胡連清，劉雯雯，劉婉茹，周萬海*，馮瑞章，魏琴，趙鑫，趙善梅，陳雨薇

1(宜賓學(xué)院 農(nóng)林與食品工程學(xué)部，四川 宜賓，644000) 2(香料植物資源開發(fā)與利用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 四川 宜賓，644000)3(簡陽市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，四川 簡陽，641400)

蛋白酶是一類能夠催化水解肽鍵的酶，廣泛存在于動物內(nèi)臟、植物莖葉及果實(shí)和微生物中[1]。因具有催化條件溫和、效率高及能提升蛋白質(zhì)生物功能等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于環(huán)保、化工、醫(yī)藥、飼料、食品加工等行業(yè)，是目前應(yīng)用最廣泛的工業(yè)化酶制劑[2]。根據(jù)蛋白酶的來源不同，又可以將蛋白酶分為動物蛋白酶、植物蛋白酶以及微生物蛋白酶，與動植物蛋白酶相比，微生物蛋白酶種類豐富、提取工藝簡單，不受原料限制，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[3]，且微生物具有生長條件簡單、生長速度快、代謝過程特殊和分布廣等特點(diǎn)，由此成為生物酶的重要來源，工業(yè)上較多的蛋白酶均來自于微生物發(fā)酵法[4-5]。目前廣泛用于工業(yè)蛋白酶生產(chǎn)的主要有細(xì)菌中的乳酸菌、地衣芽孢桿菌以及真菌中的青霉菌、鐮刀菌、曲霉菌和酵母等[6]。生產(chǎn)上為獲得具有更好產(chǎn)酶能力的菌株，常采用基因工程技術(shù)、誘變及遺傳育種進(jìn)行菌株重構(gòu)，但會存在產(chǎn)物活性不高、性質(zhì)差異性大以及菌株不穩(wěn)定等問題[7-8]。因此挖掘新型蛋白酶、篩選高產(chǎn)、產(chǎn)物活性高、催化條件要求低且穩(wěn)定的菌株成為研究的熱點(diǎn)。

隸屬于子囊菌門和擔(dān)子菌門的酵母，可在深海、沼澤、土壤、冰川和植物體等環(huán)境中棲居與生活[9-11]，同時也可寄生在植物的分生組織莖、花、葉、和果實(shí)中作為內(nèi)生菌，并對宿主植物的生長發(fā)育、健康、適應(yīng)性和物質(zhì)代謝等方面產(chǎn)生重要的影響[12]。目前對內(nèi)生酵母菌的研究多集中于群落多樣性、可培養(yǎng)菌株的抑菌、促生功能物質(zhì)生產(chǎn)和發(fā)酵特性等方面，如VAZ等[13]在巴西蘭花內(nèi)生真菌的研究中發(fā)現(xiàn)，有3株內(nèi)生酵母具有抗菌活性；NASSAR等[14]從玉米中分離到8株能產(chǎn)生生長素IAA和IPYA的內(nèi)生酵母菌；一些從楊樹中分離的內(nèi)生酵母則對常見發(fā)酵抑制劑具有抗性[15]。高健等[16]從莖用萵苣中分離出一株能利用麥芽汁產(chǎn)生檸檬烯的內(nèi)生酵母。一些研究也指出，內(nèi)生酵母多通過進(jìn)行相應(yīng)的新陳代謝與分泌胞外酶以適應(yīng)宿主植物體內(nèi)特殊環(huán)境[17]，且這些胞外酶可能在常溫等環(huán)境條件內(nèi)穩(wěn)定，并具有廣泛的底物特異性和更高的催化效率，因而在生產(chǎn)應(yīng)用中具有諸多優(yōu)勢，目前，一些研究人員已對產(chǎn)不同胞外酶的內(nèi)生酵母進(jìn)行了分離篩選和生產(chǎn)應(yīng)用[18]，但對產(chǎn)蛋白酶內(nèi)生酵母菌的分離鑒定和發(fā)酵特性研究較為缺乏。而且，除菌株外，產(chǎn)酶類型和產(chǎn)酶發(fā)酵條件是決定菌株胞外酶產(chǎn)量高低及生產(chǎn)應(yīng)用的主要因素，基于此，本研究以從3個糯紅高粱品種不同器官中分離的內(nèi)生酵母為研究對象，利用篩選培養(yǎng)基，分離、篩選并鑒定具有產(chǎn)蛋白酶功能內(nèi)生酵母菌株，同時以在食品、藥品和飼料行業(yè)應(yīng)用廣且催化速度快、催化過程溫和、無污染等優(yōu)點(diǎn)的中性蛋白酶為切入點(diǎn)[19]，對產(chǎn)蛋白酶菌株的氮源利用能力以及產(chǎn)酶發(fā)酵條件進(jìn)行篩選和分析，以期為尋找不同領(lǐng)域所需蛋白酶提供參考依據(jù)并奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

分離內(nèi)生酵母的糯紅高粱品種為雜交高粱金糯糧1號和地方品種青殼洋。分離培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基，酵母鑒定用WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，產(chǎn)蛋白酶菌株初篩用脫脂乳營養(yǎng)培養(yǎng)基[10 g/L脫脂乳，20 g/L瓊脂(pH 6.6)]。不同氮源利用功能篩選培養(yǎng)基分別為干酪素培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基、膠原蛋白培養(yǎng)基、黃豆粉培養(yǎng)基、菜籽餅粕培養(yǎng)基等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)生酵母菌的分離

將糯紅高粱不同時期不同器官表面消毒后用接組織塊的方法接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基上。在22 ℃下培養(yǎng)，當(dāng)組織塊傷口出現(xiàn)菌落時，及時用接種環(huán)挑出菌落進(jìn)一步連續(xù)劃線至WL培養(yǎng)基上，進(jìn)行形態(tài)鑒定，獲得純化的內(nèi)生酵母菌株。

1.2.2 產(chǎn)中性蛋白酶功能菌株及不同氮源利用能力篩選

利用脫脂乳培養(yǎng)基初篩具有產(chǎn)蛋白酶功能的內(nèi)生酵母菌，再將初篩得到的內(nèi)生酵母菌采用三點(diǎn)點(diǎn)樣法分別于常用產(chǎn)蛋白酶功能培養(yǎng)基(干酪素培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基、膠原蛋白培養(yǎng)基、黃豆粉培養(yǎng)基、菜籽餅粕培養(yǎng)基)上接種，后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h左右觀察菌落生長狀況，查看是否生長透明圈，并拍照記錄。用直尺測量菌落直徑和透明圈大小。

1.2.3 產(chǎn)中性蛋白酶菌株分子生物學(xué)鑒定

將篩選出的具產(chǎn)蛋白酶特性的酵母菌接種至WL培養(yǎng)基上，置于25 ℃培養(yǎng)2 d。取50 μL Lysis Buffer裂解液于無菌離心管內(nèi)，挑少許純化菌株于管內(nèi)，于80 ℃恒溫水浴鍋熱變性15 min，取出進(jìn)行低速離心，保留上清液作為PCR擴(kuò)增所需模板。利用通用引物對內(nèi)生酵母菌用26S rDNA D1/D2基因進(jìn)行通用引物(NL1、NL2)PCR擴(kuò)增，進(jìn)行分子鑒定。PCR反應(yīng)體系包括：5 μL DNA模板、1 μL NL1(10 mmol/L)、1 μL NL2(10 mmol/L)、25 μL 2×TaqPCR Master Mix、18 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min， 94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，32個循環(huán)，72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。擴(kuò)增產(chǎn)物檢測合格后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，再將結(jié)果提交到NCBI-BLAST網(wǎng)站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)，應(yīng)用BLAST先在GenBank上進(jìn)行相似序列檢索。

1.2.4 中性蛋白酶酶活力的測定

將上述篩選的酵母菌分別接種至YPD液體培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，調(diào)整菌液濃度至OD600=1，分別吸取上述培養(yǎng)液0.5 mL，接種至50 mL YPD液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后取菌液于10 000 r/min、4 ℃ 的條件下離心 15 min，上清液即為粗酶液。蛋白酶活力參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》進(jìn)行測定[20]，以酪氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，酶活力單位(U)定義為：每毫升酶液在 40 ℃、pH 7.5下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量為1個蛋白酶活力單位。酶活力按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：A，樣品平行試驗(yàn)的平均吸光度；K，吸光常數(shù)；4，反應(yīng)試劑總體積，mL；10，反應(yīng)時間10 min；n，稀釋倍數(shù)。

1.2.5 產(chǎn)中性蛋白酶菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化

以1.2.4篩選的產(chǎn)蛋白酶活力最高的2株菌為研究對象，分析不同碳源(葡萄糖、蔗糖、淀粉，添加量為1%)；氮源(干酪素、牛肉膏、硫酸銨，添加量為1%)；溫度(25、30、35 ℃)；pH(培養(yǎng)基初始pH值為5.0、7.0、9.0)；接種量(1%、2%、3%)等培養(yǎng)條件對其中性蛋白酶活性的影響，篩選最佳發(fā)酵條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 糯紅高粱產(chǎn)蛋白酶內(nèi)生酵母篩選與分子鑒定

從糯紅高粱不同時期(花期、苗期)不同器官(根、莖、葉、花、種子)中分離篩選出33株產(chǎn)蛋白酶內(nèi)生酵母(表1)， 根據(jù)形態(tài)特征和26S rDNA D1/D2區(qū)基因序列分析技術(shù)，得出33株產(chǎn)蛋白酶內(nèi)生菌隸屬于1門、4目、13屬，優(yōu)勢目為銀耳目(Tremellales)占總數(shù)的57.62%；優(yōu)勢種屬為Papiliotremarajasthanensis，占總數(shù)的27.3%。

表1 糯紅高粱產(chǎn)蛋白酶內(nèi)生酵母分布Table 1 Distribution of protease-producing endophyte endophytic yeasts in waxy sorghum

2.2 產(chǎn)蛋白酶內(nèi)生酵母對不同氮源利用能力研究

2.2.1 以干酪素為氮源篩選功能內(nèi)生酵母菌

以干酪素為氮源對33株產(chǎn)蛋白酶酵母菌篩選發(fā)現(xiàn)：其中7株酵母菌能分解利用干酪素，對該7株酵母菌的產(chǎn)酶能力分析表明，菌株J3-J78、J3-75和J24的產(chǎn)酶能力和活性較高，其中J3-78菌株產(chǎn)酶能力最優(yōu)，J4-48、J4-52菌株產(chǎn)分解利用干酪素蛋白酶能力較差(表2，圖1)。

表2 酵母菌株產(chǎn)利用干酪素的蛋白酶活力測定Table 2 Protease vitality of casein produced by yeast strain

圖1 篩選能利用干酪素產(chǎn)蛋白酶內(nèi)生酵母(部分)Fig.1 Screening of protease-prodcucing endophytic yeasts from casein (portion)

2.2.2 以明膠為氮源篩選功能內(nèi)生酵母菌

以明膠為氮源對33株產(chǎn)蛋白酶酵母菌篩選發(fā)現(xiàn)：33株測試菌株中有5株能分解利用明膠，對該5株酵母菌產(chǎn)酶能力分析表明，菌株J6、J25和J2-52的產(chǎn)酶能力和活性較高，以J6菌株的產(chǎn)酶能力最高，J2-245和J159菌株產(chǎn)分解利用明膠蛋白酶能力較低(表3和圖2)。

表3 酵母菌株產(chǎn)利用明膠的蛋白酶活力測定Table 3 Protease vitality of gelatin produced by yeast strain

圖2 篩選能利用明膠產(chǎn)蛋白酶內(nèi)生酵母(部分)Fig.2 Screening of protease-prodcucing endophytic yeasts from gelatin (portion)

2.2.3 以菜籽餅粕為氮源篩選功能內(nèi)生酵母

以菜籽餅粕為氮源對33株產(chǎn)蛋白酶內(nèi)生酵母篩選發(fā)現(xiàn)：其中7株能分解利用菜籽餅粕中的氮源，對其產(chǎn)酶能力分析表明，菌株J214和J3-74產(chǎn)酶能力較高，以J3-74菌株產(chǎn)酶能力最優(yōu)，J4-52、J84和J145菌株產(chǎn)分解利用菜籽餅粕蛋白酶的能力較低(表4和圖3)。

表4 酵母菌株利用菜籽餅粕的蛋白酶活力測定Table 4 Determination of protease vitality of yeast strain utilizing rapeseed meal

圖3 篩選能利用菜籽餅粕產(chǎn)蛋白酶內(nèi)生酵母(部分)Fig.3 Screening of protease-prodcucing endophytic yeasts from rapeseed cake meal (portion)

2.2.4 以黃豆粉、膠原蛋白為氮源篩選功能內(nèi)生酵母

以黃豆粉、膠原蛋白為氮源對33株產(chǎn)蛋白酶酵母菌篩選發(fā)現(xiàn)，以黃豆粉、膠原蛋白為氮源培養(yǎng)酵母的培養(yǎng)基中未長出透明圈，表明該33株酵母菌中未有可以利用這兩類氮源的菌株(圖4)。

圖4 酵母菌株在含黃豆粉、膠原蛋白培養(yǎng)基生長情況Fig.4 Growth of yeasts in medium using soybean powder and collagen as nitrogen source

2.3 高產(chǎn)蛋白酶內(nèi)生酵母菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

根據(jù)2.2的結(jié)果，對J6和J24兩株酵母進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，結(jié)果表明，J6菌株產(chǎn)蛋白酶能力隨著接種量的增加逐步降低，在接種量為1%時，蛋白酶活力最高，與接種量1%處理相比，2%和3%接種量條件下其產(chǎn)蛋白酶活力分別降低0.02%和0.05%；其產(chǎn)蛋白酶活性隨pH值的上升而增高，培養(yǎng)條件為pH 7.0與pH 9.0較pH 5.0條件下的蛋白酶活力分別增加3%和4%；以溫度為35 ℃作為對照組時，J6菌株隨著培養(yǎng)溫度的降低其產(chǎn)蛋白酶活力逐漸增加，在培養(yǎng)環(huán)境溫度為30與25 ℃下該菌株所產(chǎn)蛋白酶活力分別增加1%和2%；以葡萄糖為碳源、牛肉膏為氮源較以麥芽糖或淀粉為碳源及以干酪素或硫酸銨為氮源的條件下，J6菌株產(chǎn)蛋白酶的活力更佳(圖5)。J24菌株產(chǎn)蛋白酶能力隨著接種量的增加呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，在接種量為2%時，蛋白酶活力最高，較接種量為1%時的蛋白酶活力增加0.4%、較接種量為3%條件下的蛋白酶活力增加0.3%；其產(chǎn)蛋白酶活力隨pH值的上升而降低，培養(yǎng)條件為pH 7.0與pH 9.0較pH 5.0條件下的蛋白酶活力分別減少3%和7%；以35 ℃作為對照組，J24菌株隨著培養(yǎng)溫度的降低其產(chǎn)蛋白酶活力逐漸增加，培養(yǎng)環(huán)境溫度為30與25 ℃條件下，該菌株所產(chǎn)蛋白酶活力分別增加0.05%和1%；在以葡萄糖為碳源、牛肉膏為氮源時較以麥芽糖或淀粉為碳源及以干酪素或硫酸銨為氮源條件下，J24菌株產(chǎn)蛋白酶的活力更佳。因此，J6菌株在接種量為1%、pH為9.0、溫度為25 ℃、葡萄糖為碳源、牛肉膏為氮源時產(chǎn)蛋白酶的活力最高(圖5)。而J24菌株在接種量在2%、pH為5.0、溫度為25 ℃、葡萄糖為碳源、牛肉膏為氮源時產(chǎn)蛋白酶的活力最高。

a-接種量；b-pH;c-溫度；d-氮源；e-碳源圖5 高產(chǎn)蛋白酶內(nèi)生酵母菌株發(fā)酵條件優(yōu)化Fig.5 Optimization of fermentation conditions for protease-producing endophytic yeasts

3 結(jié)論與討論

內(nèi)生菌幾乎存在于所有植物組織中，其與植物之間存在復(fù)雜的微生態(tài)關(guān)系，是一種新的微生物資源，具有豐富的多樣性[21-22]。目前，有關(guān)內(nèi)生菌中的內(nèi)生酵母的研究鮮少，大部分都集中在對多年生木本植物的研究上，且分離出的內(nèi)生酵母極少。ZHAO[23]以30棵不同的北京油松松枝為材料，用麥芽提取物平板僅分離出3個酵母菌落；MIDDELHOVEN[24]從紅杉的嫩枝中分離出4種酵母菌種；李亞輝等[25]從枸杞中篩選出6株酵母菌。本文是首次分析糯紅高粱中產(chǎn)蛋白酶內(nèi)生菌多樣性的研究，結(jié)果顯示，分離得到的33株產(chǎn)蛋白酶內(nèi)生菌隸屬于1門、4目、13屬，優(yōu)勢目為銀耳目(Tremellales),占總數(shù)的57.62%；優(yōu)勢種屬為P.rajasthanensis，占總數(shù)的27.3%。該結(jié)果豐富了內(nèi)生酵母資源，同時也為功能菌株的開發(fā)和利用提供參考依據(jù)。

內(nèi)生菌的許多代謝物具有與其宿主產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物相似的功能，可作為新的資源來替代短缺的藥用植物并保護(hù)瀕臨滅絕的天然植物物種[26]。內(nèi)生酵母對植物生長具有顯著的影響，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，利用這些天然酵母以改善農(nóng)業(yè)和生物能源的物質(zhì)生產(chǎn)，也是植物內(nèi)生酵母的重要研究方向[12]。內(nèi)生酵母具有產(chǎn)生植物激素、抗菌活性、作為生物催化劑、生物合成等優(yōu)點(diǎn)[12-15]。因此對內(nèi)生酵母菌的功能特性研究具有重大意義。YANG等[27]從大豆中分離出了1株脂質(zhì)含量高達(dá)56%、脂肪酸甲酯含量高達(dá) 98%的可用作生產(chǎn)生物柴油的內(nèi)生菌株F.equisetiUMN-1，并對其培養(yǎng)工藝進(jìn)行了優(yōu)化，使其最高脂質(zhì)產(chǎn)量達(dá)到了3.89 g/L；JAGANNATH等[28]在斑籽根、葉、莖、花和種子中均分離出內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生纖維素酶。本研究對初篩選出的33株糯紅高粱產(chǎn)蛋白酶內(nèi)生酵母經(jīng)過不同氮源利用能力篩選發(fā)現(xiàn)，其中有7株內(nèi)生菌能產(chǎn)利用菜籽餅粕氮源的蛋白酶，J3-74菌株產(chǎn)酶能力最強(qiáng)；有5株能產(chǎn)利用明膠的蛋白酶，J6菌株產(chǎn)酶能力最優(yōu)；有7株能產(chǎn)利用干酪素的蛋白酶，J3-78菌株利用干酪素產(chǎn)蛋白酶能力最佳。該結(jié)果可為植物內(nèi)生酵母菌在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用提供參考依據(jù)，對在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，利用這些天然酵母以改善農(nóng)業(yè)和生物能源的生物質(zhì)生產(chǎn)同樣具有重要參考價值。

不同內(nèi)生菌的生境不同，其生長情況也會不同。有研究結(jié)果顯示，胰蛋白胨是菊異莖點(diǎn)霉的最適氮源[29]；葡萄糖是Phialophoramustea、Exophialasalmois、Paraphomachrysanthemicola的最優(yōu)碳源，乳糖是Cladosporiumcladosporioids的最適碳源[29]，蔗糖是Handkeautriformis的最適碳源[30]。磷酸氫二銨是Amanitacaesarea的最適氮源[31]。Umbelopsisdimorpha的最佳碳源為乳糖，最佳氮源為蛋白胨，適宜生長溫度為30 ℃，適宜生長pH為6.0～7.0[24]。因此探索不同菌株適宜培養(yǎng)條件尤為重要，可提高菌株培養(yǎng)效率。本研究對J6與J24菌株進(jìn)行了接種量、溫度、pH、碳源、氮源的生物學(xué)特性研究，優(yōu)化了該2株內(nèi)生酵母菌的培養(yǎng)條件，結(jié)果顯示，J6菌株在接種量為1%、pH為9.0、溫度為25 ℃、葡萄糖為碳源、牛肉膏為氮源時所產(chǎn)蛋白酶的活力最高。而J24菌株在接種量為2%、pH為5.0、溫度為25 ℃、葡萄糖為碳源、牛肉膏為氮源時所產(chǎn)蛋白酶的活力最高。該結(jié)果可為提高工業(yè)與農(nóng)業(yè)上生產(chǎn)特定蛋白酶效率提供理論依據(jù)。