李瑞星 馬丙祥 孔亞敏 張雪原 陳慧敏

（河南中醫(yī)藥大學(xué)兒科醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450056）

宮內(nèi)窘迫或出生窒息所造成的缺氧缺血性腦損傷（Hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是造成新生兒腦損傷的主要原因[1]。重度窒息所致的足月兒缺血缺氧性腦?。℉ypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）也是新生兒死亡或致殘的主要病因之一[2]。研究缺氧缺血性腦損傷的發(fā)生機(jī)制，早期干預(yù)、治療，對(duì)防治新生兒神經(jīng)損傷和減少遠(yuǎn)期傷殘具有重要意義。

中醫(yī)理論認(rèn)為“痰”和“瘀”是HIBD 發(fā)病的重要病理因素，“痰瘀阻竅，經(jīng)絡(luò)不通”是其主要病理機(jī)制。根據(jù)HIBD 的痰瘀發(fā)病理論，研究團(tuán)隊(duì)創(chuàng)制了蒲金口服液（石菖蒲、郁金、丹參、紅花），取得了良好的臨床治療效果。本研究擬應(yīng)用透射電子顯觀(guān)察微鏡觀(guān)察突觸超微結(jié)構(gòu)、測(cè)量突觸后致密物厚度以蒲金口服液對(duì)HIBD 幼鼠突觸后膜可塑性的影響，探討其對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 選取7 日齡SPF 級(jí)健康SD 幼年大鼠112只，雄性，體質(zhì)量（25±5）g，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（魯）20190003。實(shí)驗(yàn)在河南省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)所用幼鼠隨母鼠分籠喂養(yǎng)，室溫20～25 ℃，明暗節(jié)律12 h/12 h，母乳喂養(yǎng)。

1.2 模型制備與分組 手術(shù)組動(dòng)物經(jīng)1%戊巴比妥鈉溶液美國(guó)（Sigma 公司，貨號(hào)：P3761-5）腹腔注射麻醉后，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，雙重結(jié)扎后剪斷血管。術(shù)后置于含92% N2和8% O2混合氣體的缺氧艙內(nèi)，持續(xù)缺氧2 h。手術(shù)當(dāng)天記為第0 天。手術(shù)組動(dòng)物復(fù)蘇后，進(jìn)行行為學(xué)評(píng)定，以身體向一側(cè)旋轉(zhuǎn)、右側(cè)肢體活動(dòng)不利、翻身不利、行走不穩(wěn)、不能走直線(xiàn)為造模成功。手術(shù)組造模成功幼鼠隨機(jī)分為中藥組、西藥組、模型組。假手術(shù)組只分離左側(cè)頸總動(dòng)脈但不結(jié)扎，縫合皮膚后不做缺氧處理?？瞻捉M不做任何處理。中藥組予蒲金口服液0.1 mL/（kg·d）灌胃，每日1 次；西藥組予單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液（齊魯制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20046213）3 mL/（kg·d）腹腔注射，每日1 次；余組予生理鹽水0.1 mL/（kg·d）灌胃，每日1次。各組均連續(xù)干預(yù)14 d。

1.3 學(xué)習(xí)與記憶行為測(cè)試 于制模后，幼鼠17 日齡開(kāi)始進(jìn)行定位航行訓(xùn)練，于21 日齡干預(yù)療程結(jié)束后，各組分別取6 只動(dòng)物進(jìn)行Morris 水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)及空間探索實(shí)驗(yàn)，觀(guān)察記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)的路線(xiàn)圖及隱匿平臺(tái)逃避潛伏期（Escape 1atency period，Elp）和穿臺(tái)次數(shù)，以測(cè)試幼鼠學(xué)習(xí)記憶的獲取能力和記憶保持能力。

1.4 尼氏染色標(biāo)本制備 各組動(dòng)物在水迷宮測(cè)試結(jié)束后（21 d）行灌注固定（6 只），取腦制作石蠟切片。采用焦油紫法，用尼氏染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，型號(hào)：G1430）進(jìn)行染色，400 倍鏡下每張切片取3個(gè)視野進(jìn)行尼氏體計(jì)數(shù)。

1.5 透射電子顯微鏡標(biāo)本制備 每組取2 只幼鼠，麻醉后行心臟灌注取腦，切取1 mm3大小海馬組織，放入2.5%戊二醛固定液中，送至河南中醫(yī)藥大學(xué)電鏡中心處理。20000 倍視野下，每個(gè)標(biāo)本任意取3 個(gè)視野，計(jì)數(shù)突觸數(shù)目。50000 倍視野下，每個(gè)標(biāo)本取3 個(gè)突觸測(cè)量突觸后致密物的平均厚度：利用圖像分析儀，測(cè)量正方測(cè)試格的測(cè)試線(xiàn)與突觸后致密物相交所截得截線(xiàn)的截距，并計(jì)算其平均值，代入公式：τ=l/2，其中τ：突觸后致密物的平均厚度；l：測(cè)試線(xiàn)與突觸后致密物相交所得截線(xiàn)的平均截距。

1.6 Western Blot 檢測(cè)腦組織PSD-95、NMDAR-2B的表達(dá) 在水迷宮測(cè)試結(jié)束后（21 d）每組取6 只幼鼠斷頭取腦，剝離海馬組織行蛋白免疫印跡（Western Blotting，WB）檢測(cè)。突觸后密度蛋白95（PSD-95）、谷氨酸受體2B 抗體（NMDAR-2B）購(gòu)買(mǎi)自Abcam 公司。其余輔助試劑購(gòu)買(mǎi)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與模型組比較，其余各組隱匿平臺(tái)逃避潛伏期縮短（P ＜0.05）。與空白組和假手術(shù)組比較，其余各組穿臺(tái)次數(shù)下降（P ＜0.05）；中藥組、西藥組和模型組之間穿臺(tái)次數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組幼鼠Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果（）

表1 各組幼鼠Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果（）

注：與其余各組相比，1）P<0.05；與假手術(shù)組和空白組比較，2）P<0.05，與空白組比較，3）P<0.05。

2.2 腦組織尼氏染色結(jié)果 尼氏染色結(jié)果顯示，模型組幼鼠結(jié)扎側(cè)腦組織神經(jīng)元數(shù)目缺失，核固縮，淡染；空白組及假手術(shù)組幼鼠同側(cè)腦組織神經(jīng)元表達(dá)正常，呈紫藍(lán)色，形態(tài)正常。中藥組和西藥組幼鼠結(jié)扎側(cè)腦組織神經(jīng)元表達(dá)情況較模型組有所改善。見(jiàn)圖1、表2。

表2 各組幼鼠腦組織尼氏小體計(jì)數(shù)結(jié)果（，個(gè)）

表2 各組幼鼠腦組織尼氏小體計(jì)數(shù)結(jié)果（，個(gè)）

注：與其余各組相比，1）P<0.05。

2.3 透射電鏡分析結(jié)果 透射電鏡下，觀(guān)察腦組織突觸超微結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)：模型組突觸數(shù)目減少，突觸小泡不豐富，突觸內(nèi)線(xiàn)粒體數(shù)量偏少，結(jié)構(gòu)不清，突觸前膜不清晰，突觸后膜變薄，突觸間隙增寬；中藥組以上情況改善明顯，西藥組有所改善。見(jiàn)圖2、圖3 和表3。

圖2 術(shù)后第14 天各組幼鼠腦組織電鏡（×20000）

圖3 術(shù)后第14 天各組幼鼠腦組織電鏡（×50000）

表3 各組幼鼠電鏡下突觸計(jì)數(shù)及突觸后致密物厚度測(cè)定結(jié)果（）

表3 各組幼鼠電鏡下突觸計(jì)數(shù)及突觸后致密物厚度測(cè)定結(jié)果（）

注：與其余各組相比，1）P<0.05

2.4 WB 檢測(cè)腦組織海馬區(qū)PSD-95、NMDAR-2B 蛋白表達(dá)結(jié)果 WB 檢測(cè)顯示模型組幼鼠患側(cè)腦組織海馬區(qū)PSD-95、NMDAR-2B 表達(dá)減少（P ＜0.05）。中藥組和西藥組PSD-95、NMDAR-2B 表達(dá)較模型組增多（P ＜0.05），與假手術(shù)組和空白組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各組幼鼠腦組織PSD-95、NMDAR-2B 蛋白定量結(jié)果（）

表4 各組幼鼠腦組織PSD-95、NMDAR-2B 蛋白定量結(jié)果（）

注：與假手術(shù)組、空白組比較，1）P＞0.05；與其余各組比較，2）P＜0.05。

3 討論

HIBD 是兒童死亡及神經(jīng)損害的重要原因，特別是新生兒時(shí)期HIBD 常導(dǎo)致長(zhǎng)久性神經(jīng)功能障礙，出現(xiàn)神經(jīng)殘疾性疾病、神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病等。發(fā)育期腦組織缺氧缺血條件下，約25%患兒會(huì)遺留嚴(yán)重的神經(jīng)心理后遺癥，如腦性癱瘓、癲癇、智力發(fā)育障礙、精神行為障礙等，嚴(yán)重影響HIBD 幸存者的生活質(zhì)量[3]。據(jù)估計(jì)，發(fā)達(dá)國(guó)家足月新生兒HIBD 發(fā)生率為2‰～4‰，發(fā)展中國(guó)家是其20～30 倍，早產(chǎn)兒發(fā)生率更高[4]。

缺氧缺血致使突觸囊泡、突觸后致密物及突觸黏附分子失常，突觸發(fā)育障礙，是HIBD 遠(yuǎn)期神經(jīng)功能異常，出現(xiàn)行為、認(rèn)知障礙的重要原因[5]。突觸功能穩(wěn)定性是神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)的前提，因此，如何恢復(fù)突觸穩(wěn)態(tài)是HIBD 后神經(jīng)修復(fù)與再生的研究熱點(diǎn)。突觸可塑性是指突觸在一定條件下調(diào)整功能、改變形態(tài)、增加或減少突觸數(shù)目的能力，既包括形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，如突觸后致密物質(zhì)（PSD）增厚或變薄等，也包括傳遞效能的變化，神經(jīng)突觸可塑性被認(rèn)為是學(xué)習(xí)和記憶的發(fā)生機(jī)制[6]。谷氨酸受體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中極為重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)受體，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中突觸前膜釋放的谷氨酸主要與突觸后膜的2 種離子型谷氨酸受體結(jié)合從而發(fā)揮功能活性，即N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDAR）和α-氨基-3 羥基-5 甲基-4 異惡唑受體（AMPAR）[7]。NMDAR 與神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合后，信號(hào)蛋白受到刺激激活其下游信號(hào)通路，完成NMDAR 對(duì)突觸可塑性的調(diào)節(jié)[8]。另外，PSD-95 既是位于突觸后膜的結(jié)構(gòu)蛋白，又是離子通道與下游效應(yīng)器銜接的銜接蛋白，通過(guò)串集、錨定的作用介導(dǎo)神經(jīng)沖動(dòng)信號(hào)的傳導(dǎo)，使NMDAR 族集在突觸的活性區(qū)，保證NMDA 受體集中在特定區(qū)域，使興奮性突觸信號(hào)能夠有效傳遞，從而參與受體和信號(hào)蛋白的突觸前膜的定位、哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育以及突觸的可塑性與穩(wěn)定性，與神經(jīng)系統(tǒng)多種生理及病理活動(dòng)具有密切關(guān)系[7，9-12]。

新生兒缺氧缺血性腦損傷在中醫(yī)學(xué)中無(wú)專(zhuān)有病名，據(jù)其臨床癥狀，可歸屬于中醫(yī)學(xué)“五硬”“痿證”“五軟”“五遲”等范疇。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐，結(jié)合中醫(yī)整體觀(guān)念、辨證論治等理論，本研究團(tuán)隊(duì)提出“痰”和“瘀”是HIBD 重要病理因素，“痰瘀阻竅，經(jīng)絡(luò)不通”是其主要發(fā)病機(jī)制，提出對(duì)HIBD 的治療要注重活血化瘀、通經(jīng)開(kāi)竅，創(chuàng)制了蒲金口服液，取得了良好的臨床療效。蒲金口服液由石菖蒲、郁金、丹參、紅花組成，具有化痰開(kāi)竅、活瘀通絡(luò)之效。前期相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，蒲金口服液能夠減少一氧化氮合酶（NOS）合成、減輕一氧化氮（NO）造成的腦損傷，還能提高超氧化物歧化酶（SOD）活性，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)；蒲金口服液治療后，腦癱模型動(dòng)物腦室周?chē)踪|(zhì)軟化情況有所改善，腦組織病理?yè)p害減輕[13]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，HIBD 幼鼠腦組織神經(jīng)元數(shù)目下降，海馬區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu)被破壞，經(jīng)蒲金口服液干預(yù)后，其學(xué)習(xí)記憶能力較模型組有明顯改善（P ＜0.05）。藥物干預(yù)組幼鼠腦組織中PSD-95、NMDAR-2B 表達(dá)較模型組增強(qiáng)（P ＜0.05）。因此，蒲金口服液對(duì)HIBD 幼鼠的治療效果可能與減少神經(jīng)元凋亡和增強(qiáng)PSD-95、NMDAR-2B 的表達(dá)，維護(hù)神經(jīng)突觸穩(wěn)態(tài)有關(guān)，提示蒲金口服液可能通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)突觸的修復(fù)達(dá)到治療目的。