◎梁 磊，陳春輝

（甘肅省張掖市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，甘肅 張掖 734000）

蘇丹紅為親脂性偶氮化合物，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四種，主要用于工業(yè)染色，因?yàn)槲覈?guó)食品藥品監(jiān)督管理局禁止將蘇丹紅作為食品添加劑用于改變食品的外觀和色澤。在番茄制品中，番茄紅素[1]的含量是評(píng)判番茄制品等級(jí)的重要依據(jù)。但是，由于番茄紅素穩(wěn)定性較差，不利于長(zhǎng)期保存，考慮到其吸收波長(zhǎng)與蘇丹紅較為接近，且番茄制品中番茄紅素含量的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[2]以蘇丹紅[3]作為參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，所以，部分不法商戶為了牟取利益，以添加蘇丹紅的方式提高番茄紅素的檢測(cè)值。

作為食品中非法添加的蘇丹紅I 色素檢測(cè)方法主要包括高效液相色譜法（HPLC）[4-5]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS）[6]和氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法[7]等。其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法雖靈敏度高、分辨率好，但存在較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，對(duì)前處理要求高，檢測(cè)成本較大；雖然已有報(bào)道采用免疫法[8]、電化學(xué)分析法[9]等新手段可以減少基質(zhì)感染，獲得較為準(zhǔn)確的結(jié)果，但因設(shè)備或相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的普及程度難以大規(guī)模應(yīng)用。高效液相色譜法普及性好，同時(shí)在使用二極管陣列檢測(cè)器時(shí)可以通過(guò)光譜進(jìn)行輔助定性，所以在蘇丹紅的檢測(cè)上得到了廣泛應(yīng)用。本研究嘗試以高效液相色譜法為檢驗(yàn)方法，通過(guò)優(yōu)化樣品前處理方法，以期達(dá)到對(duì)番茄醬中蘇丹紅I 的準(zhǔn)確檢驗(yàn)，為日常監(jiān)管與檢驗(yàn)提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番茄醬樣品均購(gòu)自當(dāng)?shù)爻?。蘇丹紅Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所）；甲醇、乙腈、丙酮、正己烷、二氯甲烷（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；中性氧化鋁（100～200 目，天津光復(fù)化學(xué)試劑公司）；實(shí)驗(yàn)用水為密理博純水系統(tǒng)（美國(guó)）制得的超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A 型高效液相色譜儀（日本島津公司），配SPD-M20A 型光電二極管陣列檢測(cè)器和Labsolution工作站；SB25-120 型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；渦旋儀；ME204 型電子天平（梅特勒-托利多）；移液槍（賽默飛世爾）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

蘇丹紅I 標(biāo)準(zhǔn)中間液（2.0 μg/mL）：用移液槍準(zhǔn)確吸取500 μL 蘇丹紅I 標(biāo)準(zhǔn)溶液，以正己烷定容至25 mL。

蘇丹紅I 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配置：分別用移液槍準(zhǔn)確吸取蘇丹紅I 標(biāo)準(zhǔn)中間液0.1、0.15、0.25、0.75、1.00 mL，將正己烷定容至1 mL，制成0.1、0.15、0.25、0.75、1.00 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。

1.4 樣品的制備

精密稱取10 g 樣品，放入離心管，加入10 mL 水將其分散成糊狀，加入30 mL 正己烷：丙酮（3:1）混合溶液，渦旋5 min，4 000 r/min 離心10 min，吸出正己烷層，重復(fù)上述操作2 遍，合并3 次正己烷，加入無(wú)水硫酸鈉5 g 脫水，旋蒸至干，加5 mL 正己烷復(fù)溶，慢慢加入氧化鋁層析柱，待吸附完全后，使用正己烷10 mL 進(jìn)行洗脫，棄去洗脫液，然后用5%丙酮正己烷50 mL 洗脫，收集洗脫液，氮吹至近干，加丙酮5 mL 復(fù)溶，過(guò)0.45 μm 濾膜后進(jìn)樣。

1.5 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18 色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)分別為478 nm。流動(dòng)相A 為0.1%甲酸水-乙腈（85:15），流動(dòng)相B 為0.1%甲酸乙腈-丙酮（80:20），截取15 min 采集數(shù)據(jù)。采用梯度洗脫，見(jiàn)表1。

表1 梯度條件表

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離條件與檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

通過(guò)比較乙腈-水、甲醇-水、水-乙腈-丙酮等體系，分離效果并未出現(xiàn)較大差別。但考慮食品樣品本身因制作工藝不同而導(dǎo)致的基質(zhì)影響差異，所以在流動(dòng)相中加入0.1%甲酸，讓整體流動(dòng)相呈現(xiàn)酸性，來(lái)保證洗脫時(shí)的保留時(shí)間穩(wěn)定性。通過(guò)光譜結(jié)果可知，蘇丹紅I 色素最大吸收波長(zhǎng)出現(xiàn)在478 nm 處，且在該波長(zhǎng)下被測(cè)物無(wú)干擾，故選擇該波長(zhǎng)作為蘇丹紅I 的檢測(cè)波長(zhǎng)。樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 蘇丹紅1 樣品典型圖譜圖

2.2 樣品提取劑的確定

根據(jù)蘇丹紅I 的化學(xué)性質(zhì)，其具有較強(qiáng)的脂溶性，所以在提取時(shí)，直接選擇具有弱極性的正己烷作為提取劑，一方面是增加蘇丹紅I 的提取效率，另一方面也避免了引入過(guò)多極性雜質(zhì)，為后續(xù)凈化提供便利條件。

2.3 凈化方式的優(yōu)化

因蘇丹紅I 化學(xué)結(jié)構(gòu)中富含共軛結(jié)構(gòu)，可以被氧化鋁所吸附，且正己烷可以在洗脫油脂等干擾組分的同時(shí)，保證被吸附的蘇丹紅I 不被洗脫，所以，蘇丹紅I 提取液凈化條件的選擇在相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定為采用降活處理的中性氧化鋁作為吸附劑，經(jīng)正己烷淋洗去除油脂和其他雜質(zhì)后，以5%丙酮正己烷溶液作為洗脫液進(jìn)行洗脫。該方法中因氧化鋁活性因生產(chǎn)廠家不同存在一定差異，且烘干溫度與時(shí)間都會(huì)對(duì)其活化效率產(chǎn)生影響，加水降活操作也會(huì)因?yàn)闄z驗(yàn)人員操作習(xí)慣不同，存在降活不均勻，降活程度差異大等問(wèn)題。所以，本方法采用105 ℃干燥2 h的充分活化方法，不進(jìn)行加水降活處理，盡可能保證氧化鋁活性的一致性，提高實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性。同時(shí)在洗脫過(guò)程中，通過(guò)嘗試不同比例丙酮-正己烷溶液，最后確定為采用含有30%丙酮的正己烷溶液作為淋洗液。通過(guò)對(duì)比，干擾峰明顯減少，凈化效果良好，具體參見(jiàn)圖2。

圖2 未凈化（左）與經(jīng)氧化鋁凈化（右）樣品譜圖

2.4 濾膜的選擇

在相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中，對(duì)于濾膜只規(guī)定為采用有機(jī)濾膜，但在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，采用常見(jiàn)尼龍（Nylon）材質(zhì)有機(jī)濾膜時(shí)，可以在過(guò)濾時(shí)看到濾膜上有明顯的紅色染料殘留，而聚四氟乙烯（PTFE）、聚偏二氟乙烯（PVDF）則無(wú)明顯吸附現(xiàn)象。考慮到日常其他實(shí)驗(yàn)中的通用型，最終選擇PTFE 濾膜。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 線性方程、檢出限與定量限結(jié)果

對(duì)0.1、0.15、0.25、0.75、1.00 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液分別進(jìn)樣，并進(jìn)行線性擬合，得到線性方程：f（x）=38 313.3×x，擬合度R2=0.999 5，曲線現(xiàn)行良好。同時(shí)，以S/N=3 為檢出限（LOD），S/N=10 為定量限（LOQ）進(jìn)行計(jì)算，得到該方法LOD 為7.4 μg/kg，LOQ為24.7 μg/kg，通過(guò)實(shí)際加標(biāo)相近濃度驗(yàn)證，也得到了相似結(jié)果。通過(guò)與國(guó)標(biāo)進(jìn)行比對(duì)，本方法測(cè)得的LOD 與LOQ 完全滿足常規(guī)檢測(cè)。

2.5.2 準(zhǔn)確度、回收率與精密度結(jié)果

本方法進(jìn)行三水平三平行加標(biāo)驗(yàn)證，分別稱取10 g空白基質(zhì)，加入0.1 mL，0.5 mL，1 mL 濃度為10 μg/mL的蘇丹紅I 標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成含0.1、0.5、1.0 μg/kg 的加標(biāo)樣品，依照上文方法進(jìn)行提取凈化后，對(duì)方法的回收率和精密度進(jìn)行評(píng)估，其中低水平為線性范圍的最低點(diǎn)，準(zhǔn)確度用加標(biāo)水平的回收率評(píng)價(jià)。結(jié)果如表2 所示。

表2 加標(biāo)回收率表

由表2 可知，該方法在線性范圍內(nèi)，均具有較穩(wěn)定的回收率，其平均回收率為92.61%，不同濃度范圍內(nèi)RSD 在1.22%～3.41%，說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確性良好。

取同一濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液（均取0.5 μg/mL），重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定其峰面積并計(jì)算RSD 值，結(jié)果小于2.0%，精密度良好。

3 結(jié)語(yǔ)

本試驗(yàn)對(duì)番茄醬中蘇丹紅I 號(hào)檢驗(yàn)方法進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)對(duì)提取溶劑、檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇、流動(dòng)相的優(yōu)化，有效縮短了出峰時(shí)間，改善了峰形。同時(shí)，針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)中中性氧化鋁柱填料活化/降活操作不穩(wěn)定的問(wèn)題，通過(guò)取消降活操作，優(yōu)化淋洗液比例的方式，有效提高了凈化穩(wěn)定性和凈化效果。通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，該方法穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性良好，精密度高，可以適用于番茄醬中蘇丹紅I 的日常檢測(cè)。