肖彥春，田曉玲，郝長紅，劉巍巍，龐然

遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品藥品學(xué)院（營口 115009）

海參素有“海中人參”之稱，其作為高效營養(yǎng)滋補(bǔ)品已被熟知。海參肽是以鮮活海參為原料，經(jīng)蛋白酶水解，分離純化后得到以小分子肽為主，多種功效成分共存的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物[1]。其具有良好的溶解性、穩(wěn)定性，低黏度，易消化吸收，生物效價高，無抗原性，食用安全，降血壓，預(yù)防心腦血管疾病，抗疲勞，增強(qiáng)體力，提高免疫力，抗腫瘤，抗氧化，延緩衰老等特點(diǎn)[2-4]。市場上有將海參肽添加到日常食品中，如海參肽糖果、海參肽酒、海參肽酵素、海參肽固體飲料等產(chǎn)品[5-6]，將海參這種傳統(tǒng)酒席宴上的佳肴珍品制作成日常生活中營養(yǎng)價值更高、食用更方便的高級優(yōu)質(zhì)食品。而將海參肽應(yīng)用到發(fā)酵乳產(chǎn)品中，在國內(nèi)報道較少。因此，此文以保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌作為發(fā)酵劑，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)探究海參肽酸奶的最佳工藝配方，并對其抗氧化性進(jìn)行評價，旨在豐富酸奶產(chǎn)品類型，為海參肽開發(fā)利用提供一定技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及其他添加材料

乳酸菌種YO-MIX 900 LYO 50 DCU[嗜熱鏈球菌、保加利亞亞種，丹尼斯克（中國）有限公司]；海參肽（湖北瑞邦生物科技有限公司）；蔗糖（廣西糖業(yè)集團(tuán)西江制糖有限公司）。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；鐵氰化鉀（分析純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司）；三氯乙酸、三氯化鐵（分析純，茂名市雄大化工有限公司）；DPPH（含量≥97.0%，福州飛凈生物科技）。

1.1.3 儀器與設(shè)備

電子天平（JY20002，上海舜宇恒平）；恒溫培養(yǎng)箱（ZHP-250，上海三發(fā)）；高壓均質(zhì)機(jī)（GJJ-0.06/70，上海諾尼）；冰箱（BCD-236WDGL，海爾）；高壓蒸汽滅菌鍋（BKQP-12，山東博科）；離心機(jī)（h1850，湘儀）；分光光度計（752，舜宇恒平）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程鮮乳、蔗糖、海參肽等→混勻調(diào)制→均質(zhì)→殺菌→冷卻→接菌種→灌裝→發(fā)酵→冷藏→成品

1.2.2 操作方法

1.2.2.1 調(diào)制

選擇新鮮鮮奶，總干物質(zhì)含量不得低于11.5%，其中非脂干物質(zhì)不得少于8.5%，否則會影響蛋白質(zhì)的凝乳作用。蔗糖、海參肽等混合后加水加熱溶解充分后添加到鮮奶中混勻調(diào)制。

1.2.2.2 均質(zhì)

將牛乳升溫加熱至50～60 ℃，加入至均質(zhì)機(jī)中，8～10 MPa壓力下均質(zhì)。均質(zhì)可防止脂肪上浮，使脂肪微粒化，改善口感。

1.2.2.3 殺菌

將均質(zhì)后的混合乳液于90～95 ℃殺菌15 min?；虿捎酶邷厮矔r殺菌，在135～140 ℃加熱2 s，有利于營養(yǎng)成分的保存。

1.2.2.4 冷卻、接種、灌裝、發(fā)酵

將殺菌后的混合乳冷卻到40～45 ℃，無菌條件下接種發(fā)酵劑，混合均勻，灌裝、貼上標(biāo)簽，溫度在40～43 ℃下培養(yǎng)6～7 h。

1.2.2.5 冷藏后熟

達(dá)到發(fā)酵時間后，立即放入冰箱，進(jìn)行鈍化24 h，取出。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計

1.2.3.1 蔗糖添加量的選擇

在菌粉添加量12 mg/L、海參肽添加量2 g/L、發(fā)酵時間6 h條件下，蔗糖添加量設(shè)定為0，20，40，60和80 g/L，研究蔗糖添加量對酸奶感官的影響。

1.2.3.2 海參肽添加量的選擇

在蔗糖添加量60 g/L、菌粉添加量12 mg/L，發(fā)酵時間6 h條件下，海參肽的添加量設(shè)定為0，1.2，2.0，2.8和4.0 g/L，研究海參肽添加量對酸奶感官的影響。

1.2.3.3 菌粉添加量的選擇

在蔗糖添加量60 g/L、海參肽添加量2 g/L、發(fā)酵時間6 h條件下，菌粉添加量設(shè)定為4，8，12，16和20 mg/L，研究菌粉添加量對酸奶感官的影響。

1.2.3.4 發(fā)酵時間的選擇

在蔗糖添加量60 g/L、菌粉添加量12 mg/L、海參肽添加量2 g/L條件下，發(fā)酵時間設(shè)定為4，5，6，7，8和9 h，研究發(fā)酵時間對酸奶感官的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，以感官評價為考察指標(biāo)，采用四因素三水平L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計。研究蔗糖添加量（A）、菌粉添加量（B）、海參肽添加量（C）、發(fā)酵時間（D）對酸奶感官品質(zhì)的影響，以確定最佳海參肽酸奶工藝。正交試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 感官評定

隨機(jī)選擇有經(jīng)驗(yàn)品評者15人組成評定小組，按照感官評分標(biāo)準(zhǔn)表（表2）評價。取10 mL乳樣放在20 mL樣品杯中，觀察乳樣的色澤和組織狀態(tài)，聞其氣味，最后口中含乳樣，品嘗滋味。感官評定綜合評分為100分，結(jié)果取15人各自評分總分的平均值。

表2 感官評分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.2 理化和微生物指標(biāo)測定

根據(jù)GB 19302—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)酵乳》中的指標(biāo)要求，對酸奶的蛋白質(zhì)、脂肪、酸度、乳酸菌數(shù)、大腸桿菌、致病菌等分別進(jìn)行測定。

1.3.3 海參肽酸奶的抗氧化活性評定

1.3.3.1 還原力測定

取1.0 mL待測樣于10 mL試管中，先后向其中加入2.5 mL pH 6.6磷酸鹽緩沖液，2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻，50 ℃水浴反應(yīng)25 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸，混勻，3 000 r/min離心5 min。取上清液2.5 mL，加蒸餾水2.5 mL，加0.5 mL 1%三氯化鐵，搖勻靜置10 min，在波長700 nm處進(jìn)行比色測定吸光度[7]。

1.3.3.2 DPPH自由基清除率測定

取8 mL 1.0×10-4mol/L DPPH-乙醇溶液與2 mL樣品或95%乙醇（空白對照）混合、振蕩，室溫暗處放置30 min，3 000 r/min離心10 min，取上清液于波長517 nm處測吸光度[8]。DPPH清除率用式（1）計算。

式中：A0為空白吸光度；A1為樣品吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 蔗糖添加量對海參肽酸奶感官品質(zhì)的影響

從表3中可以看出，蔗糖添加量0～60 g/L時，海參肽酸奶的感官評分逐漸增加。蔗糖含量低時，酸奶甜度不足，酸度過高，風(fēng)味較差，感官評分較低；隨蔗糖添加量增加，甜度逐漸增高，蔗糖添加量60 g/L時，酸奶口感光滑細(xì)膩，組織狀態(tài)良好，酸甜適中，感官評分最高88.0分；隨著蔗糖添加量繼續(xù)增加，酸奶口味偏甜，感官評分降低，因此最佳的蔗糖添加量為60 g/L。

2.1.2 海參肽添加量對海參肽酸奶感官品質(zhì)的影響

從表4可以看出，海參肽添加量0～2 g/L時，酸奶的感官評分逐漸增加，組織狀態(tài)逐漸細(xì)膩。海參肽添加量2 g/L時，黏度適中，無乳清析出，入口細(xì)膩爽滑，酸甜適中，無異味，感官評分達(dá)到最高86.7分；隨著海參肽添加量的繼續(xù)增加，感官評分逐漸下降，海參肽添加量4 g/L時，酸乳的氣味、口感都明顯降低，因此海參肽的最佳添加量為2 g/L。

表4 海參肽添加量對海參肽酸奶感官品質(zhì)的影響

2.1.3 菌種添加量對海參肽酸奶感官品質(zhì)的影響

從表5中可以看出，菌粉添加量較少時，酸奶組織狀態(tài)粗糙，有乳清析出，有顆粒，風(fēng)味不明顯；隨菌種添加量的增加，口感逐漸提高，菌種添加量達(dá)到12 mg/L時，酸奶口感光滑細(xì)膩，組織狀態(tài)良好，酸甜適中，感官評分最高87.4分；隨著菌種添加量的增加，酸奶酸度增大，口感過酸，且有微量乳清析出。因此，最佳菌種添加量為12 mg/L。

2.1.4 發(fā)酵時間對感官評分的影響

從表6中可以看出，發(fā)酵時間4～7 h時，隨著發(fā)酵時間的增加，酸奶的組織狀態(tài)、口感等逐漸變好。發(fā)酵7 h時，風(fēng)味濃郁、組織均勻細(xì)膩，口感圓潤，感官評分達(dá)到最高值86.7分。隨著發(fā)酵時間的繼續(xù)延長，酸奶味道偏酸，感官評分逐漸降低。因此最佳發(fā)酵時間為7 h。

表6 發(fā)酵時間對海參肽酸奶感官品種的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以感官評分為指標(biāo)，對海參肽添加量、蔗糖添加量、菌種添加量、發(fā)酵時間4個因素進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)（表1）。正交試驗(yàn)安排和結(jié)果見表7，極差分析可以判斷出各因素對感官品質(zhì)影響的順序?yàn)锽＞C＞D＞A，即菌種添加量對海參肽酸奶感官品質(zhì)影響最大，其次是海參肽粉添加量、發(fā)酵時間、蔗糖添加量。根據(jù)k值最佳組合A2B3C2D3和由正交表中直接對比分析的最優(yōu)組合A2B1C2D3進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表8，可以看出組合A2B3C2D3的感官評分為87.8分，高于組合A2B1C2D3。因此海參肽酸奶的最佳配方為海參肽添加量2 g/L、蔗糖60 g/L、菌種接種量16 mg/L、發(fā)酵時間7 h。

表7 正交試驗(yàn)和結(jié)果分析

表8 最優(yōu)試驗(yàn)組合驗(yàn)證

2.3 海參肽酸奶理化和微生物檢測結(jié)果

海參肽酸奶呈乳白色，組織均勻、無氣泡、無乳清析出，口感細(xì)膩爽滑、酸甜適中，有發(fā)酵乳固有香味。海參肽酸奶理化和微生物指標(biāo)檢測結(jié)果見表9，大腸桿菌、致病菌都未檢出，均符合GB 19302—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)酵乳》。

表9 海參肽酸奶理化及微生物檢測結(jié)果

2.4 優(yōu)化后海參肽酸奶抗氧化活性

2.4.1 還原力測定

有研究表明，不同分子量海參肽都具有顯著的還原能力[9]，因此對優(yōu)化后海參肽酸奶及對照酸奶進(jìn)行還原力比較，測定的樣品吸光度越大表明還原力越強(qiáng)。由圖1可見，對照酸奶和海參肽酸奶的吸光度均隨著樣品濃度的增加而增大，并且海參肽酸奶的吸光度明顯高于對照酸奶，質(zhì)量濃度為50 mg/mL時，海參肽酸奶吸光度可達(dá)0.632。

圖1 酸奶的還原力

2.4.2 DPPH自由基清除率

比較海參肽酸奶和未添加海參肽的對照酸奶對DPPH自由基的清除率，結(jié)果如圖2所示。在相同酸奶濃度時，海參肽酸奶對DPPH自由基的清除能力遠(yuǎn)高于對照酸奶，并隨著酸奶濃度的增加，DPPH自由基的清除率逐漸增強(qiáng)，質(zhì)量濃度50 mg/mL時，海參肽酸奶對DPPH的清除率達(dá)58.6%。對海參肽的研究中發(fā)現(xiàn)其抗氧化性高于天然抗氧劑維生素C，具有較好清除自由基的作用[10]。有研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳中乳酸菌具有清除自由基的能力[11]，并且有報道酸奶中組氨酸、酪氨酸、賴氨酸等游離氨基酸具有抗氧化性[12]。通過海參肽的添加，進(jìn)一步增強(qiáng)酸奶的抗氧化性，提高酸奶的附加值。

圖2 DPPH自由基清除率

3 結(jié)論

試驗(yàn)以鮮牛奶、海參肽粉為原料，以保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌為菌種，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)對海參肽酸奶進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，確定海參肽酸奶最佳配方：海參肽添加量2 g/L、蔗糖60 g/L、菌種接種量16 mg/L、發(fā)酵時間7 h。該配方下酸奶組織均勻，口感細(xì)膩爽滑、酸甜適中，感官評分最高為87.8分，其理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)都符合GB 19302—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)酵乳》。海參肽酸奶的還原力及DPPH自由基清除率均高于對照酸奶，說明海參肽酸奶有效提高酸奶的抗氧化能力，提高產(chǎn)品的保健功能，為豐富酸奶產(chǎn)品類型、為海參肽開發(fā)利用提供新思路。