孫佳瑤，宗 斌，謝雨桐，徐全臣

Wnt/β-catenin信號通路與NF-κB信號通路都具有高度保守性，參與調控多種生物學進程。近年來研究發(fā)現(xiàn)，二者之間存在錯綜復雜的調控關系，不僅對炎癥、免疫、腫瘤等的發(fā)生發(fā)展產生影響，在組織再生領域也影響深遠。間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有多向分化潛能和免疫調節(jié)性，能夠參與和促進組織的修復，是組織工程“三要素”之一。對于因炎癥、免疫失調、腫瘤等病理狀況導致的機體穩(wěn)態(tài)失衡及組織破壞，干細胞療法被視為一種具有廣泛應用前景的治療手段。Wnt/β-catenin信號通路與NF-κB信號通路之間的交叉調控，能夠影響間充質干細胞的多向分化，進而影響組織的再生和修復。

1 Wnt/β-catenin 信號通路

Wnt/β-catenin信號通路又稱經典Wnt信號通路，在正常成熟細胞中處于沉默狀態(tài)。人類基因組中含有19個Wnt基因[1]，相關Wnt蛋白在結構和功能上高度保守，并且在某些細胞類型中選擇性表達。在沉默狀態(tài)下，細胞質中的β-catenin與結腸腺瘤性息肉病蛋白(adenoma polyposis coli，APC)、軸蛋白(Axin)、糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)以及酪蛋白激酶1(casein kinase1，CK1)所形成的降解復合體相結合，促使β-catenin磷酸化泛素化降解。當細胞外Wnt蛋白與細胞膜表面卷曲蛋白(Frizzled，F(xiàn)ZD)受體或低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6)結合時，即可激活該通路，并激活細胞質內的蓬亂蛋白 (dishevelled，Dsh/Dvl)，使降解復合體失活，游離的β-catenin不再泛素化和降解，而是發(fā)生核轉位，與T細胞因子(T cell factor，TCF)/淋巴樣增強因子(lymphoid enhancer factor，LEF)家族結合，從而促進靶基因的表達。Wnt/β-catenin信號通路在炎癥、免疫調節(jié)和腫瘤的發(fā)生發(fā)展等過程中發(fā)揮了重要作用。目前研究認為該通路在調控MSCs多向分化方面至關重要[2-3]。研究表明，Wnt/β-catenin信號通路還可與其他通路產生交叉影響，如NF-κB、Smad-3、Notch、HIF-1α等，使其功能得到擴展[4-7]。

2 NF-κB信號通路

NF-κB家族主要包括5個成員，NF-κB1(p105/p50)、NF-κB2(p100/p52)、RelA(p65)、RelB和c-Rel。所有成員的N端都含有Rel同源結構域：核定位信號序列、二聚化區(qū)域、DNA 結合區(qū)，RelA(p65)、RelB、c-Rel的C末端含有促進基因轉錄的反式激活域。NF-κB的各成員可組成多種二聚體，但只有含有RelA(p65)、Rel B、c-Rel的異源二聚體具有生物活性。在沉默狀態(tài)下，NF-κB在細胞質內與其抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)相結合，不具備轉錄活性。該通路可由諸多外界刺激如細胞因子、生長因子、微生物產物、應激誘導以及T細胞受體的參與等激活，這些刺激因子與細胞膜上的腫瘤壞死因子受體超家族和白細胞介素-1受體/Toll樣受體(Toll-like receptor， TLR)超家族，以及T細胞受體或細胞內介質相結合，激活 IκB激酶(IκB kinase，IKK)復合物，后者磷酸化IκB，隨后IκB發(fā)生泛素化并降解，NF-κB二聚體釋放，激活后移位至細胞核，調節(jié)目的基因的表達。目前證據表明NF-κB信號通路在調節(jié)MSCs的多向分化方面具有雙向性[8]，據報道該通路對骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的骨向分化、成軟骨分化及肌成纖維細胞分化具有負向調控作用[9-11]，但也有人提出TNF-α能夠通過激活NF-κB通路促進BMSCs的成骨分化[12]。

3 Wnt/β-catenin通路與NF-κB通路的相互作用

Wnt/β-catenin通路與NF-κB通路之間的相互交叉影響使二者的功能得到擴展，并形成了一個更加復雜的調控網絡。Wnt/β-catenin通路通過與NF-κB通路的相互作用來調節(jié)炎癥和免疫反應；反之，NF-κB通路也影響Wnt/β-catenin通路的活性。根據細胞或組織環(huán)境的不同，目前已觀察到二者之間存在正向及負向的雙向交叉調控。這兩條通路之間的相互作用不僅可以顯著影響炎癥、免疫反應和癌癥的進展，還被證實與MSCs多向分化密切相關。因此了解二者交叉調控的分子基礎有助于闡明MSCs在免疫炎癥反應及腫瘤等相關疾病發(fā)揮治療作用的病理生理機制，并有助于進一步針對相關靶點開發(fā)更具體更有效的治療方案。

3.1 Wnt/β-catenin通路對NF-κB通路的調控

Deng等[13]在對人結腸和乳腺腫瘤的研究中，首次發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin通路對NF-κB通路的負向調控。該研究發(fā)現(xiàn)，激活的β-catenin可與p65、p50形成復合物，抑制NF-κB通路與DNA的結合、反式激活活性。激活的β-catenin可使NF-κB通路的靶基因FAS表達降低，因此可能與FAS介導的腫瘤發(fā)生有關。在乳腺和結腸腫瘤細胞中，觀察到激活的β-catenin對NF-κB通路具有抑制作用[14]。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)肝膽管上皮細胞內的β-catenin能夠抑制NF-κB通路的活性；肝膽管上皮細胞內β-catenin基因敲除后，p65核轉位明顯增強，受損肝臟出現(xiàn)明顯炎癥及纖維化、肝再生延遲[15]。除腫瘤細胞外，在軟骨細胞、成纖維細胞、上皮細胞、成骨細胞和肝細胞等非腫瘤細胞內，也發(fā)現(xiàn)了β-catenin對NF-κB通路的抑制作用[16]。Wnt3a抑制劑不僅可抑制Wnt/β-catenin通路的激活，同時降低NF-κB的核轉位和活性，下調大鼠脊髓NMDA受體的表達，減輕瑞芬太尼引起的痛覺減退[17]。

Wnt/β-catenin通路也能夠正向調控NF-κB通路。在人星形膠質細胞內，β-catenin敲除后，NF-κB的活性降低了70%[18]。Zhou等[19]也發(fā)現(xiàn)，在成纖維細胞中的β-catenin敲除后，缺血腎臟中FAS配體的表達受到抑制，說明成纖維細胞特異性的β-catenin可通過NF-κB通路保護腎臟，抑制其細胞凋亡。過表達的β-catenin及相關的Wnt家族蛋白可啟動Wnt/β-catenin通路，通過促進IκB-α的降解，反式激活NF-κB，但該過程并未影響IKK活性[20]。在血管平滑肌細胞中，Wnt 1可通過激活β-catenin/ TCF4介導的β-轉導重復相容蛋白(β-transducin repeat-containing protein， β-TrCP)，間接增強NF-κB通路活性[21]。在人結腸癌細胞中也發(fā)現(xiàn)，β-catenin/ TCF4復合體呈時間劑量依賴性轉錄激活RelA啟動子，上調RelA的表達，啟動NF-κB通路，進而調控有關細胞增殖和細胞死亡的靶基因，影響結直腸癌的進展[22]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)β-catenin-TCF/LEF復合物可與NF-κB靶基因的啟動子結合，例如C反應蛋白和基質金屬蛋白酶13，與NF-κB共同上調NF-κB靶基因的轉錄[23]。以上證據表明Wnt/β-catenin通路各組分可通過多種途徑間接正向調控NF-κB通路。

3.2 NF-κB通路對Wnt/β-catenin通路的調控

目前研究證實，NF-κB可通過調節(jié)影響β-catenin活性和穩(wěn)定性的靶基因的表達，間接調控Wnt/β-catenin通路。Chang等[24]發(fā)現(xiàn)NF-κB可通過誘導E3泛素蛋白連接酶SMAD泛素化調節(jié)因子1(SMAD ubiquitination regulatory factor 1， Smurf1)和Smurf2，從而促進β-catenin降解，抑制MSCs的成骨分化能力。Pei等[25]在類固醇相關的股骨頭壞死小鼠模型中發(fā)現(xiàn)TLR4/NF-κB過度激活后，可能在早期通過影響DKK1和GSK3β的活性，抑制Wnt/β-catenin通路，進而影響其級聯(lián)靶基因如成骨、血管生成和脂肪細胞的分化。

NF-κB通路也能夠正向調控Wnt/β-catenin通路的表達。NF-κB通路激活后，Wnt1、Wnt3a和Wnt5a等Wnt相關蛋白表達升高，表明Wnt/β-catenin信號通路被激活[26]。抑制NF-κB，能夠減弱GM-CSF和TSLP的啟動子活性，進而降低β-catenin及其下游基因的表達，抑制乳腺癌的發(fā)展[27]。在小鼠模型的去分化誘導腸腫瘤發(fā)生研究中發(fā)現(xiàn)，NF-κB作為β-catenin/ TCF轉錄輔助因子，激活后可增強后者信號的表達強度，并誘導具有腫瘤早期特性的非干細胞去分化[28]。近年研究還發(fā)現(xiàn)，小白菊內酯對NF-κB的抑制作用可下調dickkopf相關蛋白1(DKK1 dickkopf-related protein 1)從而激活Axin2和β-catenin，也提示NF-κB通路對Wnt/β-catenin信號通路具有調控作用[29]。此外，RelA/p50二聚體通過CBP與靶基因的β-catenin/TCF轉錄復合物結合，能夠增強部分干細胞特征性基因的活性，如Lgr5、Asc1和Sox9等[16]。

3.3 Wnt/β-catenin通路與NF-κB通路的交叉位點

3.3.1 GSK-3β GSK-3β是Wnt/β-catenin信號通路重要的調節(jié)信號，GSK-3β磷酸化可阻止β-catenin的降解，使后者得以積聚轉入核內，從而促進靶基因的表達。研究表明，GSK-3β能夠通過調節(jié)β-catenin和p65的核轉位來介導β-catenin和NF-κB信號轉導[30]。GSK-3β的抑制劑IMX可以減弱IKKβ的磷酸化，抑制NF-κB p65在核內的積聚，阻止神經元的凋亡[31]。Su等[32]發(fā)現(xiàn)GSK-3β的抑制劑還可以通過抑制TLR/MyD88通路，進而下調NF-κB p65的磷酸化，減輕氧化應激引起的損傷和下游炎癥因子的產生。研究表明GSK-3β抑制劑氯化鋰不僅能夠激活BMSCs中Wnt/β-catenin信號通路增強其成骨及成脂分化能力[33]；還可以繞過IKK上調IκB-α的表達促進p65/RelA磷酸化，激活NF-κB通路，驅動衰老相關分泌表型基因的表達，參與調控細胞凋亡[34]。但也有學者提出在激活的T細胞內，GSK-3β過表達后，能夠阻礙IκB-α的降解；而抑制GSK-3β則使NF-κB靶基因表達下調[35]。反之，磷酸化的NF-κB p65能夠誘導肝細胞中GSK-3β的磷酸化，促進肝細胞增殖，誘導肝細胞癌的發(fā)生[36]。以上證據均表明GSK-3β是兩條通路交叉調控的關鍵靶點。

3.3.2 Wnt3a 前文已述，抑制Wnt3a的表達可降低NF-κB的核轉位和活性，下調大鼠脊髓中NMDA受體的表達，有助于減輕瑞芬太尼引起的痛覺減退癥狀[17]，但在該過程中Wnt3a對NF-κB通路的具體調節(jié)機制仍未知。在脂多糖誘導的炎癥反應中，單核細胞內Wnt3a-Dvl3激活可增強GSK-3β磷酸化，使β-catenin積聚發(fā)生核移位，靶基因表達增強，減輕炎癥反應。進一步研究還發(fā)現(xiàn)，抑制Wnt3a-Dvl3的表達可顯著增強NF-κB的活性，而Dvl3或β-catenin過表達則可消除上述影響；在使用NF-κB抑制劑后，炎癥相關因子表達明顯減弱。表明Wnt3a-Dv13/β-catenin軸可通過下調脂多糖刺激單核細胞中NF-κB的活性來抑制炎癥反應[37]。有學者提出，Wnt3a可以通過抑制GSK-3β-NF-κB的相互作用下調衰老相關分泌表型基因的表達，抑制MSCs衰老并促進其增殖[38]。但在MSCs多向分化方面，對于Wnt3a所參與的兩條通路的交叉調控目前尚未有相關研究。

3.3.3 DKK1 DKK1是Wnt/β-catenin信號通路的抑制劑，通過結合和誘導LRP6內化來阻止Wnt信號的傳遞。研究發(fā)現(xiàn)DKK1可劑量依賴性地下調核NF-κB水平，減弱內毒素誘導的炎癥反應[39]。Zhang等[29]也發(fā)現(xiàn)，小白菊內酯可通過抑制NF-κB活性，下調DKK1的水平，增強Axin2和β-catenin表達，使Wnt/β-catenin通路的活性增強，增強牙周膜干細胞的骨向分化能力。此外還有報道，TNF-α可通過激活NF-κB通路下調miR-335-5P的表達水平，從而抑制DKK1的活性，進而刺激Wnt/β-catenin通路的活性，影響成骨細胞的成骨能力[40]。

3.3.4 IKK IKKβ是IKK亞基之一，不僅可以調控IκB的磷酸化，也可以促進β-catenin磷酸化，為β-TrCP介導的泛素化而準備，抑制Wnt/β-catenin信號通路活性，促進MSCs的脂向分化能力、抑制其骨向分化能力[41]。Xu等[42]發(fā)現(xiàn)小鼠牙周炎牙合創(chuàng)傷模型中，IκB和p65磷酸化增強，激活NF-κB通路，同時也抑制β-catenin的表達，下調成骨相關基因，體內成骨明顯受到抑制；但IKK抑制劑處理后，NF-κB表達受到抑制，β-catenin表達則增強，成骨細胞成骨能力明顯增強。表明IKK是兩條信號通路之間相互作用的重要交叉位點。在對炎癥微環(huán)境下的BMSCs的研究中也發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象[24]。炎癥因子通過激活IKK-NF-κB，促進了β-catenin的泛素化降解，抑制MSCs的成骨能力；但IKK抑制劑成功逆轉該現(xiàn)象，上調了β-catenin的表達，恢復了MSCs因炎癥刺激而受損的成骨能力。

4 Wnt/β-catenin與NF-κB的交互調控對間充質干細胞分化及組織再生的影響

MSCs是一種具有自我更新能力和多向分化能力的基質細胞。它可以從多種組織中分離出來，如乳腺、臍帶、子宮內膜息肉、骨髓、脂肪組織、牙齦、牙周膜、肺組織等，因其來源豐富及其易獲得性，被認為是最適用于實驗及臨床研究的干細胞。根據其來源組織，MSCs可發(fā)揮具有一定組織特異性的再生能力，參與因炎癥、免疫失調、腫瘤等原因引起的受損組織的修復與再生。Wnt/β-catenin與NF-κB的相互作用已被證實能夠參與調控MSCs的多向分化，成為利用干細胞療法獲得組織再生修復的重要靶點。

4.1 骨髓間充質干細胞

BMSCs是目前研究最多的MSCs。目前認為Wnt/β-catenin信號通路與MSCs成骨分化密切相關。研究發(fā)現(xiàn)在炎癥微環(huán)境中，TNF-α通過IKK-NF-κB通路誘導Smurf1和Smurf2的表達，促進β-catenin的泛素化和降解，進而抑制Wnt/β-catenin信號通路表達，削弱MSCs的成骨分化；但IKK抑制劑的應用能夠逆反上述現(xiàn)象，促進BMSCs的成骨能力[24]。這表明靶向抑制IKK-NF-κB，不僅能夠減輕NF-κB通路介導的炎癥反應，還能夠恢復因炎癥而受損的BMSCs再生能力。目前證據表明IKKβ是肥胖、炎癥與代謝紊亂之間的關鍵分子[43]。研究發(fā)現(xiàn)IKKβ也具有β-catenin激酶作用，能夠通過調控Wnt/β-catenin信號通路間接調節(jié)BMSCs的多向分化[41]。IKKβ可以通過促進β-catenin個別氨基酸位點的磷酸化，為β-TrCP介導的β-catenin泛素化做準備，促進BMSCs的成脂分化能力。而IKKβ缺陷的BMSCs，其成骨能力明顯增強，成脂能力減弱。動物實驗也證實BMSCs中IKKβ的缺失增加了骨皮質厚度，這對于肥胖引起的骨密度降低具有重要的治療意義。此外，有學者發(fā)現(xiàn)，TNF-α可通過刺激NF-κB信號通路活性，上調miR-150-3p的表達，進而調節(jié)β-catenin的表達水平，抑制人BMSCs的成骨能力[44]。這對于骨關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎等炎癥狀態(tài)下的骨相關疾病的干細胞治療意義重大。

4.2 牙周膜干細胞

在炎癥微環(huán)境下，Wnt/β-catenin信號通路與NF-κB信號通路能夠調節(jié)牙周骨質代謝，影響牙周炎癥的發(fā)生，在牙周膜干細胞成骨再生方面具有重要意義。牙周炎患者的牙周組織處于炎癥微環(huán)境下，牙周膜干細胞的成骨能力受到抑制。在牙周炎患者的牙周膜干細胞中，NF-κB信號通路可被直接激活，也可以通過抑制PI3K的活性間接激活，進而阻斷GSK-3β的磷酸化，導致細胞核中p65和β-catenin的表達水平升高，使牙周炎患者的牙槽骨形成受到抑制[30]。但這與健康牙周膜干細胞中的結果并不一致，說明兩條通路的交叉調控還受到炎癥微環(huán)境的影響。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)在根尖周炎的根尖組織中，兩條通路均被激活，隨之的動物實驗進一步證實，NF-κB抑制劑的應用阻斷了Wnt3a/β-catenin信號通路的激活，使內毒素刺激后的牙周膜干細胞的炎癥反應顯著減輕[4]，有助于根尖周炎炎癥的消退、恢復牙周膜干細胞的再生潛能，促進根尖周受損組織修復。

4.3 肺間充質干細胞

在人肺間充質干細胞中，IL-1β可以通過NF-κB信號通路增強miR-433表達，后者可抑制DKK1活性，促進β-catenin的表達，激活Wnt/β-catenin信號通路，刺激肺間充質干細胞血管再生能力，有助于肺損傷后的組織修復[45]。還有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α在激活NF-κB信號促進肺間充質干細胞向肌成纖維細胞分化的同時，可上調β-catenin的表達。進一步體內研究也證實抑制NF-κB信號可下調β-catenin表達，減弱肺間充質干細胞向肌成纖維細胞的分化，并緩解博萊霉素誘導的肺纖維化病變[46]。雖然具體機制仍有待探索，但目前研究表明NF-κB與Wnt/β-catenin信號通路的交叉調控有希望成為肺纖維化治療的新的研究方向。

4.4 脂肪干細胞

前文已述，IKKβ目前被認為是肥胖、炎癥與代謝紊亂之間的關鍵調節(jié)分子[43]。研究表明肥胖導致的機體慢性輕度炎癥是2型糖尿病和動脈粥樣硬化發(fā)展的主要因素，同時臨床數(shù)據也表明，肥胖受試者腹部脂肪中IKKβ的總蛋白及磷酸化蛋白水平顯著升高，且與體重指數(shù)明顯相關。Sui等[41]在體外實驗發(fā)現(xiàn)，過表達的IKKβ可通過促進β-catenin的磷酸化和泛素化，抑制Wnt/β-catenin通路活性，增強脂肪干細胞成脂分化潛能，抑制其成骨能力。靶向抑制IKKβ可能不僅有助于減輕炎癥反應，還有助于抑制脂肪生成，這對于肥胖患者相關疾病的治療意義重大。

4.5 乳腺干細胞

在乳腺組織中，NF-κB通路的激活能夠增強miRNA-31的表達，后者通過靶向調控Axin1、GSK-3β和DKK1的表達，激活Wnt/β-catenin信號通路，上調β-catenin的活性，參與維持多能乳腺干細胞的自我更新及增殖，并抑制其向腔細胞或腺泡細胞的分化[47]。在乳腺干細胞自我更新和分化之間取得平衡有助于維持乳腺的組織動態(tài)平衡，這對乳腺發(fā)育和乳腺癌個體發(fā)育至關重要。

此外，除上述MSCs外，在牙髓干細胞內也發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路與NF-κB信號通路共同參與干細胞的多向分化[48]，但關于二者之間交叉調控的具體機制仍有待探索。

5 總 結

本文就近年來對Wnt/β-catenin信號通路與NF-κB信號通路之間的相互作用研究進行了總結，并針對二者的交叉調控在參與MSCs多向分化有關方面進行了描述。在利用MSCs獲得組織再生時，我們可充分借助Wnt/β-catenin信號通路與NF-κB信號通路之間的交叉調控，以最大限度地利用MSCs的多向分化，獲得更加理想的組織再生與修復；還可以借助相關信號通路的輔助因子，或直接作用于靶基因，避開二者的交叉作用位點，以規(guī)避負反饋影響[16]?？傊?，了解Wnt/β-catenin信號通路與NF-κB信號通路之間交叉調控具體分子機制有助于開發(fā)針對具體靶點的藥物，對于利用MSCs的多向分化獲得組織再生、修復受損組織具有重要的研究價值和臨床意義，對今后相關的干細胞研究工作也具有重要的指導作用。