劉寧

（常州市婦幼保健院消化科，江蘇 常州 213000）

目前，肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）已經(jīng)成為全球第6 大最常見的腫瘤，其高發(fā)病率和高死亡率嚴(yán)重危害了人們的健康[1]。HCC 的治療方式主要包括手術(shù)切除、動(dòng)脈化療栓塞、射頻消融、化療、免疫治療等。然而，藥物耐藥、腫瘤復(fù)發(fā)等導(dǎo)致治療失敗仍然很常見[2-4]。因此，探索新的治療靶點(diǎn)對(duì)肝細(xì)胞肝癌的治療有重要意義。TLCD1 位于細(xì)胞膜上，參與細(xì)胞膜組裝、磷脂穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)膜脂分布等多種生物進(jìn)程[5]。細(xì)胞膜成分和流動(dòng)性的改變與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有關(guān)[6]。研究發(fā)現(xiàn)[7]，TLCD1在葡萄膜黑色素瘤中表達(dá)顯著異常，并且其異常表達(dá)與患者無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存預(yù)后存在相關(guān)性?？梢姡琓LCD1 可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中有重要作用。關(guān)于TLCD1 在HCC 中的作用仍未有相關(guān)研究報(bào)道。本研究通過生物信息學(xué)分析，研究TLCD1 在HCC 中的mRNA 表達(dá)情況，以及在患者預(yù)后預(yù)測(cè)中的價(jià)值，并探討其潛在的作用機(jī)制，為HCC 的治療帶來新的思路。

1 數(shù)據(jù)來源與方法

1.1 TIMER2.0 數(shù)據(jù)庫 TIMER2.0 數(shù)據(jù)庫（http://timer.comp-genomics.org）用于分析來自TCGA 數(shù)據(jù)庫中不同腫瘤組織的基因表達(dá)情況和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平。通過TIMER2.0 數(shù)據(jù)庫“Gene_DE”模塊，研究TLCD1 在30 余種腫瘤組織和正常組織中mRNA的表達(dá)差異。

1.2 GEPIA 數(shù)據(jù)庫 GEPIA 數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/）是一個(gè)具備基因表達(dá)差異分析、相關(guān)性分析、預(yù)后分析等多種功能的綜合性基因分析平臺(tái)。本研究通過GEPIA 分析TLCD1mRNA 在HCC 與正常組織中的表達(dá)差異，結(jié)果以箱式圖展示。利用“Survival:Survival Plots”模塊分析TLCD1mRNA 的表達(dá)差異對(duì)HCC 患者預(yù)后的影響，主要包括患者的總生存期（OS）和無病生存期（DFS）。

1.3 UALCAN 數(shù)據(jù)庫 UALCAN 數(shù)據(jù)庫（http：//UALCAN.path.uab.edu/）用于深入分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中31 中腫瘤的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。本研究通過該數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步驗(yàn)證TLCD1mRNA 在HCC 組織和正常組織的表達(dá)差異，并且分析在HCC 患者不同種族、分期、分級(jí)等亞組間TLCD1mRNA 的表達(dá)差異。

1.4 Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫 Kaplan-Meier Plot ter 數(shù)據(jù)庫（http：//www.kmplot.com）用于分析來自21種腫瘤類型的25 000 多個(gè)樣本中，超過30 000 個(gè)基因的表達(dá)和生存之間的相關(guān)性。采用該數(shù)據(jù)庫研究TLCD1mRNA 表達(dá)情況與HCC 患者預(yù)后的關(guān)系，TLCD1 高表達(dá)與低表達(dá)按最佳臨界值劃分，繪制OS、無復(fù)發(fā)生存期（RFS）、無進(jìn)展生存期（PFS）、疾病特異性生存期（DSS）生存曲線。

1.5 LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫 LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫（http://linkedomics.org/）可用于分析多種癌癥的多組學(xué)分析[8]。通過該數(shù)據(jù)庫的“LinkFinder”模塊，篩選獲得與TLCD1 共表達(dá)基因，以火山圖形式呈現(xiàn)，相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)。功能富集分析通過“LinkInterpreter”模塊，通過GSEA 進(jìn)行KEGG 通路分析，參數(shù)設(shè)置為1000 次模擬，P＜0.05。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)分析HCC 組織和正常組織中TLCD1mRNA 表達(dá)差異；單因素方差分析比較不同HCC 亞組間TLCD1 的表達(dá)情況。通過Kaplan-Meier 曲線和Log-rank 檢驗(yàn)進(jìn)行TLCD1 的生存分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TLCD1mRNA 在不同腫瘤組織中的表達(dá)情況TIMER2.0 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，TLCD1mRNA 在HCC、結(jié)腸癌、直腸腺癌、膽管癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、膀胱移行細(xì)胞癌、前列腺癌、腎乳頭狀細(xì)胞癌、乳腺浸潤(rùn)癌、宮頸鱗狀細(xì)胞癌和宮頸內(nèi)腺癌、子宮內(nèi)膜癌、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、甲狀腺癌中，較相應(yīng)正常組織，表達(dá)顯著上調(diào)，而在在腎嫌色細(xì)胞癌、腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)下降（P＜0.05），見圖1。

圖1 TIMER2.0 數(shù)據(jù)庫中TLCD1mRNA 在不同腫瘤組織中的表達(dá)水平

2.2 TLCD1mRNA 在HCC 中表達(dá)情況 本研究通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫，對(duì)369 例HCC 組織和160 例正常肝組織的TLCD1mRNA 表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果提示，TLCD1mRNA 在HCC 中表達(dá)顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見圖2A。在UALCAN 數(shù)據(jù)庫中，對(duì)兩組間的表達(dá)差異進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果顯示TLCD1mRNA 在HCC 組織中顯著高表達(dá)（P＜0.001），見圖2B。

圖2 TLCD1mRNA 在HCC 組織和正常組織中的表達(dá)水平

2.3 TLCD1mRNA 與HCC 臨床病理參數(shù)的關(guān)系 采用UALCAN 數(shù)據(jù)庫，探討了TLCD1mRNA 與HCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系。TLCD1 的表達(dá)與性別、年齡無相關(guān)性（P＞0.05），見圖3A 及3B。而TLCD1mRNA在亞洲HCC 患者組織中，表達(dá)情況高于白種人及非裔美籍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3C。隨著肝癌分期、病理分級(jí)的增加，TLCD1mRNA 表達(dá)也呈上升趨勢(shì)，即Ⅱ期或Ⅲ期HCC 患者中，TLCD1mRNA的表達(dá)水平較Ⅰ期患者升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），圖3D；在低分化或未分化的肝細(xì)胞肝組織中，TLCD1mRNA 的表達(dá)水平也均高于高分化或中分化者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3E。此外，TLCD1mRNA 的表達(dá)與TP53 突變情況有關(guān)，在TP53 突變的HCC 中，TLCD1mRNA 的表達(dá)水平也顯著升高，見圖3F。

圖3 GEPIA 數(shù)據(jù)庫中TLCD1mRNA 在不同HCC 亞組間的表達(dá)情況

2.4 TLCD1 表達(dá)與HCC 患者預(yù)后的相關(guān)性 為了進(jìn)一步探討TLCD1mRNA 表達(dá)水平對(duì)HCC 患者預(yù)后的影響，本研究分析了Kaplan-Meier Plotter 線上數(shù)據(jù)庫中364 位HCC 患者的預(yù)后數(shù)據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在HCC 患者中，高表達(dá)TLCD1 組較低表達(dá)組預(yù)后差（OS：HR=1.49,95%CI：1.05～2.11，P=0.024；PFS：HR=1.48,95%CI：1.1～1.98，P=0.0094；RFS：HR=1.49,95%CI：1.07～2.08，P=0.018；DSS：HR=1.67,95%CI：1.06～2.62，P=0.025），見圖4A～4D。同時(shí)，通過GEPIA 數(shù)據(jù)驗(yàn)證TLCD1 在HCC 患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值，結(jié)果也提示，TLCD1 高表達(dá)的患者OS 和DFS 明顯低于低表達(dá)的患者（OS：HR=1.7，P=0.0035；DFS：HR=1.7，P=0.000 57），見圖4E 和4F。

圖4 TLCD1 表達(dá)水平與HCC 患者預(yù)后的關(guān)系

2.5 TLCD1 在HCC 中的共表達(dá)及相關(guān)通路的富集分析 利用LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫對(duì)在HCC 中TLCD1的共表達(dá)基因進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，共有5402 個(gè)基因與TLCD1 表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05），6519 個(gè)基因與TLCD1 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見圖5A。與TLCD1表達(dá)正相關(guān)性最強(qiáng)的基因?yàn)镾AC3D1，相關(guān)系數(shù)為0.657；與TLCD1 負(fù)相關(guān)最強(qiáng)的基因?yàn)镠ERC3，相關(guān)系數(shù)為-0.624。KEEG 通路富集分析表明，TLCD1 可能與核糖體、氧化磷酸化、剪切體、蛋白酶體、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、嘌呤代謝等信號(hào)通路相關(guān)，見圖5B。

圖5 在HCC 中TLCD1 的共表達(dá)基因（LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫）

3 討論

近年來，生物信息學(xué)為醫(yī)學(xué)的發(fā)展開辟了新的途徑，特別是在探索腫瘤治療新靶點(diǎn)中發(fā)揮重要作用[9]。目前，分子靶向藥物仍然是中晚期HCC 患者的主流治療措施，索拉菲尼、瑞格菲尼等分子靶向藥物現(xiàn)已廣泛運(yùn)用于臨床，但藥物耐藥導(dǎo)致治療失敗仍然很常見[10，11]。因此，尋求新的治療靶點(diǎn)，對(duì)改善HCC 患者預(yù)后有重要意義。

目前，關(guān)于TLCD1 在腫瘤中的作用的研究仍較少。近年來發(fā)現(xiàn)，TLCD1 可以通過抑制多不飽和脂肪酸進(jìn)入膜磷脂，進(jìn)而調(diào)節(jié)質(zhì)膜的流動(dòng)性[5]。膜流動(dòng)性的增加，可以導(dǎo)致腫瘤侵襲性增加和腫瘤進(jìn)展[12]。而調(diào)整細(xì)胞膜的組成和流動(dòng)性，是治療HCC 的有效手段[12-14]。因此，可以推測(cè)TLCD1 可能在HCC 發(fā)生發(fā)展中有重要作用，可能是HCC 治療的潛在作用靶點(diǎn)。

通過檢索GEPIA 和UALCAN 數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)TLCD1mRNA 表達(dá)在HCC 組織中，相較于正常肝組織顯著升高，且隨著HCC 臨床分期和病理分級(jí)的升高，TLCD1mRNA 表達(dá)呈上升趨勢(shì)?？梢奣LCD1mRNA 的表達(dá)水平可能成為HCC 診斷、臨床分期和病理分級(jí)評(píng)估的參考指標(biāo)。TP53 基因突變誘發(fā)了HCC 的發(fā)生發(fā)展[15]。本研究還發(fā)現(xiàn)，在TP53 突變的HCC 組織中，TLCD1mRNA 呈現(xiàn)高表達(dá)，提示TLCD1 與TP53 基因突變存在相關(guān)性，從而參與了HCC 的進(jìn)程。

Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫和GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，TLCD1mRNA 高表達(dá)的HCC 患者OS、RFS、PFS、DSS 和DFS 均顯著低于低表達(dá)的患者，即TLCD1mRNA 可能作為預(yù)測(cè)HCC 預(yù)后的潛在標(biāo)志物。

本研究采用LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫，進(jìn)一步探討TLCD1 在HCC 中的作用機(jī)制。SAC3D1 是與TLCD1正相關(guān)性最強(qiáng)的基因，研究表明，SAC3D1 參與了中心體復(fù)制、紡錘體組裝等細(xì)胞周期進(jìn)程[16]，且SAC3D1 過表達(dá)是HCC 預(yù)后不良的潛在標(biāo)志[17，18]。基因富集分析提示，TLCD1 共表達(dá)基因參與核糖體、蛋白酶體、RNA 剪切、轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化磷酸化等信號(hào)通路，這些通路與基因表達(dá)調(diào)控、能量代謝的諸多過程密切相關(guān)?；蛲蛔?cè)贖CC 中尤為常見，關(guān)鍵基因的突變可誘發(fā)HCC 的發(fā)生發(fā)展[19，20]。TLCD1 與抑癌基因TP53 突變有相關(guān)性，可以推斷具有基因表達(dá)調(diào)控作用的TLCD1 可能參與了TP53 的突變，在HCC 形成發(fā)展中起關(guān)鍵作用。TLCD1 在HCC 中具體作用機(jī)制仍待更多研究驗(yàn)證。

綜上所述，本研究基于公開的基因表達(dá)和臨床數(shù)據(jù)庫，對(duì)TLCD1mRNA 在HCC 中的表達(dá)情況及預(yù)后價(jià)值進(jìn)行探索，發(fā)現(xiàn)TLCD1 在HCC 中的上調(diào)可能對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的多個(gè)環(huán)節(jié)有深遠(yuǎn)影響，有望成為HCC 新的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。