高善行，張瑞祎，王毓甜，李景明，臧佳辰*

中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院（北京 100083）

石榴（Punica granatumL.），石榴科石榴屬植物，酸甜可口，具有豐富的氨基酸、維生素、纖維素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)[1]。目前中國的石榴栽種面積約170萬畝（1畝≈666.67 m2），居世界首位，年產(chǎn)量100萬 t以上[2]。如今品種豐富多樣的鮮食石榴、果汁、果酒、石榴籽油等相關(guān)產(chǎn)品，均展示了石榴及其綜合產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展。

但在石榴的加工過程中，約占石榴質(zhì)量30%的石榴皮[3]，僅僅作為飼料或肥料被簡單處理，或被直接丟棄，造成了較大的浪費[4-5]。通過對化學成分的分析，石榴皮富含多酚、丹寧、鞣質(zhì)、黃酮、有機酸等重要活性物質(zhì)[6-7]，其中多酚約占石榴皮干重的10%～20%[8]，包括安石榴苷、鞣花酸、沒食子酸、兒茶素、綠原酸等多種物質(zhì)[9-10]，開發(fā)價值巨大。

石榴皮多酚的抗氧化活性可超過大部分植物[11-12]，已得到了大量體內(nèi)與體外試驗的驗證。通過對自由基的清除，石榴皮多酚能夠有效阻止其對組織和器官的破壞作用，有助于提高食品的安全性與品質(zhì)，為進一步開發(fā)天然食品添加劑提供了理論依據(jù)和思考。

然而，因多酚類化合物性質(zhì)較不穩(wěn)定，易被氧化破壞，因此提取時間過長、溫度過高都有可能導(dǎo)致石榴皮多酚的損失[13]，不僅增加生產(chǎn)成本，還會降低石榴皮多酚抗氧化等活性。因此，不斷改進石榴皮多酚的生產(chǎn)工藝，提高提取效率勢在必行。

超聲波提取是一種新興的提取方法，因其提取時間短、效率高等特點，逐漸被應(yīng)用到植物活性物質(zhì)（如多酚）的提取當中，也是一種提取石榴皮多酚的重要途徑[14-15]。已有研究證明，在超聲波提取過程中，能夠省去加熱的工藝，并且極大節(jié)省了提取時間[16]。與此同時，酶的使用可以在前處理過程中溫和、高效地獲取多酚原料，避免極端條件破壞多酚結(jié)構(gòu)，影響其功能活性。因此，試驗將聯(lián)合酶法和超聲法進一步優(yōu)化石榴皮多酚提取工藝。

綜上所述，石榴皮多酚的功能活性非常豐富，具有相當廣闊的應(yīng)用前景，因此可以進一步改進石榴皮多酚提取方法，提高石榴皮多酚的提取效率，以推動相關(guān)產(chǎn)業(yè)的應(yīng)用和發(fā)展。研究通過單因素試驗和正交試驗，以復(fù)合酶解、溶劑提取、超聲波輔助提取的方式，改良現(xiàn)有提取石榴皮多酚的方法。同時，試驗重點測定了不同提取方案中石榴皮多酚對于自由基的清除活性，對主要活性物質(zhì)作定性與定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料

石榴皮：由市售石榴獲得，取果皮淡黃色部分，通過清洗、破碎、干燥等程序，在低溫條件下備用。

1.2 儀器及試劑

HW.W21.600C電熱恒溫水浴鍋（北京長風儀器儀表公司）；CF16RN高速冷凍離心機（日本日立公司）；DZF-6213電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；Cary-50紫外可見分光光度計（美國Varian公司）；2000D超純水器（北京長風儀器儀表公司）；KQ2200DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Venusil MP-C18液相色譜柱（天津博納艾杰爾科技有限公司）；LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）。

纖維素酶、果膠酶（北京Solarbio公司）；無水碳酸鈉、無水乙醇、沒食子酸（北京化學試劑有限公司）；Folin-Ciocalteu試劑（美國Sigma公司）；DPPH（上海阿拉丁生化科技）；沒食子酸、安石榴苷、兒茶素、鞣花酸（HPLC≥98%，Solarbio）。

1.3 方法

1.3.1 復(fù)合酶輔助提取

復(fù)合酶提取方法在王華斌等[17]的研究基礎(chǔ)上優(yōu)化得出。準確稱取1.00 g石榴皮粉末于50 mL離心管中，按照1∶20 g/mL的料液比，加入20 mL質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的酶溶液，混勻后在40 ℃下水浴保溫40 min，在3 000 r/min下離心10 min，分離上清液備用，在95℃下加熱10 min以滅活酶，沉淀用于下一步提取。

在相同總質(zhì)量濃度下，設(shè)置不同比例的纖維素酶與果膠酶，配制復(fù)合酶溶液。檢測不同復(fù)合酶條件下，酶解所得石榴皮多酚產(chǎn)率和抗氧化活性，以得到最適宜提取的復(fù)合酶比例。

1.3.2 超聲波-有機溶劑聯(lián)合提取單因素試驗

在1.3.1小節(jié)的沉淀中加入20 mL體積分數(shù)為30%，40%，50%，60%和70%的乙醇溶液，料液比選取1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30（g/mL），混勻后，在100 W超聲波，30，40，50，60和70 ℃水浴溫度下提取5，10，15，20和25 min。在3 000 r/min下離心10 min，棄去沉淀，將上清液與1.3.1小節(jié)中的上清液合并后于遮光條件下保存，得到石榴皮多酚提取液。每個水平重復(fù)試驗3次取平均值。

1.3.3 正交試驗

依據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取乙醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度、提取時間各3個水平進行正交試驗以篩選最佳反應(yīng)條件。

1.3.4 石榴皮多酚的總酚含量測定

試驗在周帆等[18]的測定方法上稍作改進，采用Folin-Ciocalteu法測定。將樣品提取液稀釋10倍，用移液器量取5 μL，加入195 μL蒸餾水，加入200 μL Folin試劑，再加入600 μL 15%的Na2CO3溶液，混勻后，避光反應(yīng)30 min。以標準曲線的空白對照作為樣品溶液的空白對照，測定波長760 nm下樣品溶液的吸光度。每個樣品平行測定3次，取平均值，用標準曲線的回歸方程按式（1）計算提取液中的酚類含量（mg GAE/g DW）。

式中：GAE為沒食子酸當量，DW為干重。

1.3.5 DPPH自由基清除率的測定

石榴皮多酚清除DPPH自由基的清除率在鄧娜等[19]方法基礎(chǔ)上改進。用無水乙醇將石榴皮提取液稀釋至原來濃度的0.01倍，取500 μL稀釋后的樣品溶液，加入500 μL 0.1 mmol/L的DPPH自由基溶液混勻后靜置，避光30 min，波長516 nm下測定各溶液的吸光度，記為Ai；以相同體積的無水乙醇代替DPPH自由基溶液作為空白，記為A0；相同體積無水乙醇代替樣品溶液作為對照，記為A1。所有樣品平行測定3次，取平均值。按式（2）計算石榴皮多酚對DPPH自由基的清除能力。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 20.0軟件對單因素試驗和正交試驗的質(zhì)構(gòu)數(shù)據(jù)分別進行方差分析（S-N-K法）和直觀分析，確定各因素合適的試驗水平數(shù)和最佳的提取多酚條件。

1.3.7 HPLC法鑒定

取1.3.4小節(jié)中抗氧化活性最高，最低與中等的樣品，用甲醇稀釋10倍后，過0.22 μm有機膜備用。色譜測定參數(shù)見表1。

在使用前預(yù)先對流動相過0.45 μm有機膜，超聲脫氣30 min備用。同時對液相色譜設(shè)備及管路進行脫氣。使用甲醇沖洗管路，將檢測器波長調(diào)節(jié)至280 nm，預(yù)熱30 min。

設(shè)置所需梯度洗脫程序，進樣各混合標準品溶液與樣品溶液，每個標準品及樣品重復(fù)進樣3次，記錄其對應(yīng)的保留時間及峰面積，以保留時間（min）為橫坐標，峰面積為縱坐標，由此可繪制得到四種標準品的液相標準曲線；對樣品溶液進行檢測，可計算得出以上四種成分的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶種類對提取效果的影響

根據(jù)酶反應(yīng)高度專一性的特點，試驗使用不同種類酶（纖維素酶、果膠酶、不同比例復(fù)配的纖維素酶-果膠酶復(fù)合酶），水解原料中的細胞壁組分，破壞細胞結(jié)構(gòu)，使植物多酚等有效成分更易溶進溶劑中，將活性物質(zhì)釋放，達到提取的目的。在其他因素（溫度、提取時間等）均相同的條件下，按照1.3.2小節(jié)所示步驟，進行復(fù)合酶解輔助提取。在測定總酚含量與DPPH自由基清除能力后，可得不同酶的種類對提取效果的影響，如表2所示。

表2 不同復(fù)合酶的酶解效果

通過不同酶種類對提取效果的初步試驗，選擇W纖維素酶∶W果膠酶=1∶2的復(fù)合酶進行后續(xù)單因素試驗及正交試驗，在此條件下酶解并提取，可得相對較高的總酚含量與自由基清除率。

2.2 影響石榴皮多酚提取的條件確定及DPPH抗氧化分析

2.2.1 乙醇體積分數(shù)確定

由圖1可知，過高或過低的乙醇體積分數(shù)下石榴皮多酚的得率與抗氧化能力均較低，可能由于過高的乙醇體積分數(shù)，溶劑與石榴皮多酚的極性差異較大，溶解度下降。而過低體積分數(shù)的乙醇破壞多酚類物質(zhì)與糖類、蛋白質(zhì)氫鍵及疏水鍵能力較弱，從而提取效果不佳。

圖1 不同乙醇體積分數(shù)下總酚含量與自由基清除率

相較而言，40%左右的乙醇體積分數(shù)作為溶劑，與石榴皮中酚類物質(zhì)極性相近，因此可以較好地溶出石榴皮多酚等活性成分，多酚含量達167.58 mg GAE/g DW，此時自由基清除率可達28.74%，與先前研究中提取效果較好的結(jié)論相符[20]，亦與前人報道一致[21]。

綜合各項參數(shù)，選取40%作為標準，30%，40%和50%為較合適的乙醇體積分數(shù)試驗水平。

2.2.2 料液比確定

從圖2可看出，隨著液體占比不斷增大，總酚含量與自由基清除率也在不斷升高，料液比在1∶10～1∶25（g/mL），總酚含量與自由基清除率呈現(xiàn)較為明顯的上升，且料液比在1∶25（g/mL）附近時，可取得較高的總酚含量與DPPH自由基清除率。

圖2 不同料液比下總酚含量與自由基清除率

在1∶25～1∶30（g/mL），雖然多酚得率與自由基清除率仍在上升，但此過程中增長幅度較為緩慢，可能因多酚已經(jīng)充分溶解所致。綜合實際生產(chǎn)中成本與節(jié)能因素，選擇料液比1∶25（g/mL）作為標準，1∶20，1∶25和1∶30（g/mL）為較合適的料液比試驗水平。

2.2.3 時間確定

時間是影響石榴皮多酚提取效果的重要因素之一。從圖3中得出，兩條曲線均隨時間的增長先增加后降低。提取時間從5 min增長至20 min時，多酚從原料中不斷溶出，提取效果較為充分。在此之后，可能由于多酚穩(wěn)定性較低，在浸提過程中降解，得率與抗氧化能力稍有下降。綜上所述，選擇20 min作為標準，15，20和25 min為較合適的時間試驗水平。

圖3 不同時間下總酚含量與自由基清除率

2.2.4 溫度確定

在不同溫度下，石榴皮多酚的得率和自由基清除率同樣呈現(xiàn)出先增后減的趨勢。如圖4所示，在60 ℃左右，為相對適宜的提取溫度。溫度升高有利于分子運動，溶解速率加快，有助于活性物質(zhì)的溶出。當溫度繼續(xù)升高之后，由于多酚在高溫下不穩(wěn)定，易降解，因此得率與抗氧化活性稍有下降。綜上所述，60 ℃作為標準，50，60和70 ℃為較合適的溫度試驗水平。

圖4 不同溫度下總酚含量與自由基清除率

2.3 總酚含量與總抗氧化力間的相關(guān)性

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，分別計算在不同乙醇體積分數(shù)、料液比、時間與溫度下石榴皮多酚的得率與自由基清除率之間的線性相關(guān)系數(shù)（R2），結(jié)果如表3所示。

表3 總酚含量與抗氧化能力的相關(guān)性

由表3可以看出，在多種不同條件提取的石榴皮多酚中，其總酚含量與抗氧化活性都存在較強的正相關(guān)性，驗證了石榴皮多酚的抗氧化特性，并且在一定范圍內(nèi)隨濃度升高而增強。

2.4 提取條件優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，利用正交試驗設(shè)計四因素三水平試驗（表4），對所得提取液測定DPPH自由基清除率。通過極差分析法可知，各因素對抗氧化活性的影響順序為乙醇體積分數(shù)＞料液比＞時間＞溫度，并且得出了可能更佳的提取工藝，即A3B3C1D2，乙醇體積分數(shù)50%，料液比1∶30（g/mL），時間15 min，溫度60 ℃。隨后進行驗證試驗，在其他因素水平一致的情況下進行提取，重復(fù)測定DPPH自由基清除率35.62%，高于正交試驗中試驗6的抗氧化能力，是獲取高抗氧化性石榴皮多酚較好的提取方法。

表4 正交試驗設(shè)計與結(jié)果

通過方差分析（表5）表明：整體試驗的差異顯著，模型P＜0.001，初步說明試驗結(jié)果有較強顯著性；各因素A、B、C、D的顯著性均滿足P＜0.05，說明試驗設(shè)計較為合理，各因素對石榴皮多酚的自由基清除率均有顯著影響，且影響順序為乙醇體積分數(shù)＞料液比＞時間＞溫度，與上文分析得出的結(jié)論一致。

表5 正交試驗方差分析表

2.5 石榴皮多酚的HPLC法鑒定

2.5.1 石榴皮多酚中四種主要成分的含量

試驗采取外標法，保留時間定性，峰面積定量，作出四種待測標準物質(zhì)的標準曲線，且R2＞0.99，說明在該檢測范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.5.2 石榴皮多酚的高效液相色譜檢測

四種標準品的保留時間與出峰順序如圖5（a）所示。在此條件下進行液相色譜，4種待測成分均得到了較好的分離。其中安石榴苷存在α、β兩種同分異構(gòu)體，因此在液相色譜中存在保留時間不同的兩個色譜峰。在此基礎(chǔ)上對三種抗氧化活性不同的樣品（分別編碼為高、中、低抗氧化性）進樣并通過高效液相色譜檢測，結(jié)果如圖5（b）所示。四種成分的分離度較好，保留時間較穩(wěn)定，且各成分的保留時間與標準品的保留時間一致，因此可采用上述線性回歸方程對樣品中四種酚類物質(zhì)的含量進行定量分析（表6）。

圖5 樣品液相色譜

表6 石榴皮多酚樣品中4種酚類物質(zhì)測定單位：μg/mL

在測定的抗氧化活性不同的三種樣品中，含量順序為安石榴苷＞鞣花酸＞沒食子酸＞兒茶素。通過計算可得出，石榴皮多酚的抗氧化活性與其中主要活性成分的含量有一定的相似性，特別是作為含量最高且抗氧化能力最強的安石榴苷，通過試驗可驗證這一結(jié)論，即其含量或?qū)@著影響石榴皮多酚樣品的抗氧化活性。

3 討論與結(jié)論

以石榴皮多酚為研究對象，分析其提取過程、抗氧化能力與組成分析。采用的復(fù)合酶解—超聲—溶劑浸提法，較之傳統(tǒng)的溶劑浸提法而言，更加高效，且對于石榴皮多酚中主要成分安石榴苷也有較好的提取效果，具有良好的發(fā)展前景。

通過單因素試驗與正交試驗，考察不同水平對提取石榴皮多酚的影響，得出0.20 mg/mL的復(fù)合酶濃度（W纖維素酶∶W果膠酶=1∶2）、乙醇體積分數(shù)50%、料液比1∶30（g/mL）、時間15 min、溫度60 ℃為較適宜的提取條件，顯著優(yōu)于其他條件下所提取的抗氧化活性（P＜0.01）。此時總酚含量達200.32 mg GAE/g DW，DPPH自由基清除率為35.62%。并且，石榴皮多酚的總酚含量與抗氧化能力在一定范圍內(nèi)呈線性正相關(guān)關(guān)系。

進一步探索石榴皮多酚中具抗氧化活性的多酚成分，通過HPLC高效液相色譜法進行分析可以發(fā)現(xiàn)，石榴皮多酚的含量與抗氧化性呈現(xiàn)正相關(guān)性。不同樣品中均存在安石榴苷＞鞣花酸＞沒食子酸＞兒茶素含量趨勢，因此可推測質(zhì)量組成及抗氧化活性的主要成分為安石榴苷。