035 AUC(0-∞)/(mg·L-1·h-1) 0.654±0.028 3.868±0.033 MRT(0-t)/h 0.390±0.033 0.582±0.005 MRT(0-∞)/h 0.407±0.034 0.592±0.009 t1/2z/h 0.423±0.011 0.390±0.014 Tmax/h 0.139±0.040 0.164±0.023 VZ/(L·kg-1) 18.703±1.033 14.549±0.637 CLZ/(L·h-1·kg-1) 30.608±1.341 25.855±0.218 Cmax/(mg·L-1) 1.568±0.411 7.386±0.019

由藥代動力學(xué)參數(shù)可知：綠原酸在血漿中的達(dá)峰時間為0.163 h，清除半衰期約0.490 h；在肝臟中的達(dá)峰時間為0.151 h，清除半衰期為0.401 h；在血液、肝臟中的藥時曲線下面積（AUC）均與給藥劑量呈正比，符合線性一級消除過程。

3 討論與結(jié)論

金銀花具有清熱解毒、疏風(fēng)散熱等功效，是一種常用的中草藥，其主要活性成分是綠原酸。金銀花在飼料中可作為增強(qiáng)動物自身免疫力的飼料添加劑，起到緩解動物腸道氧化應(yīng)激和抗炎的作用。市售與金銀花相關(guān)的藥品數(shù)量繁多，為進(jìn)一步研究金銀花提取物在動物體內(nèi)的吸收分布，此次試驗(yàn)建立了測定金銀花提取物中綠原酸在經(jīng)灌胃后在小鼠體內(nèi)含量，以及分布和藥代動力學(xué)方法。血漿、肝腎組織樣品經(jīng)甲醇提取后，采用高效液相色譜法測定。結(jié)果表明，日內(nèi)與日間精密度均小于15%，血漿、肝臟和腎臟的平均回收率為92.42%，91.95%和89.86%，高、中、低3種濃度的水平回收率在0.33%～2.83%范圍內(nèi)，符合藥代動力學(xué)研究要求。該方法操作簡單，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，對精密度、重復(fù)性、回收率等均做了詳細(xì)研究，證明該方法穩(wěn)定，可靠。試驗(yàn)結(jié)果可為金銀花的藥物開發(fā)及在藥物的臨床應(yīng)用上提供一定參考。