徐秀麗，顧教元，文冶，姜萱，晁仲昊，鄒孝強(qiáng)*

1(國(guó)家功能食品工程技術(shù)研究中心，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江南大學(xué)，食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)2(成都派特生物科技有限公司，四川 成都，611138) 3(成都天一美膳營(yíng)養(yǎng)食品有限公司，四川 成都，610095)

魔芋是天南星科魔芋屬的總稱，主要分布在亞熱帶地區(qū)[1]，我國(guó)魔芋種植歷史悠久，資源豐富。中國(guó)和日本是世界上主要的魔芋生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)[2]，魔芋產(chǎn)品被世界衛(wèi)生組織評(píng)為“十大健康產(chǎn)品”之一[3]。葡甘露聚糖是魔芋中主要的膳食纖維，是由β-1,4糖苷鍵連接甘露糖和葡萄糖組成的一種水溶性多糖，精制魔芋粉中其含量高達(dá)50～70 g/100 g[4]。魔芋葡甘露聚糖具有良好的吸水性、黏性、成膜性和增稠性，其應(yīng)用廣泛，可用于食品添加劑、健康食品和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，可降低血清膽固醇濃度[5]、降低血糖[6]、減少便秘、促進(jìn)人體腸道活動(dòng)和免疫功能[3]，此外還可以用于果蔬的成膜保鮮[7]，控制親脂性生物活性物質(zhì)如姜黃素[8]、β-胡蘿卜素[9]的釋放速率等。

肥胖是當(dāng)今社會(huì)普遍關(guān)注的問(wèn)題，而膳食纖維本身的低能量與高飽腹感使其成為預(yù)防肥胖的潛在方法。大量研究表明膳食纖維影響小腸對(duì)葡萄糖和膽汁酸的吸收，從而降低餐后血糖、血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇濃度[10-11]。通過(guò)小鼠試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)膳食纖維可以減少小鼠食物攝入量和腹部脂肪含量[12]，降低血液中胰高血糖素和甘油三酯(triacylglycerol，TAG)水平[13]，并且膳食纖維對(duì)年老大鼠肝臟和脂肪組織質(zhì)量的影響比年輕大鼠更強(qiáng)烈[14]，同時(shí)有研究表明膳食纖維可以顯著降低女性體重和脂肪增加的風(fēng)險(xiǎn)[15]。因此，在日常飲食中增加膳食纖維的攝入可以有效減少脂肪積累。

乳液消化模型包括體內(nèi)模型(動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、人體實(shí)驗(yàn))和體外消化模型，但體內(nèi)模型成本較高，而體外消化實(shí)驗(yàn)成本低、重復(fù)性高且過(guò)程可視化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果通常與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符[16]，因此本研究采用體外消化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行基礎(chǔ)研究。目前已有很多成人的體外消化模型，多數(shù)為靜態(tài)模型，如利用pH-stat法實(shí)現(xiàn)胃腸系統(tǒng)pH恒定，該模型簡(jiǎn)單方便，消化結(jié)果具有可比性[17]。魔芋作為一種多功能植物資源，其減肥效果也受到了普遍關(guān)注[18]。本文以魔芋膳食纖維為原料，通過(guò)構(gòu)建體外胃腸道消化系統(tǒng)，利用pH-stat法模擬并記錄脂肪乳液體外消化過(guò)程，考察不同魔芋膳食纖維含量對(duì)脂肪乳液消化的影響，推測(cè)其可能的作用機(jī)制，以期為魔芋膳食纖維在食品方面的開(kāi)發(fā)利用提供新思路，并為膳食纖維用于肥胖預(yù)防提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

顆粒魔芋膳食纖維，成都派特生物科技有限公司；金龍魚(yú)玉米油，市售；黑曲霉脂肪酶A，阿拉丁試劑有限公司；胃蛋白酶，上海麥克林生化科技有限公司；豬胰脂肪酶，美國(guó)Sigma公司；NaCl、HCl、CaCl2·2H2O、NaOH、甲酸、無(wú)水乙醇(均為分析純)、豬膽鹽、吐溫-20，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；異丙醇、正己烷(均為HPLC級(jí))，百靈威科技有限公司；尼羅紅，北京伊諾凱科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

IKA T18 digital ULTRA-TURRAX分散機(jī)，上海凌儀生物科技有限公司；ZNCL-G智能恒溫磁力攪拌儀，愛(ài)博特科技發(fā)展有限公司；STARTER 3100型 pH計(jì)，美國(guó)OHAUS公司；Zetasizer nano ZS納米粒度及Zeta電位儀，英國(guó)馬爾文公司；S3500激光粒度分析儀，美國(guó)Microtrac公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D循環(huán)水式多用真空泵，上海力辰邦西儀器科技有限公司；示差折光高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；AB 104-N分析天平，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司；Axio Vert A1倒置熒光顯微鏡，德國(guó)蔡司公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 脂肪乳液的制備

參照文獻(xiàn)[8,19]的方法制備并做相應(yīng)修改。將0.5% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))的吐溫-20溶解于去離子水中，攪拌30 min，提前1 d配制并置于4 ℃下過(guò)夜。在乳化劑溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、0.1%、0.3%、0.5%的魔芋膳食纖維，攪拌4 h使纖維充分溶解，獲得脂肪乳液的水相。使用高速剪切分散機(jī)[19]，在9 000 r/min的條件下將5% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))的玉米油和95% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))的水相混合3 min，即獲得最終的脂肪乳液，所有樣品現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 體外消化

基于前人對(duì)脂肪體外消化的研究[20-22]，本實(shí)驗(yàn)對(duì)體外消化參數(shù)略作改動(dòng)：

(1)消化儲(chǔ)備液的配制：

胃部?jī)?chǔ)備液：2 g/L NaCl和1.75 mL 1 mol/L HCl，去離子水定容至250 mL，調(diào)節(jié)pH值為3。

小腸儲(chǔ)備液：6.574 g/L NaCl和1.457 g/L CaCl2·2H2O，去離子水定容至250 mL，調(diào)節(jié)pH值為6.8。

(2)胃消化液：向20 mL胃部?jī)?chǔ)備液中加入一定量黑曲霉脂肪酶A(最終120 U/mL)和胃蛋白酶(最終2 000 U/mL)，用1 mol/L HCl溶液調(diào)pH為3，恒溫37 ℃下以10 r/min磁力攪拌20 min。

(3)腸消化液：向30 mL小腸儲(chǔ)備液中加入膽鹽(10 mmol/L)和胰酶(最終64～256 U/mL)，用1 mol/L HCl溶液調(diào)pH為6.8，37 ℃，10 r/min磁力攪拌10 min，使溶液混勻。

(4)消化過(guò)程：

胃階段：取40 mL脂肪乳液，調(diào)pH至3，與20 mL已預(yù)熱的胃消化液混合，調(diào)整混合體系pH至3，然后將混合液放置于37 ℃水浴中攪拌1 h，模擬胃消化階段，消化完成后取樣以備后期分析。

腸階段：取30 mL胃消化產(chǎn)物，調(diào)pH至6.8，加入30 mL已預(yù)熱的腸消化液，37 ℃下反應(yīng)2 h，不斷滴加0.1 mol/L NaOH溶液，使體系恒定pH 6.8，記錄NaOH溶液體積，消化完成后取樣以備后期分析。

1.3.3 脂肪酸消化率的計(jì)算

根據(jù)消化過(guò)程中NaOH溶液消耗量來(lái)測(cè)定樣品脂肪酸釋放率，按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：c, NaOH溶液濃度，0.1 mol/L；V,滴定所消耗的NaOH溶液體積，mL；M,油脂的摩爾質(zhì)量，g/mol；m,乳液中油脂的質(zhì)量，g。

1.3.4 脂解產(chǎn)物分析

提脂：乳液消化后脂肪的提取根據(jù)B&D法并略作修改[23]。取15 mL腸消化后樣品與10 mL氯仿和5 mL甲醇混合，充分振蕩10 min，靜置30 min分層，收集下層有機(jī)相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除有機(jī)相，所得脂肪儲(chǔ)存于-20 ℃下以進(jìn)行后續(xù)操作。

脂類組成分析：取稱量過(guò)后的脂質(zhì)，加入流動(dòng)相，稀釋為20 mg/mL，過(guò)濾膜后進(jìn)行分析。利用配備示差檢測(cè)器的高效液相色譜儀進(jìn)行脂類組成分析，色譜條件為：色譜柱Sepax HP-Silica硅膠柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，流動(dòng)相V(正己烷)∶V(異丙醇)∶V(甲酸)= 15∶1∶0.003，流速1 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量20 μL。依據(jù)樣品濃度與峰面積呈線性關(guān)系，用面積歸一法計(jì)算各脂質(zhì)組分相對(duì)組成。

1.3.5 粒度測(cè)定

用激光粒度分析儀測(cè)定各消化階段乳液的粒徑，設(shè)置樣品為球形，根據(jù)軟件界面將樣品稀釋到合適的遮光度范圍，測(cè)得的平均粒徑采用體積平均粒徑d43表示，按公式(2)計(jì)算：

(2)

式中：ni，粒徑為di的顆粒個(gè)數(shù)。

1.3.6 Zeta-電位測(cè)定

乳液表面電位通過(guò)納米粒度及Zeta電位儀測(cè)定，測(cè)量前使用同pH的蒸餾水將乳液稀釋100倍。

1.3.7 微觀結(jié)構(gòu)觀察

取200 μL樣品用20 μL尼羅紅染液(0.1 mg/mL，溶解于無(wú)水乙醇)染色，混合均勻后取20 μL于載玻片上，蓋上蓋玻片后利用倒置熒光顯微鏡觀察乳液樣品微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均同時(shí)進(jìn)行3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)差異的顯著性使用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS分析得到，P<0.05表示差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖使用Origin 9.1繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 魔芋膳食纖維對(duì)脂肪消化的影響

人體胃消化階段可以水解10%～30%的脂肪[24]，但胃消化過(guò)程中，胃酸的分泌降低了體系pH值，脂肪酶活性較低，產(chǎn)生的脂肪酸對(duì)乳液pH影響較小[25]，采用pH-stat法無(wú)法表征胃消化階段脂肪酸釋放率，故僅考察腸消化過(guò)程脂肪酸釋放情況，如圖1所示，未添加魔芋膳食纖維的脂肪乳液經(jīng)消化后，脂肪酸釋放率達(dá)到(16.72±0.68)%，當(dāng)纖維添加量為0.5%時(shí)，乳液中脂肪酸的釋放率僅為(14.84±0.5)%，釋放率減少了11.1%，添加魔芋膳食纖維后釋放率顯著降低(P<0.05)。

圖1 魔芋膳食纖維對(duì)脂肪消化過(guò)程中脂肪 酸釋放率的影響Fig.1 Impact of konjac dietary fiber on fatty acids release rate in lipid digestion

另一方面，在消化前20 min內(nèi)，脂肪酸釋放速率快速增加，添加魔芋膳食纖維后初期釋放速率減小，但纖維的添加量對(duì)其影響不明顯。HE等[8]研究發(fā)現(xiàn)，是否添加魔芋葡甘露聚糖對(duì)姜黃素乳液中游離脂肪酸釋放情況無(wú)顯著影響(P>0.05)，這是因?yàn)樵撗芯恐心в笃细事毒厶翘砑恿績(jī)H為0.3%，作用效果不明顯。腸道作為脂肪吸收的主要場(chǎng)所，加入纖維增加乳液體系黏度，降低分子擴(kuò)散速率，從而降低腸消化階段脂質(zhì)水解速率和程度；也可能會(huì)促進(jìn)脂滴絮凝，降低脂酶與脂滴表面相互作用[26]。研究發(fā)現(xiàn)果蔬纖維可以有效減少脂肪的消化吸收，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的機(jī)制可能與胃排空延遲、阻斷部分脂肪消化吸收以及增加腸道運(yùn)轉(zhuǎn)速度有關(guān)[27]。

對(duì)體外胃腸道消化產(chǎn)物進(jìn)行分析，甘油酯組成包括TAG、甘二酯(diacylglycerol，DAG)和單甘酯(monoacylglycerol, MAG)。

如圖2所示，脂解產(chǎn)生少量MAG，脂消化產(chǎn)物以DAG為主。未添加魔芋膳食纖維的脂肪乳液消化后TAG、DAG和MAG相對(duì)含量分別為59.08%、39.43%和1.49%，添加0.5%魔芋纖維的乳液消化產(chǎn)物比例分別是66.72%、31.43%和1.85%，隨著纖維添加量增加，TAG水解程度減少12.93%，DAG生產(chǎn)量減少8%，MAG變化不大。魔芋膳食纖維的高黏度和凝膠特性使其具有穩(wěn)定乳狀液的能力，在脂滴表面形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的保護(hù)層，阻礙胰脂肪酶與脂滴接觸，導(dǎo)致乳液脂解程度減少[8]。

圖2 魔芋膳食纖維對(duì)脂肪消化過(guò)程中甘油酯 生產(chǎn)量的影響Fig.2 Impact of konjac dietary fiber on production volume of glycerides in lipid digestion

2.2 魔芋膳食纖維對(duì)脂肪乳液消化前后粒徑的影響

如圖3所示，經(jīng)過(guò)體外消化，乳液平均粒徑變化趨勢(shì)相似，總體來(lái)說(shuō)消化后的粒徑均顯著增加(P<0.05)。對(duì)于消化前的乳液樣品，未添加膳食纖維的乳液粒徑為(2.12±0.83) μm，當(dāng)膳食纖維添加量為0.5%時(shí)，乳液有效粒徑達(dá)到(28.22±2.74) μm。乳液體系中高分子聚合物會(huì)產(chǎn)生排空效應(yīng)，高聚物膳食纖維濃度越大，產(chǎn)生空位的相對(duì)體積越大，相應(yīng)的滲透壓隨之增大，乳液液滴更易發(fā)生聚集和絮凝[26]。初始乳液靜置一段時(shí)間，乳液中脂滴上升到頂層形成不透明奶油層并在表層發(fā)生聚集[28]。腸消化后乳液粒徑分別為(18.79±3.46)、(98.3±3.58)、(135±2.56)、(158.6±4.12) μm，所有含纖維樣品均有較大的平均粒徑，這是由于消化過(guò)程中機(jī)械攪拌加劇乳液脂滴聚集，同時(shí)腸液中陽(yáng)離子會(huì)促進(jìn)聚合物形成凝膠體系[29]。

圖3 魔芋膳食纖維對(duì)脂肪乳液消化前后粒徑的影響Fig.3 Impact of konjac dietary fiber on particle size of lipid emulsion before and after digestion注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3 魔芋膳食纖維對(duì)脂肪乳液消化前后粒徑分布的影響

由于是模擬人體攝入及消化食物的過(guò)程，因此僅對(duì)樣品做高速剪切處理而未進(jìn)行均質(zhì)。如圖4所示，與消化后的乳液相比，初始乳液粒徑分布較為集中。纖維含量為0%的初始乳液粒徑主要分布于0.01～10 μm，加入魔芋纖維后初始乳液粒徑普遍增大，主要在1～100 μm之間，且隨著纖維含量增加，粒徑也有所增大。經(jīng)過(guò)胃和腸消化后乳液穩(wěn)定性變差，顆粒粒徑分布變廣，存在許多較大的顆粒，且魔芋纖維含量越高，大顆粒占比越高。脂質(zhì)消化可能導(dǎo)致體系中存在許多不同種類的膠體顆粒，包括未消化脂滴、脂解產(chǎn)物和膽汁鹽組成的混合膠束，以及生成的不溶性鈣皂等[30]，各種因素綜合作用使消化后脂滴的尺寸增加。

a-0%；b-0.1%；c-0.3%；d-0.5%圖4 魔芋膳食纖維對(duì)脂肪乳液消化前后粒徑分布的影響Fig.4 Impact of konjac dietary fiber on particle size distribution of lipid emulsion before and after digestion

2.4 魔芋膳食纖維對(duì)脂肪乳液消化前后Zeta電位的影響

Zeta電位指剪切面的電位，是表征膠體分散系統(tǒng)穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。由圖5可知，未添加纖維的初始乳液表面帶有較高正電荷(19.30±0.52) mV，可能是由于體系pH值過(guò)低，小于乳液等電點(diǎn)，一些正電荷如H+吸附在脂滴表面；添加魔芋膳食纖維的初始乳液表面電位有所下降，但仍帶正電荷，說(shuō)明魔芋膳食纖維表面帶負(fù)電荷，可吸附到帶正電荷的脂滴表面，降低脂滴表面電位[31]。

圖5 魔芋膳食纖維對(duì)脂肪乳液消化前后Zeta電位的影響Fig.5 Impact of konjac dietary fiber on Zeta potential of lipid emulsion before and after digestion

小腸是脂質(zhì)消化的主要場(chǎng)所，經(jīng)小腸消化后，乳液樣品Zeta電位絕對(duì)值明顯增大(P<0.05)，分別為(-43.3±0.42)、(-43.83±0.58)、(-42.53±0.56)、(-44±0.57) mV，且均為負(fù)值，表明腸消化過(guò)程對(duì)乳液界面造成很大影響[32]。Zeta電位絕對(duì)值小于30 mV時(shí)，粒子容易發(fā)生聚集，所以腸消化后的乳液體系朝不穩(wěn)定狀態(tài)發(fā)展。但隨著纖維含量增加，Zeta電位絕對(duì)值變化不顯著，可解釋為纖維含量對(duì)脂滴表面電位的作用達(dá)到飽和[29]。

2.5 魔芋膳食纖維對(duì)脂肪乳液消化前后微觀結(jié)構(gòu)的影響

如圖6所示，脂肪乳液微觀結(jié)構(gòu)與激光粒度分析儀所測(cè)得的粒徑變化趨勢(shì)一致，整體來(lái)說(shuō)乳液中較大顆粒尺寸隨著纖維添加量增加相對(duì)變大。對(duì)于初始乳液，由于加入的膳食纖維具有一定黏性，脂滴相互粘連在一起，且纖維含量越高，粘連現(xiàn)象越明顯。胃腸消化后脂滴發(fā)生聚集，相較于初始乳液其粒徑明顯增大。SRIKAEO等[4]研究發(fā)現(xiàn)，相比于抗性淀粉，魔芋葡甘露聚糖的存在會(huì)使植脂未乳液表現(xiàn)出更明顯的液滴絮凝及合并現(xiàn)象，與本研究結(jié)果一致。

圖6 魔芋膳食纖維對(duì)脂肪乳液消化前后微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.6 Impact of konjac dietary fiber on microstructure of fat emulsion before and after digestion

3 結(jié)論與討論

通過(guò)對(duì)消化過(guò)程監(jiān)控，發(fā)現(xiàn)脂肪酸釋放率與魔芋膳食纖維添加量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，纖維添加量越高消化后TAG相對(duì)含量越高，與脂肪酸釋放率變化趨勢(shì)相對(duì)應(yīng)；魔芋膳食纖維對(duì)各消化階段乳液粒徑產(chǎn)生顯著影響，隨質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大而升高，但對(duì)腸消化后乳液Zeta電位影響不顯著。添加魔芋膳食纖維會(huì)減少油脂在體外的消化率，產(chǎn)生這種結(jié)果的機(jī)制可能是纖維促進(jìn)脂滴絮凝，降低脂酶與脂滴作用面積；增加了乳液體系黏度，降低分子擴(kuò)散速率；作為抑制劑抑制胰脂肪酶活性；在脂滴表面形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的保護(hù)層，阻礙胰脂肪酶與脂滴接觸。