何 凱，鄧 凡，嚴哲鈺，張尚志,2

（1.湖南人文科技學院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院，湖南 婁底 417000；2.湖南省農(nóng)田雜草防控技術(shù)與應用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 婁底 417000）

草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）是典型的鱗翅目害蟲，可危害作物超過350 種，主要取食以禾本科為主的農(nóng)作物，嚴重損害寄主作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。草地貪夜蛾的適應能力比較強，同時遷移速度快，繁殖能力強。自2019 年草地貪夜蛾進入我國云南地區(qū)以來，已在我國多個省份出現(xiàn)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來較大損失，嚴重影響我國農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2]。目前，關(guān)于草地貪夜蛾相關(guān)的研究主要集中在其發(fā)生發(fā)展及防治技術(shù)方面，但其分子生理尤其是與病毒侵染相關(guān)的分子機制研究相對較少。

蛋白激酶C 受體l（Receptor for Activated C Kinase1，RACKl）是細胞內(nèi)一種高度保守的銜接蛋白，在原核生物和真核生物中都有廣泛的表達[3]。RACK1蛋白于1991年被Daria首先用試驗證明存在，直到1994 年才被Ron 等[4]克隆表達出來。研究表明，RACK1 是一種穿梭蛋白，其作為PCK 的受體，在生命體內(nèi)發(fā)揮了重要作用[5]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，RACKl 參與到細胞分化、生長和凋亡以及胚胎發(fā)育等多個生命活動，并且均起到重要的調(diào)控作用。

目前已有多項研究證實RACK1 在病毒入侵過程中扮演著重要的角色。在MARC-145 細胞中，當干擾RACK1 表達后，豬生殖和呼吸道綜合癥病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的復制受到明顯的抑制[6]。家蠶RACK1蛋白能與家蠶質(zhì)型多角體病毒（Bombyx moricypovirus，BmCPV）上的蛋白結(jié)合，在病毒入侵過程中起著非常重要的作用[7]，同時也有研究表明家蠶RACK1 蛋白能與家蠶核型多角體病毒（Bombyx morinucleopolyhedrovirus，BmNPV）互作，暗示其可能在BmNPV 入侵過程中扮演著非常重要的角色，但具體的機制還有待深入研究[8]。另外，研究顯示，RACK1 能夠與VDAC2 以及雞傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）VP5 蛋白相互作用，形成一個復合體，通過抑制細胞的凋亡從而促進病毒的復制，表明RACK1 在IBDV 侵染過程中起著關(guān)鍵作用[9]。

目前，RACK1 在多種生物體中的相關(guān)功能都已被研究報道，然而，迄今為止關(guān)于草地貪夜蛾RACK1 的相關(guān)研究暫無報道。課題組前期從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選獲得了草地貪夜蛾的RACK1 序列，該研究通過生物信息軟件對草地貪夜蛾RACK1 進行生物信息學分析，同時分析RACK1 在草地貪夜蛾不同發(fā)育階段不同組織以及NPV 刺激后不同時間段的表達模式，探究草地貪夜蛾RACK1 的功能以及該基因是否應答NPV 刺激，為今后RACK1 應答NPV 侵染的深入研究及其生物防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

草地貪夜蛾由西南林業(yè)大學徐進教授惠贈。苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（AcMNPV）由實驗室前期保存，繁殖。高保真酶、DNA 純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒，克隆菌株Escherichia coli DH5α及pMD19-T 載體購自北京擎科生物科技有限公司；cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green Premix Ex Taq II 購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 草地貪夜蛾的飼養(yǎng)及材料收集草地貪夜蛾每頭幼蟲單獨飼養(yǎng)，用新鮮玉米葉喂食，在卵、幼蟲、蛹、蛾的時期收集材料。同時，在六齡期解剖幼蟲，收集各個組織，用DEPC 水清洗，去除雜質(zhì)和其他組織，置于離心管中，液氮冷凍，放入-80℃冰箱保存。

1.2.2 草地貪夜蛾接種病毒隨機挑選六齡草地貪夜蛾60 頭，再隨機平分為2 個組，每個組（試驗組和對照組）又分別設置3 個技術(shù)重復和生物學重復。將幼蟲饑餓處理數(shù)小時后，試驗組每頭經(jīng)口添食5 μL AcMNPV 病毒液（1×107個/mL），對照組經(jīng)口添食5 μL ddH2O，處理后同時給予玉米葉。在添毒后的不同時間點（6、12、24、48 和72 h），解剖幼蟲收集中腸組織，用DEPC 水清洗，去除雜質(zhì)和其他組織，置于離心管中，液氮冷凍，放入-80℃冰箱保存。

1.2.3 RNA的提取、cDNA合成、引物設計及克隆將病毒侵染后不同時間段收集的中腸及其他組織樣品根據(jù)試劑盒說明書提取RNA，并合成cDNA，具體步驟同前期方法[10]。根據(jù)實驗室前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從中篩選出具有完整開放閱讀框的RACK1 進行研究。利用PrimerPremier5.0 軟件設計基因克隆引物SfRACK1-F：5' -ATGACTGAAACATTGAA GCTT-3'；SfRACK1-R：5' -TTATCGTGCTGAGACTGACAC-3'；引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。PCR反應條件：95℃ 5 min；94℃30 s，52℃ 30 s，72℃45 s，35 個循環(huán)；72℃ 10 min。利用瓊脂糖凝膠電泳對PCR 產(chǎn)物進行檢測，目的片段通過膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物連接至pMD19-T 載體并轉(zhuǎn)化到克隆菌株Escherichia coli DH5α 感受態(tài)細胞中，挑選20 個經(jīng)藍白斑篩選后的陽性克隆，經(jīng)菌液PCR 驗證后，將菌液送上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.2.4 RT-qPCR根據(jù)SfRACK1核苷酸序列設計出熒光定量引物：SfRACK1-F：5'-CTGACC AGGGACGA AACCAA-3'；SfRACK1-R：5'-CTGAGAAAGCCACGGA GA-3'。GG 內(nèi)參引物為SfGADPH-F：5'-CGTGGGAG CAGGTTTCGT-3'；SfGADPH-R：5'-ACGGCCGCT TTAGTG TTGTC-3'。RT- qPCR 具體步驟參照TaKaRa生物公司熒光定量試劑盒說明書，在8 連管中加入總體積為25 μL 反應液，通過CFX96TM Real-Time PCR Detection System 儀器進行RT-qPCR，程序為：95℃預變性30 s；擴增條件為95℃ 5 s，60℃ 30 s，40 個循環(huán)；溶解曲線95℃ 1 min；55℃ 30 s。獲得數(shù)據(jù)通過2-△△Ct 的方法進行分析[11]，并通過SPSS軟件對各組數(shù)據(jù)的差異顯著性進行分析。

1.2.5 SfRACK1生物信息學分析通過在線網(wǎng)站SignalP5.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）和SMART（http://smart.embl-heidelberg.de）對SfRACK1 蛋白的信號肽及保守結(jié)構(gòu)域進行預測；再通過在線網(wǎng)站 ExPASy（http://web.expasy.org/com pute_pi/）對SfRACK1 蛋白相對分子質(zhì)量及等電點進行預測；通過TMHMM2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和Prot Scale（https: //web.expasy.org/protscale/）分別預測蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)和疏水性；利用在線工具SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）分別對其二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)進行預測。采用MEGE6 軟件構(gòu)建RACK1 蛋白的系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 SfRACK1的克隆及序列分析

通過PCR 擴增及其產(chǎn)物的測序成功克隆獲得SfRACK1的ORF 序列（圖1），測序結(jié)果顯示其ORF 包含有960 bp 堿基，總共編碼319 個氨基酸（圖2 A）。通過ExPASy 在線網(wǎng)站預測其蛋白分子量為35.9 KDa，等電點為8.07。通過在線網(wǎng)站SMART對SfRACK1 蛋白保守結(jié)構(gòu)域進行預測，結(jié)果顯示SfRACK1 含有7 個重復的WD40 結(jié)構(gòu)域（圖2 B）。

圖1 SfRACK1基因PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖

圖2 SfRACK1核苷酸和編碼氨基酸序列分析

2.2 SfRACK1 信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)及親疏水性分析

通過在線網(wǎng)站SignalP5.0 Server 對SfRACK1 蛋白的信號肽進行預測，結(jié)果顯示SfRACK1 無信號肽（圖3）。通過TMHMM2.0 在線預測蛋白是否存在跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖4 所示，SfRACK1 為膜外蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)。利用 ProtScale 在線軟件預測SfRACK1 蛋白的疏水性，結(jié)果表明，其氨基酸序列的預測分值最大為1.767，最小值為-2.722，平均值為-0.358，小于0，表明 SfRACK1 為親水蛋白（圖 5）。

圖3 SfRACK1 信號肽預測

圖4 SfRACK1 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預測

圖5 SfRACK1 蛋白親疏水性預測

2.3 SfRACK1 蛋白的二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)分析

通過在線工具SOPMA 對SfRACK1 蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預測，結(jié)果（圖6）表明，SfRACK1 蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由延伸鏈區(qū)（Extended strand 43.26%）、無規(guī)則卷曲（Random coil 37.30%）、β-轉(zhuǎn)角（Beta turn 12.23%）和α-螺旋（Alpha helix 7.21.%）組成。SfRACK1 三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果（圖 7）顯示，其為一個圓形結(jié)構(gòu)，主要由無規(guī)則卷曲構(gòu)成，這與前面二級結(jié)構(gòu)所預測的結(jié)果一致。

圖6 SfRACK1 蛋白的二級結(jié)構(gòu)

圖7 SfRACK1 蛋白的三級結(jié)構(gòu)

2.4 SfRACK1 與其他物種 RACK1 氨基酸序列比對及進化樹構(gòu)建

利用DNAMAN 軟件對比SfRACK1 與其他物種氨基酸序列，由圖8 可知，草地貪夜蛾與其他物種的RACK1 氨基酸序列具有較高的同源性，且與鱗翅目昆蟲棉鈴蟲、小菜蛾等的同源性最高。為了調(diào)查SfRACK1 與其他昆蟲的進化關(guān)系，該研究運用進化樹來闡明它們的親緣關(guān)系，結(jié)果（圖9）顯示，SfRACK1 與鱗翅目昆蟲的RACK1 具有較高的同源性。

圖8 SfRACK1 與部分物種 RACK1 氨基酸序列比對

圖 9 以氨基酸序列構(gòu)建的RACK1 系統(tǒng)進化樹

2.5 SfRACK1基因的組織及時空表達分析

為分析SfRACK1在草地貪夜蛾不同組織及不同發(fā)育時期的表達水平，運用RT-qPCR 技術(shù)來檢測SfRACK1的表達水平，結(jié)果如圖10 所示，SfRACK1 在脂肪體中表達量最高，在頭部、中腸中也具有相對較高的表達水平，但在血淋巴及表皮中表達量較低；在不同發(fā)育時期中，SfRACK1 在成蟲期表達量最高，在卵期表達量最低。

圖10 SfRACK1表達譜分析

2.6 SfRACK1響應NPV 感染的表達模式

為探究SfRACK1是否能響應NPV 的侵染，運用RT-qPCR 方法從轉(zhuǎn)錄水平分析草地貪夜蛾受到NPV 侵染后不同時間點SfRACK1在中腸組織的表達模式，結(jié)果（圖11）表明，與對照組相比，草地貪夜蛾受到NPV 侵染后不同時間點的SfRACK1表達量均有顯著增加，且隨著時間的延長而增加。這說明中腸中SfRACK1能夠響應NPV 的侵染。

圖11 NPV 侵染后草地貪夜蛾中腸SfRACK1的相對表達水平

3 結(jié)論與討論

RACK1 是細胞內(nèi)一種高度保守的銜接蛋白，在各種生物體中都有廣泛的表達[3]。研究表明，RACK1 參與了生命體內(nèi)細胞分化、生長和凋亡以及胚胎發(fā)育等多種生理活動[12]。筆者對草地貪夜蛾RACK1 的研究分析表明，SfRACK1基因的ORF 包含有750 bp 堿基，編碼319 個氨基酸，相對分子質(zhì)量為35.9 kDa，功能區(qū)包含有7 個WD40 結(jié)構(gòu)域。多重序列比較發(fā)現(xiàn)SfRACK1 氨基酸序列與鱗翅目昆蟲的氨基酸序列相似性均在90%以上。同時，通過構(gòu)建系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)，SfRACK1 與鱗翅目昆蟲RACK1 聚為一支。在家蠶[13]、柞蠶[14]等多種鱗翅目昆蟲中RACK1 均已被鑒定，其分子質(zhì)量均為36 kDa 左右，且具有高度的保守性。以上結(jié)果表明，SfRACK1 同其他鱗翅目昆蟲RACK1 一樣具有較高的保守性，暗示其可能具有相同的生物學功能。

RACK1 在草地貪夜蛾不同組織中的表達分析結(jié)果表明，SfRACK1 在脂肪體中具有較高的表達量，在中腸和頭部表達量次之，而在表皮及血淋巴中表達量較低，這與其他昆蟲RACK1 的表達模式基本一致。脂肪體作為昆蟲先天免疫的主要場所，既是中間代謝組織，又是昆蟲重要的免疫器官，脂肪體參與分泌合成了多種與分子免疫相關(guān)的蛋白[15]。而昆蟲的中腸組織是昆蟲抵御外來病原菌，尤其是食入性病原菌的第一道屏障[16-17]。已有研究證實，RACK1 能夠參與應答病原菌的感染，SfRACK1 在脂肪體及中腸的高表達暗示著其可能參與了草地貪夜蛾的免疫作用。RACK1 在草地貪夜蛾不同發(fā)育階段的表達分析結(jié)果表明，SfRACK1 在各個時期都有表達，但在成蟲期表達量最高，在卵期表達量最低。這與小菜蛾[18]、家蠶以及柞蠶[14]中RACK1 的表達模式基本一致。RACK1 參與多個基本生物過程，涉及細胞生長和蛋白合成等[12]。在小菜蛾中通過RNAi 技術(shù)干擾RACK1 的表達可導致其死亡率上升、化蛹推遲、化蛹率降低以及蛹重減輕等問題。

草地貪夜蛾受到NPV 侵染后不同時間段中腸RACK1 的表達分析結(jié)果表明，與對照組相比，NPV侵染后其中腸的SfRACK1基因相對表達量顯著提升。當柞蠶受到NPV 侵染后，RACK1 的表達水平也同樣高于對照組[14]；家蠶中不同抗性品系受NPV 侵染后，各品系的RACK1基因在中腸的表達水平也具有顯著差異[8]。以上結(jié)果均表明，RACK1 能應答NPV的侵染，進而參與生物體的免疫反應。此外，已有研究表明，RACK1 蛋白能與BmCPV 上的蛋白結(jié)合，并且其表達水平的變化能影響病毒的入侵速度[7]；同時，RACK1 蛋白還能與BmNPV 互作，但具體的作用及分子機制還有待深入研究[8]。