王俐勇，趙煥英，付文卓，楊予濤

（首都醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室1，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2，北京 100069）

肝癌（liver cancer）是一種常見惡性腫瘤，占所有癌癥死亡11%，排名第2位[1]。肝癌發(fā)展過(guò)程中伴隨肝細(xì)胞增殖和脂肪變性、氧化應(yīng)激、線粒體損傷和活性氧誘導(dǎo)，但其發(fā)生機(jī)制尚未完全明確。已有研究表明[2]，肝癌發(fā)展與癌細(xì)胞中核酸蛋白水平變化相關(guān)，找到合適分子生物標(biāo)志物有助于研究肝癌發(fā)病機(jī)制及進(jìn)行個(gè)性化治療。1976 年首次在RNA 病毒中發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA（circRNAs），近年來(lái)隨著RNA 測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)發(fā)展，發(fā)現(xiàn)cirRNAs 作為蛋白復(fù)合物中的支架結(jié)構(gòu)，從亞細(xì)胞定位隔離蛋白，調(diào)節(jié)親本基因表達(dá)，調(diào)節(jié)選擇性剪接和RNA-蛋白質(zhì)相互作用，形成microRNA 海綿結(jié)構(gòu)。circRNAs 與線性RNA 不同，其具有圓形共價(jià)鍵結(jié)構(gòu)，對(duì)核酸外切酶耐受性更高。研究表明[3，4]，circRNAs 可能參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。WGCNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析可用于microRNA 和非編碼長(zhǎng)鏈RNA 研究，通過(guò)構(gòu)建共表達(dá)模塊可挖掘篩選關(guān)鍵基因[5]。本研究探討加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析在肝癌環(huán)狀RNA 研究中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載和收集 通過(guò)GEO 網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載肝癌數(shù)據(jù)集（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE97332），將得到的circRNA 表達(dá)原始值均一化。從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)下載circRNA 芯片數(shù)據(jù)GSE97332（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE97332），包括14 例肝癌數(shù)據(jù)，其中7 例腫瘤組織，7 例正常組織。

1.2 數(shù)據(jù)集差異基因篩選分析 利用DESeq2 包（http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html）按照差異倍數(shù)大于2 倍，P值小于0.05 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)肝癌circRNA 進(jìn)行差異表達(dá)分析。

1.3 WGCNA 共表達(dá)分析 該數(shù)據(jù)集共檢測(cè)到3032個(gè)circRNA 分子，均一化后應(yīng)用WGCNA 方法構(gòu)建circRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。應(yīng)用R 軟件包WGCNA 構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)以下公式構(gòu)建加權(quán)鄰接矩陣Sij=|cor（Xi，Xj）|aij=Sijβ，其中i 和j 代表不同的circRNA，Xi 和Xj 代表circRNA 的表達(dá)量，Sij 表示皮爾遜相關(guān)系數(shù)，aij 表示2 個(gè)circRNA 之間的相關(guān)系數(shù)。本研究中選擇軟閾值β=10，無(wú)尺度模型擬合系數(shù)R2=0.91。

1.4 確定關(guān)鍵circRNA 將鄰接矩陣轉(zhuǎn)化成拓?fù)渚仃嚕═OM），TOM 矩陣是定量網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)之間加權(quán)關(guān)系相似性的方法，然后通過(guò)層次聚類確定模塊，每個(gè)模塊至少包含30 個(gè)circRNA，最后確定可能在肝癌起關(guān)鍵作用的circRNA。

1.5 基因富集分析和聚類 應(yīng)用circRNA 在線數(shù)據(jù)庫(kù)（https://circinteractome.nia.nih.gov/）篩選出circRNA 可能結(jié)合的miRAN，通過(guò)miRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）得 到miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因，利用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）在線分析工具對(duì)靶基因進(jìn)行KEGG 通路富集分析。

1.6 qPCR 驗(yàn)證 DMEM 培養(yǎng)液和10%胎牛血清體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞系（HepG2）和正常肝細(xì)胞系（L02），收集細(xì)胞懸液使用TRIzol 從這些細(xì)胞中分離總RNA，通過(guò)RNase R 處理提高circRNA 的濃度，逆轉(zhuǎn)錄后使用實(shí)時(shí)定量qPCR 分析定量circRNA。以β-actin為內(nèi)參照，PCR 的反應(yīng)條件：95 ℃2 min、95 ℃15 s、58 ℃60 s，共40 個(gè)循環(huán)，qPCR 引物序列見表1。

表1 circRNA 引物序列

1.7 生存分析驗(yàn)證 通過(guò)Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://kmplot.com/analysis/index.php）對(duì)篩選出來(lái)circRNA 靶向的microRNA 進(jìn)行生存分析驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)均一化和選擇軟閾值 共檢測(cè)到3032 個(gè)circRNA 分子，均一化后應(yīng)用WGCNA 方法構(gòu)建circRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，當(dāng)軟閾值為10 時(shí)，基因之間連通性符合無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)分布，無(wú)尺度模型擬合系數(shù)R2=0.91，見圖1。

圖1 WGCNA 軟閾值確定

2.2 共表達(dá)模塊構(gòu)建與肝癌相關(guān)模塊的關(guān)系 應(yīng)用WGCNA 方法共得到7 個(gè)模塊，其中Turquoise 模塊與肝癌組織呈正相關(guān)（P＜0.05），見表2、圖2。

圖2 Turquoise 模塊與肝癌組織的相關(guān)性

表2 共表達(dá)模塊構(gòu)建與肝癌相關(guān)模塊的關(guān)系

2.3 circRNA 與miRNA 關(guān)聯(lián)基因篩選 Turquoise 模塊中circRNA 表達(dá)量在肝癌組織中均表達(dá)上調(diào)，見表3。經(jīng)過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)篩選出hsa_circ_0064324和hsa_circ_0040827 進(jìn)一步分析，共篩選出hsamiR-146b-3p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-874-3p和hsa-miR-942-3p 四個(gè)miRNA 分子，然后通過(guò)miRWalk 數(shù)據(jù)庫(kù)miRDB、TargetScan、miRTarBase 軟件篩選出這些miRNA 對(duì)應(yīng)的靶基因，構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)，見圖3。

圖3 肝癌中circRNA-miRNA-mRNA 相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

表3 Turquoise 模塊中circRNA 量表達(dá)

2.4 功能富集分析驗(yàn)證 提取miRWalk 數(shù)據(jù)庫(kù)miRDB、TargetScan、miRTarBase 軟件篩選得到miRNA靶向基因，利用David 在線分析軟件對(duì)這些基因進(jìn)行Pathway 富集分析，結(jié)果顯示這些靶向基因富集在鞘磷脂信號(hào)通路、癌癥蛋白聚糖、血小板活化通路、胰腺癌通路、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、FoxO 信號(hào)通路、癌癥中膽堿代謝通路等多個(gè)和癌癥相關(guān)的通路上，見圖4。

圖4 KEGG 富集通路分析

2.5 功能驗(yàn)證 體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞系（HepG2）和正常肝細(xì)胞系（L02），并對(duì)篩選到的hsa_circ_0064324和hsa_circ_0040827 定量檢測(cè)，可見在肝癌細(xì)胞系中hsa_circ_0064324 和hsa_circ_0040827 均表達(dá)上調(diào)，見圖5。Kaplan-Meier 生存分析發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-146b-3p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-874-3p 和hsa-miR-942-3p 高表達(dá)與肝癌總體生存期呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見圖6。

圖5 關(guān)鍵circRNA 在不同細(xì)胞系中表達(dá)

圖6 miRNA 生存分析驗(yàn)證

3 討論

circRNA 是一類封閉環(huán)狀非編碼RNA，分為外顯子環(huán)狀RNA、內(nèi)含子環(huán)狀RNA，通過(guò)和miRNA 結(jié)合在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后以及翻譯和翻譯后水平調(diào)控基因表達(dá)發(fā)揮重要作用。circRNA 具有表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定、表達(dá)調(diào)控有時(shí)空特異性、成環(huán)序列保守等優(yōu)勢(shì)，在肝癌發(fā)生機(jī)制研究中備受關(guān)注[6]。目前已發(fā)現(xiàn)circRNA-5692[7，8]、circRNA-100338[9，10]、hsa_circRNA_104348[11，12]與 肝癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)。這些環(huán)狀RNA 通過(guò)內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA（ceRNA）機(jī)制結(jié)合miRNA 分子導(dǎo)致靶基因沉默，影響肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。由于肝癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制復(fù)雜，需要更好的方法挖掘更多肝癌相關(guān)環(huán)狀RNA 以揭示肝癌調(diào)控機(jī)制。

circRNA 芯片具有通量高檢測(cè)靈敏度高特點(diǎn)，可以對(duì)人體內(nèi)大多數(shù)circRNA 同時(shí)高效檢測(cè)。本研究利用芯片數(shù)據(jù)中circRNA 之間相互關(guān)聯(lián)絕對(duì)值定義共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)一個(gè)鄰接矩陣定義相互關(guān)聯(lián)權(quán)重，采用軟閾值參數(shù)構(gòu)造加權(quán)網(wǎng)絡(luò)，使用拓?fù)渲丿B度量（TOM）作為鄰近度量，結(jié)合2 個(gè)鄰接circRNA 相互作用強(qiáng)度，聚類成網(wǎng)絡(luò)模塊[13，14]。另在網(wǎng)絡(luò)模塊中，應(yīng)用主成分分析計(jì)算出主成分和臨床性狀相互關(guān)系，確定與肝癌相關(guān)模塊，并依據(jù)circRNA 與主成分模塊相互關(guān)系確定出關(guān)鍵circRNA[15，16]。本研究從與肝癌正相關(guān)Turquoise 模塊中挑選出上調(diào)表達(dá)cir cRNAs，經(jīng)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)篩選出hsa_circ_0064324、hsa_circ_0040827 進(jìn)一步分析，利用qPCR 定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞系HepG2 中它們均表達(dá)上調(diào)，并在數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)這些circRNA 可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合hsa-miR-146b、hsa-miR-942、hsa-miR-331、hsa-miR-874；經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這些microRNA 分子下游靶基因多富集在與癌癥發(fā)生發(fā)展相關(guān)通路。有研究證明[17]，F(xiàn)oxO 信號(hào)通路與肝癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān),該通路中FoxO 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)多種生物過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、死亡、衰老、血管生成、細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移所必需的基因。

預(yù)后評(píng)價(jià)是制定臨床方案重要參考之一，對(duì)于延長(zhǎng)患者生存期意義重大。Li C等[18]研究發(fā)現(xiàn)，TRAF6（TNF 受體相關(guān)因子）為肝癌中miR-146b-5p靶向位點(diǎn)，通過(guò)抑制TRAF6 介導(dǎo)AKT 通路磷酸化可減少肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。Zhang QF等[19]研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，肝癌組織和細(xì)胞系中miR-942-3p 表達(dá)水平升高，并與病理分期和腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期相關(guān)，是肝癌患者生存率低的獨(dú)立預(yù)后因素。PH 域和亮氨酸豐富重復(fù)蛋白磷酸酶（PHLPP）是miR-331-3p 靶點(diǎn)，miR-331-3p 通過(guò)抑制PHLPP 介導(dǎo)AKT 通路去磷酸化，促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。在肝癌細(xì)胞系PLC/PRF/5 中過(guò)表達(dá)的miR-874-3p 會(huì)抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。本研究Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-146b-3p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-874-3p 和hsa-miR-942-3p 高表達(dá)與肝癌總體生存期呈負(fù)相關(guān)，即表達(dá)量越低，患者肝癌預(yù)后生存期越長(zhǎng)，提示hsa-miR-146b-3p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-874-3p 和hsa-miR-942-3p 高表達(dá)有可能是患者不良預(yù)后獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

綜上所述，利用WGCNA 方法篩選出hsa_circ_0064324 和hsa_circ_0040827，經(jīng)生物信息學(xué)分析認(rèn)為其可能結(jié)合hsa-miR-146b-3p、hsamiR-331-3p、hsa-miR-874-3p 和hsa-miR-942-3p，間接調(diào)控下游靶基因表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞增殖侵襲，這兩個(gè)circRNA 分子可能作為肝癌的生物標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)，對(duì)肝癌診斷和治療有積極意義，然而如何調(diào)控靶基因作用于癌癥發(fā)生與轉(zhuǎn)移仍有待進(jìn)一步探索。