張銳銳，張 浩，石厚銀，李春紅，屈坤燕，劉 浩

1.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院（瀘州646000）；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院骨傷科（瀘州646000）；3.西南醫(yī)科大學(xué)法學(xué)院（瀘州 646000）

棉酚（Gossypol）是一種存在于錦葵科植物棉花根、莖、種子中的天然黃色多酚羥基雙萘醛類化合物[1]。它作為一種針對(duì)Bcl-2、Bcl-XL及Mcl-1蛋白家族的小分子抑制劑，可上調(diào)促凋亡蛋白NOXA 和PUMA 等來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[2-4]。研究表明，棉酚對(duì)多種腫瘤細(xì)胞都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，如骨肉瘤、骨髓瘤、膠質(zhì)瘤、肺癌、前列腺癌和腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞等[5-10]。由于棉酚是一種親脂性小分子藥物，在水中溶解性很差，因此難以制成注射制劑，口服仍然是棉酚最佳的給藥方式[11-14]。然而，口服棉酚在體內(nèi)的生物利用度較差，往往需要較高的劑量才能產(chǎn)生顯著的治療效果。此外，棉酚對(duì)人體組織細(xì)胞無(wú)特定選擇作用，對(duì)正常組織同樣具有細(xì)胞毒性，因此削弱了對(duì)腫瘤的治療作用，這對(duì)該藥物在臨床的應(yīng)用形成了阻礙[15-16]。

針對(duì)上述問(wèn)題，我們之前報(bào)道了一種基于兩親性材料硬脂酸-支鏈聚乙烯亞胺（PgS）的膠束用于棉酚的包裹[17]。聚合物膠束作為疏水藥物的理想載體，因其粒徑小、載藥量大、生物利用度高等特點(diǎn)廣受關(guān)注[18-19]。我們先前合成的PgS 膠束不僅可包裹疏水性藥物棉酚，其氨基還可與棉酚的酚羥基間形成氫鍵，極大程度上提高了藥物包裹率[17]。在此基礎(chǔ)上，我們引入了一種復(fù)合物載體材料——環(huán)RGD 多肽/透明質(zhì)酸（cRGD/HA）。透明質(zhì)酸（HA）是一種天然且可生物降解的多糖，它可以與多種腫瘤細(xì)胞上過(guò)度表達(dá)的CD44受體特異性地相互作用，因此常用于腫瘤細(xì)胞靶向[20-22]。整合素αvβ3和αvβ5已被證實(shí)是治療腫瘤的潛在靶點(diǎn)，而cRGD可特異性識(shí)別腫瘤血管中表達(dá)的整合素αvβ3，因此可用于腫瘤血管靶向[23-25]。在本研究中，我們首次將腫瘤細(xì)胞靶向的HA 與腫瘤血管靶向的cRGD進(jìn)行結(jié)合，在先前所構(gòu)建的載棉酚PgS膠束基礎(chǔ)上制備出一種具有潛在腫瘤細(xì)胞與腫瘤血管雙靶向功能的載藥納米顆粒（Gos@PgS/cRGD/HA），利用這種可注射的納米載體促進(jìn)棉酚在水中的分散，同時(shí)有望通過(guò)其腫瘤靶向功能大幅度提高棉酚的治療效果并降低其毒副作用，為促進(jìn)該天然提取藥物的臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

棉酚（純度＞98%）、硬脂酸（SA）、支鏈聚乙烯亞胺（PEI，平均分子量10 kDa和600 Da）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、N，N'-二環(huán)己基碳酰亞胺（DCC）、無(wú)水乙醇、甲醇、氯仿、二甲基亞砜（DMSO）、噻唑藍(lán)（MTT）、鏈霉素、青霉素、溴化鉀、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、纖維素透析袋、甘露醇、透明質(zhì)酸酶（上海阿拉丁試劑有限公司）；透明質(zhì)酸（HA）、NHS-PEGcRGD（瀘州科晉生物用品有限公司）；磷酸緩沖液干粉（PBS，西安沃爾森生物技術(shù)有限公司）；胎牛血清（FBS）、DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基（美國(guó)Thermo Fisher 科技有限公司）；人類前列腺癌細(xì)胞（PC-3 細(xì)胞，中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)中心）。

FA-1104 電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義予華儀器有限責(zé)任公司）；HH-1型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；TGL-20高速冷凍離心機(jī)（四川蜀科儀器有限公司）；DZF-6020 真空干燥箱（上海一恒科技儀器有限公司）；YGC 氮吹儀（鄭州寶晶電子科技有限公司）；TGL-16G 臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Ultrospec 2100 pro 紫外-可見光分光光度計(jì)（美國(guó)，通用電氣公司）；核磁共振波譜儀（型號(hào)Advance 400 MHz，Bruker 公司，德國(guó)）；Zeta sizer Nano ZS-90 激光粒度測(cè)定儀（英國(guó)Malvern 儀器公司）；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Electron 公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；H-600 透射電子顯微鏡（日本Hitachi 公司）；Varioskan Flash 多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Scientific 公司）；FD-1B-80冷凍干燥機(jī)（上海利聞科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 cRGD/透明質(zhì)酸復(fù)合物的制備

利用NHS-PEG-cRGD和支鏈PEI（分子量600 Da）之間的酯化反應(yīng)合成PEI-環(huán)狀RGD（Arg-Gly-Asp-DTyr-Lys）多肽嫁接聚合物（PEI-cRGD），反應(yīng)過(guò)程如圖1所示。在合成PEI-cRGD 時(shí)，將44 mg NHS-PEGcRGD與60 mg支鏈PEI溶解在5 mL DMF中，于室溫下保持100 rpm的攪拌速度反應(yīng)24 h，反應(yīng)容器內(nèi)充以氮?dú)獗Ｗo(hù)。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液置入截留分子量為2 000 Da的纖維素透析袋中。將透析袋密封后，浸入100 mL純水中，并保持150 rpm的攪拌速度進(jìn)行透析，每隔2 h更換新的透析外液，以除去DMF和未反應(yīng)的游離PEI。用紫外-可見光分光光度儀，以純水為參比，檢測(cè)透析外液在200～800 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸光度，當(dāng)透析外液在該波長(zhǎng)范圍內(nèi)幾乎無(wú)光吸收時(shí)停止透析。將透析袋內(nèi)溶液用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干處理，得到PEI-cRGD干粉。

圖1 PEI-cRGD的合成示意圖Figure 1 Schematic diagram of the synthesis of PEI-cRGD

通過(guò)HA與PEI-cRGD 的靜電相互作用形成cRGD修飾的HA（cRGD/HA）。于室溫下，將40 mg HA 加入220 mL純水中，以120 rpm的速度攪拌30 min，使HA完全溶解分散。再將20 mg PEI-cRGD 加入100 mL 純水中，以上述同樣的方式使之完全溶解。之后，保持HA溶液以120 rpm 的速度繼續(xù)攪拌，同時(shí)將PEI-cRGD 溶液滴加到HA 溶液中。待完全加入后，再繼續(xù)攪拌1 h以上，使HA 與PEI-cRGD 的靜電吸附充分進(jìn)行，形成cRGD/HA復(fù)合物。最后，將cRGD/HA復(fù)合物溶液冷凍干燥得到cRGD/HA復(fù)合物干粉。

1.3 載棉酚雙層納米顆粒的制備和優(yōu)化

根據(jù)我們之前報(bào)道的方法，通過(guò)SA與支鏈PEI（分子量10 kDa）進(jìn)行?；磻?yīng)制備了一種兩親性材料PgS，其平均每個(gè)PEI 分子鏈上嫁接（6.67±0.12）個(gè)SA分子[17]。于常溫下將8 mg PgS 和15 mg 棉酚完全溶于5 mL無(wú)水乙醇中。再將藥物的醇溶液逐滴加到80 mL純水中，并保持240 rpm 的轉(zhuǎn)速攪拌1.5 h 以上形成載藥PgS 膠束。于室溫（20～25℃）將20 mg 的cRGD/HA復(fù)合物溶于20 mL 純水中，300 rpm 持續(xù)攪拌0.5 h 以上。待cRGD/HA 完全溶解后，將載藥PgS 膠束溶液逐滴加入cRGD/HA 水溶液中，繼續(xù)保持300 rpm 轉(zhuǎn)速攪拌1.5 h 以上，形成載藥雙層納米顆粒，以Gos@PgS/cRGD/HA表示（圖2）。

圖2 載藥雙層納米顆粒Gos@PgS/cRGD/HA形成過(guò)程示意圖Figure 2 Schematic diagram of the formation process of gossypolloaded double-layered nanoparticles（Gos@PgS/cRGD/HA）

通過(guò)透析除去有機(jī)溶劑和未包裹的游離藥物。將載藥納米顆粒溶液置入截留分子量為3 500 Da的纖維素透析袋中。再將密封好的透析袋完全浸入50 mL 磷酸緩沖液（PBS，pH 7.4）中，并保持150 rpm的攪拌速度進(jìn)行透析，以除去無(wú)水乙醇和游離的棉酚，每隔1 h 更換新的透析外液。當(dāng)透析外液澄清透明時(shí)，換為純水繼續(xù)透析8 h。透析結(jié)束后，向納米顆粒溶液中加入一定量的甘露醇（終濃度為7.5%，w/v）后進(jìn)行冷凍干燥[26]，得到納米顆粒產(chǎn)品的干粉。在10～20 mL 范圍內(nèi)考察載藥PgS膠束溶液的加入量對(duì)于納米顆粒的粒徑和表面電位的影響。

1.4 載棉酚雙層納米顆粒的粒徑和Zeta電位的檢測(cè)

在室溫條件下，取載藥雙層納米顆粒以適量去離子水稀釋至適當(dāng)濃度，用馬爾文激光粒度儀測(cè)定其粒徑大小和Zeta電位。

1.5 載棉酚雙層納米顆粒的形態(tài)學(xué)觀察

在室溫條件下，將優(yōu)化后的載藥雙層納米顆粒水溶液滴于碳膜覆蓋的銅網(wǎng)表面，自然干燥后置于透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.6 載棉酚雙層納米顆粒的包封率與載藥量的測(cè)定

1.6.1 棉酚溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取適量的棉酚，用氯仿溶解后，使用紫外-可見光分光光度儀在200～600 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，確定棉酚最大吸收波長(zhǎng)。精密稱取處方量的棉酚溶解于氯仿中，分別配制成梯度濃度（8、10、14、18、20 及24 μg/mL）的棉酚標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用紫外-可見光分光光度儀于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以橫坐標(biāo)（x）為藥物的濃度，縱坐標(biāo)（y）為吸光度值，繪制棉酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過(guò)最小二乘法擬合出線性回歸方程。

1.6.2 載棉酚雙層納米顆粒的包封率與載藥量的測(cè)定在前面制備載藥雙層納米顆粒的透析純化過(guò)程中，取每次更換的透析外液4 mL，以等體積的氯仿萃取出游離的棉酚，先后共萃取3次，合并3次的萃取液。取10 mL合并的氯仿萃取液以氮?dú)饬鞔蹈?，殘留物重新? mL氯仿溶解，隨后使用紫外-可見光分光光度儀在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到透析外液中的藥物濃度。當(dāng)透析外液中棉酚質(zhì)量少于檢測(cè)限度時(shí)停止透析。合并各次更換的透析外液中棉酚的總質(zhì)量，結(jié)合制備載藥納米顆粒時(shí)的藥物與包裹材料的投入量，計(jì)算出棉酚的包封率與載藥質(zhì)量百分比。

1.7 載藥雙層納米粒的藥物釋放研究

本研究利用透析法考察載藥雙層納米顆粒的體外藥物釋放。取制備好的載藥雙層納米粒凍干粉適量溶于20 mL PBS 中，使藥物的最終含量達(dá)到10 mg。將載藥納米顆粒溶液置入截留分子量為3 500 Da的纖維素透析袋中密封好，再將透析袋完全浸入500 mL PBS中，并保持80 rpm 的攪拌速度和37 ℃溫度進(jìn)行透析。設(shè)置加透明質(zhì)酸酶的對(duì)照組，在納米顆粒溶液中加入適量的透明質(zhì)酸酶，使其濃度達(dá)到15 U/mL，其余處理同前。每隔一定時(shí)間，取透析外液5 mL（同時(shí)補(bǔ)充同等體積的PBS），以等體積的氯仿萃取出游離的棉酚，先后共萃取3 次。合并3 次的萃取液，取12.5 mL 以氮?dú)饬鞔蹈?，殘留物重新以適量氯仿溶解。采用前文所述方法測(cè)定氯仿中的棉酚濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)透析外液中的棉酚質(zhì)量，進(jìn)而得到各時(shí)間點(diǎn)藥物釋放的百分比。以時(shí)間為橫坐標(biāo)（x），藥物釋放百分比為縱坐標(biāo)（y）繪制載藥雙層納米粒的體外釋放曲線。

1.8 載藥雙層納米粒的體外腫瘤細(xì)胞抑制作用研究

本研究采用人類前列腺癌細(xì)胞（PC-3 細(xì)胞）考察載藥雙層納米粒的體外腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用[19]。首先使用完全培養(yǎng)基懸浮PC-3 細(xì)胞。將均勻懸浮的細(xì)胞以約1×104個(gè)/孔的量加到96孔板的適當(dāng)區(qū)域內(nèi)，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基溶解載藥雙層納米粒或相應(yīng)的游離藥物，得到不同濃度（均以藥物質(zhì)量計(jì)，即3、9、27、81、243 μmol/L）的樣品溶液。在96孔板的每孔中加入不同量的待測(cè)樣品培養(yǎng)72 h，每個(gè)待測(cè)樣品重復(fù)3 孔。將培養(yǎng)基換新，每個(gè)試驗(yàn)孔內(nèi)加入20 μL 的MTT 水溶液（5 mg/mL），在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。隨后棄去含MTT 的培養(yǎng)基，并在每孔中加入100 μL DMSO。待甲瓚結(jié)晶完全溶解后，用酶標(biāo)儀測(cè)定每個(gè)孔在490 nm 處的吸光值，得出每種樣品的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2 結(jié)果

2.1 粒徑和Zeta電位檢測(cè)

在本研究實(shí)驗(yàn)條件下，隨著載藥PgS 膠束溶液加入量的增加，載藥雙層納米粒的粒徑先逐漸減小后逐漸增大，且Zeta 電位逐漸升高直至0 mV 附近（圖3）。當(dāng)載藥PgS膠束溶液加入量為16 mL時(shí)，納米顆粒的平均粒徑達(dá)到最小，為124～125 nm。這是因?yàn)楫?dāng)載藥PgS膠束量較少時(shí)，cRGD/HA相對(duì)于載藥PgS膠束是過(guò)量的，PgS膠束能夠被過(guò)量的cRGD/HA復(fù)合物包裹，此時(shí)所形成的納米顆粒表面包裹了大量帶負(fù)電的cRGD/HA復(fù)合物，使納米顆粒平均粒徑較小的同時(shí)其表面負(fù)電性較強(qiáng)。隨著載藥PgS 膠束量的增加，平均每個(gè)載藥PgS 膠束上可吸附的cRGD/HA 復(fù)合物在減少，此時(shí)所形成的納米顆粒表面包裹的cRGD/HA 復(fù)合物的量也在降低，最終使得納米顆粒表面剛好被cRGD/HA 復(fù)合物覆蓋，因此納米顆粒的平均粒徑達(dá)到最小，同時(shí)整個(gè)體系的Zeta電位繼續(xù)上升。在此基礎(chǔ)上，載藥PgS膠束量的繼續(xù)增加，會(huì)導(dǎo)致載藥PgS膠束過(guò)量，使原已形成的表面帶負(fù)電的納米顆粒繼續(xù)與帶正電的載藥PgS膠束發(fā)生靜電吸附，從而多個(gè)粒子聚集在一起產(chǎn)生更大的復(fù)合顆粒，因此使得體系的平均粒徑反而增大，同時(shí)Zeta電位繼續(xù)上升。

圖3 PgS膠束溶液加入量對(duì)載藥雙層納米顆粒Gos@PgS/cRGD/HA粒徑（A）和Zeta電位（B）的影響（，n=3）Figure 3 Effect of PgS micelles solution addition on the particle size（A）and Zeta-potential（B）of gossypol-loaded double-layered nanoparticles（Gos@PgS/cRGD/HA）（，n=3）

當(dāng)載藥PgS膠束溶液加入量為16 mL時(shí)，納米顆粒的平均粒徑達(dá)到最小，此時(shí)納米顆粒表面cRGD/HA 復(fù)合物的量也較為適宜，且顆粒表面也處于負(fù)電性較高的情況，有利于保持納米顆粒的穩(wěn)定性，因此確定載藥PgS 膠束溶液加入量16 mL 為最佳條件。采用馬爾文激光粒度儀測(cè)定優(yōu)化后的載藥雙層納米顆粒的粒徑為（125.0±4.1）nm，Zeta電位為（-13.2±0.6）mV。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察

透射電鏡下載藥PgS 膠束溶液加入量為16 mL 所制得的載藥雙層納米顆粒的形態(tài)近似球形，粒徑分布較均勻，基本上在120～160 nm 范圍內(nèi)（如圖4），這與前面用粒度儀所測(cè)得的結(jié)果一致。

圖4 載藥雙層納米顆粒Gos@PgS/cRGD/HA不同放大倍數(shù)的透射電鏡照片F(xiàn)igure 4 Transmission electron microscopy images of gossypol-loaded double-layered nanoparticles（Gos@PgS/cRGD/HA）with different magnifications

2.3 載藥雙層納米顆粒的包封率與載藥量的測(cè)定

2.3.1 棉酚溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 棉酚在氯仿中的吸收曲線于200～300 nm 的紫外波長(zhǎng)范圍內(nèi)顯示雜峰，于365 nm處有一個(gè)單峰，最終選擇在365 nm的吸收波峰處測(cè)量各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度（圖5A）。在本研究所選擇紫外-可見光分光光度法分析條件下，得到吸光度值（A）對(duì)藥物濃度（c）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。棉酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.0360c-0.0224（R2=0.9998），在8～24 μg/mL 范圍內(nèi)有著較好的線性關(guān)系（圖5B）。

圖5 棉酚在氯仿中（20 μg/mL）的吸收光譜圖（A）和棉酚溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（B）Figure 5 Absorption spectra of gossypol in chloroform（20 μg/mL）（A）and standard curve of gossypol solution（B）

2.3.2 載藥雙層納米顆粒的包封率與載藥量的測(cè)定 載藥雙層納米粒的包封率與載藥質(zhì)量百分比分別為（69.21 ± 0.76）%和（8.33 ± 0.08）%。本課題組前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明單獨(dú)使用PgS膠束時(shí)棉酚的包封率僅約為64%。相比之下，載藥雙層納米顆粒的包封率明顯更高。

2.4 載藥雙層納米粒的藥物釋放

采用透析法測(cè)定載藥雙層納米粒溶液的體外釋放。如圖6 所示，載藥雙層納米粒在沒(méi)有透明質(zhì)酸酶時(shí)的藥物釋放速度較慢，在96 h 后平均藥物釋放百分比不到60%，表明納米顆粒對(duì)棉酚的包裹較為牢固。相比之下，納米顆粒在有透明質(zhì)酸酶時(shí)的藥物釋放速度較快，在96 h后的平均藥物釋放百分比超過(guò)了85%。這是由于加入透明質(zhì)酸酶后，納米顆粒外部的HA層被逐漸降解，因此來(lái)自HA 外層的阻礙減小或消除，使得棉酚更容易從顆粒內(nèi)核中釋放出來(lái)。值得一提的是，許多腫瘤組織的透明質(zhì)酸酶都有過(guò)量表達(dá)的情況[19]，因此透明質(zhì)酸酶促進(jìn)的藥物釋放效果可能為棉酚在體內(nèi)的作用賦予一定的腫瘤選擇性，從而增強(qiáng)藥物的抗腫瘤作用，并減小其對(duì)正常組織的傷害。

圖6 載藥雙層納米顆粒Gos@PgS/cRGD/HA在添加或未添加透明質(zhì)酸酶（HAase）時(shí)的體外累積釋放曲線（，n=3）Figure 6 In vitro cumulative release profiles of gossypol-loaded double-layered nanoparticles（Gos@PgS/cRGD/HA）with or without the addition of hyaluronidase（HAase）（，n=3）

2.5 載藥雙層納米粒的體外腫瘤細(xì)胞抑制作用

體外細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果顯示，游離棉酚、Gos@PgS/cRGD/HA 納米顆粒的IC50的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別約為18.27 μmol/L 和20.65 μmol/L（圖7）。表明藥物遞送載體對(duì)細(xì)胞毒性較低，載藥納米顆粒對(duì)PC-3細(xì)胞的抑制程度接近并略小于游離藥物。

圖7 經(jīng)不同濃度游離棉酚以及載棉酚雙層納米顆粒Gos@PgS/cRGD/HA處理后的PC-3細(xì)胞存活率（A）與半數(shù)抑制濃度IC50值（B）（，n=3）Figure 7 The survival rate（A）and half inhibitory concentration IC50 value（B）of PC-3 cells treated with different concentrations of free gossypol-loaded double-layered nanoparticles（Gos@PgS/cRGD/HA）（，n=3）

3 討論

納米載體材料為傳統(tǒng)藥物輸送領(lǐng)域提供了新的策略，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，具有良好的應(yīng)用前景[27-28]。為解決棉酚的溶解性和組織分布選擇差、生物利用度低等問(wèn)題，本試驗(yàn)制備了兩親性高分子材料PgS和cRGD/HA復(fù)合物作為納米載體，PgS是一種新型的納米載體材料，具有低細(xì)胞毒性和較好的生物相容性，適于藥物的運(yùn)載。載棉酚PgS 膠束作為本研究制備雙層載藥納米顆粒的內(nèi)核部分，可以較好的包裹棉酚。用腫瘤血管靶向性cRGD 多肽來(lái)修飾具有腫瘤細(xì)胞靶向性的HA，形成了一種具有潛在雙靶向功能的復(fù)合材料cRGD/HA[29-30]，而目前將cRGD 的腫瘤血管靶向與HA 的腫瘤細(xì)胞靶向相結(jié)合的應(yīng)用還較少。在純水中有較強(qiáng)負(fù)電性的cRGD/HA 通過(guò)靜電吸附作用包裹帶正電的載藥PgS 膠束，形成同時(shí)具有潛在靶向?qū)嶓w腫瘤細(xì)胞和腫瘤血管的雙層載藥納米顆粒，其可以大幅度提高棉酚在體內(nèi)腫瘤組織的選擇性分布，有望通過(guò)水溶性納米載體促進(jìn)棉酚在水中的分散，并顯著提高棉酚的治療效果和降低毒副作用。

納米載體的理化性質(zhì)會(huì)對(duì)其穩(wěn)定性、細(xì)胞毒性等產(chǎn)生影響，因此進(jìn)行制劑學(xué)評(píng)價(jià)是必不可少的過(guò)程。優(yōu)化后Gos@PgS/cRGD/HA 的形態(tài)近似球形，平均粒徑為（125.0±4.1）nm，Zeta電位為（-13.2±0.6）mV，在短期試驗(yàn)期間無(wú)需避光保存且有較好的穩(wěn)定性，緩釋作用時(shí)間較長(zhǎng)，并對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用與游離棉酚接近，有望促進(jìn)棉酚的治療效果和降低毒副作用。與已報(bào)道的幾種棉酚制劑如脂質(zhì)體、膠束和微乳相比[31-33]，Gos@PgS/cRGD/HA提高了棉酚的溶解度、包封率和載藥量。通過(guò)以上各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，不僅掌握了這種新型雙靶向棉酚納米顆粒的基本理化性質(zhì)，也對(duì)其體外抗腫瘤細(xì)胞效果有了初步的考察，為以后進(jìn)一步深入研究這種載藥雙層納米顆粒體內(nèi)外作用機(jī)理打下重要基礎(chǔ)。在本研究的基礎(chǔ)上，我們將對(duì)載藥納米顆粒部分理化性質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)定，對(duì)已檢測(cè)的理化性質(zhì)再采用其他可行的方法進(jìn)行佐證，并進(jìn)一步明確載體材料與藥物分子之間的相互作用。目前體外細(xì)胞試驗(yàn)已證實(shí)載藥雙層納米顆粒具有顯著的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用，未來(lái)將進(jìn)行體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)，并構(gòu)建動(dòng)物腫瘤模型，進(jìn)一步探討載藥雙層納米顆粒的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)、潛在的腫瘤雙靶向功能和抗腫瘤效果等性質(zhì)。

4 結(jié)論與啟示

本研究成功制備了一種可注射的載棉酚雙層納米顆粒Gos@PgS/cRGD/HA，優(yōu)化后的納米制劑具有較好的制劑學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果，能夠有效提高棉酚在水中的溶解度。納米顆粒對(duì)棉酚的包封率接近70%，載藥量超過(guò)8.3%，緩釋藥物時(shí)間長(zhǎng)達(dá)96 h 以上，對(duì)體外PC-3 腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效果與游離藥物的作用相近，有望提高棉酚的體內(nèi)治療效果和降低毒副作用。本研究結(jié)果為載藥雙層納米顆粒的進(jìn)一步研究以及促進(jìn)該天然提取藥物的臨床應(yīng)用奠定了重要的理論基礎(chǔ)。

（利益沖突：無(wú)）