劉云岫，尚勤旺，韓紫碩，徐曉厚，王德亞*

(1.棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/棗莊市櫻桃病毒病快速診斷與綠色防控技術(shù)創(chuàng)新中心，山東棗莊 277160；2.山東省龍口市現(xiàn)代果樹技術(shù)研究所，山東龍口 265718)

病毒病是櫻桃的一種重要病害，其危害嚴(yán)重性和持久性在生產(chǎn)中逐年顯現(xiàn)，已成為影響櫻桃產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[1-3]。櫻桃小果病毒1(Little cherry virus 1, LChV-1)在中國(guó)大部分櫻桃產(chǎn)區(qū)均有分布，侵染可引起果實(shí)變小、晚熟等，嚴(yán)重影響了產(chǎn)量與質(zhì)量[4, 5]。LChV-1為長(zhǎng)線形病毒科(Closteroviridae)隱癥病毒屬(Velarivirus)，2004年波蘭首次報(bào)道發(fā)現(xiàn) LChV-1，該病毒主要通過昆蟲介體等途徑傳播[6-8]。LChV-1基因組是一條(+)ssRNA，大小約17 000 nt。LChV-1的檢測(cè)方法主要有RT-PCR、Q-PCR和免疫電鏡法。其中PCR檢測(cè)技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但存在儀器昂貴，操作技術(shù)難度大等問題，難以在生產(chǎn)實(shí)際中推廣應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)是采用4條特異引物和DNA鏈置換聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒溫條件下建立的一種分子檢測(cè)技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于病毒病害的分子檢測(cè)。筆者針對(duì)LChV-1建立特異、快速的檢測(cè)方法，為櫻桃小果病的田間快速檢測(cè)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、載體和菌種

健康的以及感染了LChV-1的甜櫻桃葉片樣品均保存于棗莊學(xué)院病毒基因工程泰山學(xué)者工作站(圖1)。大腸桿菌DH5α菌株購(gòu)自索萊寶公司，pMD18-T載體購(gòu)自TaKaRa公司。pEHISTEV表達(dá)載體，BL21(DE3)Rosetta感受態(tài)細(xì)胞等由本實(shí)驗(yàn)室保存。引物合成和核酸序列測(cè)定由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行。

1.2 RT-LAMP引物合成和篩選

取100 mg待測(cè)的甜櫻桃葉片，按照植物RNA提取試劑盒(北京天根)的說明書提取樣品的總RNA，保存于-80 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)登錄的LChV-1 CP基因序列(KR736335)，利用APE軟件設(shè)計(jì)檢測(cè)引物；利用LAMP引物設(shè)計(jì)軟件primer explorer 4.0(http：//primerexplorer.jp/e/index.html)設(shè)計(jì)3組特異性引物序列(表1)。

圖1 采集的疑似病毒病櫻桃葉片

1.3 RT-PCR檢測(cè)

RT-PCR在本研究中用于LChV-1的檢測(cè)，反應(yīng)體系為：以 1.0 μg植物總RNA，4.0 μL反向引物和2.0 μL dNTP，85 ℃變性處理5 min，冰上放置3 min，然后加入5.0 μL 5×MLV buffer，0.5 μL RRI，1.0 μL反轉(zhuǎn)錄酶(Takara)，dd H2O補(bǔ)齊25.0 μL體系，42 ℃反應(yīng)90 min，后置冰上5 min，進(jìn)行下步PCR反應(yīng)。

1.4 RT-LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化

反應(yīng)溫度設(shè)置為56、57、59、61和63 ℃，引物濃度比為 4∶1、6∶1和8∶1。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果篩選出RT-LAMP的反應(yīng)溫度等最佳組合。

1.5 產(chǎn)物鑒定

將反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離后，切取大小200 bp左右的條帶，用膠回收試劑盒回收目標(biāo)片段連接于pMD18-T載體。選取陽性克隆送至上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-LAMP 引物設(shè)計(jì)及篩選

分別設(shè)計(jì)針對(duì)LChV-1的1組檢測(cè)引物以及3組RT-LAMP引物(表1)。提取疑似感染LChV-1的甜櫻桃葉片總RNA(圖2-A)，利用的特異性引物(LC-12 430-F和LC-12 960-R)進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，用來擴(kuò)增LChV-1基因組12 430～12 960間約530 bp片段(圖2-B)。經(jīng)測(cè)序鑒定，樣品中存在LChV-1。

表1 櫻桃小果病毒1的RT-PCR和RT-LAMP檢測(cè)用引物序列

圖2 病葉總RNA提取(A)和PCR擴(kuò)增LChV-1片段電泳圖(B)

通過分析3組RT-LAMP引物的Tm值、位置及長(zhǎng)度等信息，以F3-3/B3-3 和FIP3-3/BIP3-3 為候選引物。加入RT-LAMP體系，空白水作為陰性對(duì)照，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)表明：以F3-3/B3-3 和FIP3-3/BIP3-3為引物可以擴(kuò)增出現(xiàn)梯狀目的條帶(圖3)。切取200 bp左右的條帶進(jìn)行克隆，測(cè)序結(jié)果顯示所克隆的片段大小為212 bp。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)結(jié)果表明，其與LChV-1分離物(KR736335)的核苷酸同源性為97.6%，說明獲得的序列為L(zhǎng)ChV-1的基因組序列。

圖3 LAMP檢測(cè)LChV-1的引物篩選

2.2 RT-LAMP反應(yīng)條件及體系的優(yōu)化

分別對(duì)RT-LAMP的反應(yīng)體系反應(yīng)中的溫度、引物濃度比等進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，RT-LAMP在56～63 ℃均有擴(kuò)增，57 ℃條件下擴(kuò)增60 min，條帶呈明顯的階梯狀且在100～200 bp左右(圖4-A)。設(shè)置內(nèi)外引物濃度之比為4∶1、6∶1、8∶1，結(jié)果表明：當(dāng)引物濃度之比為4∶1時(shí)，基本沒有條帶擴(kuò)增，當(dāng)引物濃度之比為6∶1和8∶1時(shí)，條帶清晰，但隨著內(nèi)外引物濃度的提高，產(chǎn)出量沒有明顯的增加，因此選擇6∶1為最適引物濃度比(圖4-B)。Mg2+梯度實(shí)驗(yàn)表明：Mg2+濃度在2.0～8.0 mM時(shí)，均可以擴(kuò)增出條帶。當(dāng)Mg2+濃度達(dá)在6.0 mM時(shí)，擴(kuò)增條帶最亮且最清晰(圖4-C)。

圖4 LChV-1 RT-LAMP反應(yīng)最佳溫度、Mg2+濃度和內(nèi)外引物比的篩選

2.3 RT-LAMP檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用

運(yùn)用 RT-LAMP法對(duì)從棗莊、泰安、煙臺(tái)和臨沂采集的35份疑似櫻桃小果病的樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示有13份檢測(cè)到LChV-1，且RT-LAMP和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致(表 2)

表2 甜櫻桃病害樣品檢測(cè)

3 小結(jié)與討論

目前，國(guó)內(nèi)已報(bào)道侵染甜櫻桃的病毒病有14種，其中櫻桃病毒A(CVA)發(fā)病率最高，接近70%[5, 9]，而櫻桃小果病毒1(LChV-1)和櫻桃小果病毒2(LChV-2)，發(fā)病率較低，侵染可引起果實(shí)變小、晚熟等，且一旦侵染終身帶毒，嚴(yán)重影響了產(chǎn)量，給甜櫻桃種植者帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失。

通過對(duì)LChV-1的CP序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)了3組特異性引物，經(jīng)優(yōu)化，篩選獲得1組特異性引物。經(jīng)過篩選和反應(yīng)體系的優(yōu)化，建立了用于檢測(cè)LChV-1的RT-LAMP的檢測(cè)體系，具體為：6.0 mM Mg2+,0.2 μM的外引物和1.2 μM的內(nèi)引物，在57 ℃條件下反應(yīng)60 min。該方法僅需1臺(tái)水浴鍋在60 min內(nèi)就可完成反應(yīng)，而RT-PCR不僅需要昂貴的PCR儀器，而且反應(yīng)時(shí)間為2 h左右。具有簡(jiǎn)單、方便、快捷的特點(diǎn)，適合基層檢測(cè)人員的使用。