◎梁 磊,陳春輝
(甘肅省張掖市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)研究院,甘肅 張掖 734000)
蘇丹紅為親脂性偶氮化合物,包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四種,主要用于工業(yè)染色,因?yàn)槲覈?guó)食品藥品監(jiān)督管理局禁止將蘇丹紅作為食品添加劑用于改變食品的外觀和色澤。在番茄制品中,番茄紅素[1]的含量是評(píng)判番茄制品等級(jí)的重要依據(jù)。但是,由于番茄紅素穩(wěn)定性較差,不利于長(zhǎng)期保存,考慮到其吸收波長(zhǎng)與蘇丹紅較為接近,且番茄制品中番茄紅素含量的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[2]以蘇丹紅[3]作為參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),所以,部分不法商戶為了牟取利益,以添加蘇丹紅的方式提高番茄紅素的檢測(cè)值。
作為食品中非法添加的蘇丹紅I 色素檢測(cè)方法主要包括高效液相色譜法(HPLC)[4-5]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS)[6]和氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法[7]等。其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法雖靈敏度高、分辨率好,但存在較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng),對(duì)前處理要求高,檢測(cè)成本較大;雖然已有報(bào)道采用免疫法[8]、電化學(xué)分析法[9]等新手段可以減少基質(zhì)感染,獲得較為準(zhǔn)確的結(jié)果,但因設(shè)備或相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的普及程度難以大規(guī)模應(yīng)用。高效液相色譜法普及性好,同時(shí)在使用二極管陣列檢測(cè)器時(shí)可以通過(guò)光譜進(jìn)行輔助定性,所以在蘇丹紅的檢測(cè)上得到了廣泛應(yīng)用。本研究嘗試以高效液相色譜法為檢驗(yàn)方法,通過(guò)優(yōu)化樣品前處理方法,以期達(dá)到對(duì)番茄醬中蘇丹紅I 的準(zhǔn)確檢驗(yàn),為日常監(jiān)管與檢驗(yàn)提供方法參考。
番茄醬樣品均購(gòu)自當(dāng)?shù)爻?。蘇丹紅Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所);甲醇、乙腈、丙酮、正己烷、二氯甲烷(色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);中性氧化鋁(100~200 目,天津光復(fù)化學(xué)試劑公司);實(shí)驗(yàn)用水為密理博純水系統(tǒng)(美國(guó))制得的超純水。
LC-20A 型高效液相色譜儀(日本島津公司),配SPD-M20A 型光電二極管陣列檢測(cè)器和Labsolution工作站;SB25-120 型超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);渦旋儀;ME204 型電子天平(梅特勒-托利多);移液槍(賽默飛世爾)。
蘇丹紅I 標(biāo)準(zhǔn)中間液(2.0 μg/mL):用移液槍準(zhǔn)確吸取500 μL 蘇丹紅I 標(biāo)準(zhǔn)溶液,以正己烷定容至25 mL。
蘇丹紅I 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配置:分別用移液槍準(zhǔn)確吸取蘇丹紅I 標(biāo)準(zhǔn)中間液0.1、0.15、0.25、0.75、1.00 mL,將正己烷定容至1 mL,制成0.1、0.15、0.25、0.75、1.00 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。
精密稱取10 g 樣品,放入離心管,加入10 mL 水將其分散成糊狀,加入30 mL 正己烷:丙酮(3:1)混合溶液,渦旋5 min,4 000 r/min 離心10 min,吸出正己烷層,重復(fù)上述操作2 遍,合并3 次正己烷,加入無(wú)水硫酸鈉5 g 脫水,旋蒸至干,加5 mL 正己烷復(fù)溶,慢慢加入氧化鋁層析柱,待吸附完全后,使用正己烷10 mL 進(jìn)行洗脫,棄去洗脫液,然后用5%丙酮正己烷50 mL 洗脫,收集洗脫液,氮吹至近干,加丙酮5 mL 復(fù)溶,過(guò)0.45 μm 濾膜后進(jìn)樣。
色譜柱:ZORBAX SB-C18 色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);進(jìn)樣量10 μL;柱溫30 ℃;流速1.0 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)分別為478 nm。流動(dòng)相A 為0.1%甲酸水-乙腈(85:15),流動(dòng)相B 為0.1%甲酸乙腈-丙酮(80:20),截取15 min 采集數(shù)據(jù)。采用梯度洗脫,見(jiàn)表1。
表1 梯度條件表
通過(guò)比較乙腈-水、甲醇-水、水-乙腈-丙酮等體系,分離效果并未出現(xiàn)較大差別。但考慮食品樣品本身因制作工藝不同而導(dǎo)致的基質(zhì)影響差異,所以在流動(dòng)相中加入0.1%甲酸,讓整體流動(dòng)相呈現(xiàn)酸性,來(lái)保證洗脫時(shí)的保留時(shí)間穩(wěn)定性。通過(guò)光譜結(jié)果可知,蘇丹紅I 色素最大吸收波長(zhǎng)出現(xiàn)在478 nm 處,且在該波長(zhǎng)下被測(cè)物無(wú)干擾,故選擇該波長(zhǎng)作為蘇丹紅I 的檢測(cè)波長(zhǎng)。樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。
圖1 蘇丹紅1 樣品典型圖譜圖
根據(jù)蘇丹紅I 的化學(xué)性質(zhì),其具有較強(qiáng)的脂溶性,所以在提取時(shí),直接選擇具有弱極性的正己烷作為提取劑,一方面是增加蘇丹紅I 的提取效率,另一方面也避免了引入過(guò)多極性雜質(zhì),為后續(xù)凈化提供便利條件。
因蘇丹紅I 化學(xué)結(jié)構(gòu)中富含共軛結(jié)構(gòu),可以被氧化鋁所吸附,且正己烷可以在洗脫油脂等干擾組分的同時(shí),保證被吸附的蘇丹紅I 不被洗脫,所以,蘇丹紅I 提取液凈化條件的選擇在相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定為采用降活處理的中性氧化鋁作為吸附劑,經(jīng)正己烷淋洗去除油脂和其他雜質(zhì)后,以5%丙酮正己烷溶液作為洗脫液進(jìn)行洗脫。該方法中因氧化鋁活性因生產(chǎn)廠家不同存在一定差異,且烘干溫度與時(shí)間都會(huì)對(duì)其活化效率產(chǎn)生影響,加水降活操作也會(huì)因?yàn)闄z驗(yàn)人員操作習(xí)慣不同,存在降活不均勻,降活程度差異大等問(wèn)題。所以,本方法采用105 ℃干燥2 h的充分活化方法,不進(jìn)行加水降活處理,盡可能保證氧化鋁活性的一致性,提高實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性。同時(shí)在洗脫過(guò)程中,通過(guò)嘗試不同比例丙酮-正己烷溶液,最后確定為采用含有30%丙酮的正己烷溶液作為淋洗液。通過(guò)對(duì)比,干擾峰明顯減少,凈化效果良好,具體參見(jiàn)圖2。
圖2 未凈化(左)與經(jīng)氧化鋁凈化(右)樣品譜圖
在相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中,對(duì)于濾膜只規(guī)定為采用有機(jī)濾膜,但在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),采用常見(jiàn)尼龍(Nylon)材質(zhì)有機(jī)濾膜時(shí),可以在過(guò)濾時(shí)看到濾膜上有明顯的紅色染料殘留,而聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)則無(wú)明顯吸附現(xiàn)象。考慮到日常其他實(shí)驗(yàn)中的通用型,最終選擇PTFE 濾膜。
2.5.1 線性方程、檢出限與定量限結(jié)果
對(duì)0.1、0.15、0.25、0.75、1.00 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液分別進(jìn)樣,并進(jìn)行線性擬合,得到線性方程:f(x)=38 313.3×x,擬合度R2=0.999 5,曲線現(xiàn)行良好。同時(shí),以S/N=3 為檢出限(LOD),S/N=10 為定量限(LOQ)進(jìn)行計(jì)算,得到該方法LOD 為7.4 μg/kg,LOQ為24.7 μg/kg,通過(guò)實(shí)際加標(biāo)相近濃度驗(yàn)證,也得到了相似結(jié)果。通過(guò)與國(guó)標(biāo)進(jìn)行比對(duì),本方法測(cè)得的LOD 與LOQ 完全滿足常規(guī)檢測(cè)。
2.5.2 準(zhǔn)確度、回收率與精密度結(jié)果
本方法進(jìn)行三水平三平行加標(biāo)驗(yàn)證,分別稱取10 g空白基質(zhì),加入0.1 mL,0.5 mL,1 mL 濃度為10 μg/mL的蘇丹紅I 標(biāo)準(zhǔn)溶液,制成含0.1、0.5、1.0 μg/kg 的加標(biāo)樣品,依照上文方法進(jìn)行提取凈化后,對(duì)方法的回收率和精密度進(jìn)行評(píng)估,其中低水平為線性范圍的最低點(diǎn),準(zhǔn)確度用加標(biāo)水平的回收率評(píng)價(jià)。結(jié)果如表2 所示。
表2 加標(biāo)回收率表
由表2 可知,該方法在線性范圍內(nèi),均具有較穩(wěn)定的回收率,其平均回收率為92.61%,不同濃度范圍內(nèi)RSD 在1.22%~3.41%,說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確性良好。
取同一濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液(均取0.5 μg/mL),重復(fù)進(jìn)樣6 次,測(cè)定其峰面積并計(jì)算RSD 值,結(jié)果小于2.0%,精密度良好。
本試驗(yàn)對(duì)番茄醬中蘇丹紅I 號(hào)檢驗(yàn)方法進(jìn)行了優(yōu)化,通過(guò)對(duì)提取溶劑、檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇、流動(dòng)相的優(yōu)化,有效縮短了出峰時(shí)間,改善了峰形。同時(shí),針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)中中性氧化鋁柱填料活化/降活操作不穩(wěn)定的問(wèn)題,通過(guò)取消降活操作,優(yōu)化淋洗液比例的方式,有效提高了凈化穩(wěn)定性和凈化效果。通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明,該方法穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性良好,精密度高,可以適用于番茄醬中蘇丹紅I 的日常檢測(cè)。