馬浩博，游澤銳，廖曉慧，侯詩雯，陳小露，李思漫，廖秋冬,2,3，李琳,2,3，陳思謙,2,3*

1(東莞理工學院 化學工程與能源技術學院，廣東 東莞，523808)2(東莞理工科技創(chuàng)新研究院，廣東 東莞，523808) 3(東莞理工學院 中國輕工業(yè)健康食品開發(fā)與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，廣東 東莞，523808)

細菌纖維素(bacterial cellulose，BC)是一種主要由駒形氏桿菌屬(Komagataeibacter)細菌(舊稱葡糖醋桿菌屬或木醋桿菌屬)生產(chǎn)的胞外多糖[1]。在食品工業(yè)中，BC常被應用于椰果、增稠劑、食品包裝等相關產(chǎn)品[2]。BC具有與植物纖維素相同的化學組成，都是由β-1,4-糖苷鍵連接的大量葡萄糖基單元形成的高分子聚合物[3]。與主要來源于細胞壁的植物纖維素相比，BC不含半纖維素、木質(zhì)素等其他多糖雜質(zhì)，具有較高的純凈度和結(jié)晶度。高度結(jié)晶的纖維素微纖絲在氫鍵作用下形成納米級別的纖維束，相互纏繞形成多孔狀纖維網(wǎng)絡結(jié)構[4]。這種結(jié)構給BC提供了良好的持水性和黏彈性，賦予了椰果類食品產(chǎn)品多汁的特點和優(yōu)良的咀嚼性[5]。BONILLA等[6]利用流變學測試方法分析了BC凝膠的模量特性，發(fā)現(xiàn)凝膠的彈性模量主要由纖維網(wǎng)絡密度決定。也有研究發(fā)現(xiàn)，菌種和發(fā)酵條件等因素都會對纖維素凝膠流變特性產(chǎn)生較大影響，最終影響產(chǎn)品品質(zhì)[7]。

木糖駒形氏桿菌生產(chǎn)BC為好氧發(fā)酵過程，通常使用表面靜置發(fā)酵法進行生產(chǎn)[8]。補料分批發(fā)酵法是發(fā)酵工業(yè)中常用的補充發(fā)酵底物及菌種、分批獲取發(fā)酵產(chǎn)品的方法，適用于連續(xù)生產(chǎn)并提高產(chǎn)品轉(zhuǎn)化率[9]。對于以表面靜置發(fā)酵法生產(chǎn)BC，補料時加入液態(tài)培養(yǎng)基、攪動等過程可能會給發(fā)酵液施加一定剪切力，影響B(tài)C的產(chǎn)量、微觀結(jié)構、流變學特性等，進而影響產(chǎn)品品質(zhì)[10]。本研究利用表面靜置發(fā)酵法，對比了分批補料(碳源、氮源、種子液)發(fā)酵法對木糖駒形氏桿菌菌株ATCC 53582和ATCC 700178生產(chǎn)BC的影響。重點討論了木糖駒形氏桿菌在發(fā)酵過程中的碳源、氮源和菌體數(shù)目的變化，及分批補充碳源、氮源和種子液對BC凝膠產(chǎn)量、微觀結(jié)構及流變學特性的影響。以期為提高BC產(chǎn)量及保證產(chǎn)品品質(zhì)的穩(wěn)定性提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及培養(yǎng)基

木糖駒形氏菌(Komagataeibacterxylinus)ATCC 53582和ATCC 700178，美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)。文中均以保藏編號表示。

培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、Na2HPO42.7、一水合檸檬酸1.26、酵母提取物5、蛋白胨5、去離子水。使用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0，115 ℃高壓滅菌25 min冷卻至室溫后使用。

1.1.2 實驗試劑

酵母提取物、蛋白胨，賽默飛世爾科技公司；瓊脂粉，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；葡萄糖、Na2HPO4、一水合檸檬酸、濃鹽酸、NaOH、山梨酸鉀(均為分析純)，天津市大茂化學試劑廠；去離子水，實驗室制備。

1.2 儀器與設備

ME104E萬分之一分析天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；Smart-Q15去離子純水機，上海和泰儀器有限公司；PHS-3C雷磁pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；YM50立式壓力蒸汽滅菌器，上海三申醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；DNP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司；MCR702流變儀，奧地利安東帕公司；ME104E液氮罐，成都查特低溫設備有限公司；Scientz-10 ND冷凍干燥機，寧波新芝凍干設備股份有限公司；MiniFlex 600臺式X射線衍射儀，日本理學公司；Spark 96孔板酶標儀，瑞士Tecan公司；ETD-2000離子濺射儀，北京博遠微納科技有限公司；EM-30 PLUS臺式掃描電鏡，韓國庫賽姆公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 BC的培養(yǎng)條件和菌體光密度測定

木糖駒形氏菌菌株(Komagataeibacter)ATCC 53582和ATCC 700178以10%(體積分數(shù))的接種量接種于總體積為20 mL的培養(yǎng)基中。使用直徑為40 mm的圓柱形無菌塑料杯為發(fā)酵容器，以7 d為一個周期，在30 ℃下靜置培養(yǎng)4個周期，共28 d。為了比較2株菌在發(fā)酵過程中的單位菌體葡萄糖消耗和纖維素產(chǎn)量的關系，測定發(fā)酵過程1個周期內(nèi)(7 d)每天的菌體數(shù)以OD值表示。

1.3.2 BC的培養(yǎng)條件和菌體光密度測定

發(fā)酵開始后的第1、2、3、4個周期結(jié)束時(第7、14、21、28天)，分別取0.1 mL木糖駒形氏菌培養(yǎng)液于離心管中，4 000 r/min離心10 min，獲得上清液。取50 μL上清液于試管中，加入950 μL去離子水稀釋，獲得樣品。將蒸餾水、標準品、樣品與工作液加入96孔板酶標儀中。將酶標儀升溫至37 ℃，設定振蕩孔板時間為5 s，37 ℃孵育10 min。在505 nm波長下測定各孔吸光值。將吸光值代入葡萄糖標準曲線得出殘留碳源濃度，并計算第1～3周期結(jié)束時需要的碳源補料量(補充至原培養(yǎng)基碳源濃度的所需量)。

1.3.3 發(fā)酵過程培養(yǎng)基殘留氮源測定

使用考馬斯亮藍法測定。將上述獲得的1 mL上清液與1 mL去離子水混合，加入5 mL的考馬斯亮藍染色液，混勻后室溫靜置3 min。以空白溶液作為對照，于595 nm處測定吸光值。將測得的吸光度值代入蛋白質(zhì)標準曲線得出殘留氮源濃度，并計算第1～3周期結(jié)束時需要的氮源補料量(補充至原培養(yǎng)基氮源濃度的所需量)。

1.3.4 發(fā)酵過程中的分批補料

將培養(yǎng)的木糖駒形氏菌樣品根據(jù)補料次數(shù)(0～4次)分別分成4組。為了探究收獲樣品后殘留碳源和氮源是否能繼續(xù)使木糖駒形氏菌合成BC，每組樣品統(tǒng)一保持發(fā)酵4個周期(28 d)。具體的補料次數(shù)、殘留碳氮源測定時間和BC樣品收獲時間詳見表1。補料方法為在移除氣液界面已有BC凝膠后，使用移液槍，將槍頭貼緊發(fā)酵容器內(nèi)壁緩慢將補充培養(yǎng)基加入，以盡量減少新引入培養(yǎng)基產(chǎn)生的剪切力。

表1 分批補料設計及殘留碳源氮源測定時間Table 1 The design of fed batch fermentation and measurement time of residual carbon and nitrogen source

1.3.5 BC的濃度和產(chǎn)率測定

將收獲的BC凝膠使用去離子水在120 r/min的攪拌條件下水洗3～5次，直至凝膠從黃棕色變成淺白色。使用濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液于100 ℃煮沸30 min以除去殘余的培養(yǎng)基和菌體。將收獲的BC膜置于烘箱中105 ℃烘干至恒重，稱量記錄干重，定義為產(chǎn)量。進行3次平行實驗，取算術平均值和標準差。

1.3.6 BC的流變學性能測定

使用旋轉(zhuǎn)流變儀在25 ℃下，通過振蕩模式(動態(tài)模式)測量BC凝膠的流變性能。使用40 mm不銹鋼平行板，平板間距設置為與BC凝膠高度一致(根據(jù)樣品不同，范圍在1～4 mm)。振幅掃描測試：通過設定角頻率為1 rad/s，剪切應變振幅掃描范圍為0.001～10。以安東帕RheoCompass 1.2.3分析數(shù)據(jù)以確定小振幅振蕩剪切中線性黏彈區(qū)的振幅值。頻率掃描測試：將角頻率變化范圍設定為0.1～100 rad/s，應變振幅設定為0.1(軟件推薦的振幅值)以進行頻率掃描實驗，記錄彈性模量(G′)和黏性模量(G″)的值。每次試驗進行3次平行測定并取算術平均值。

1.3.7 發(fā)酵過程中的分批補料

BC微觀形貌結(jié)構使用掃描電子顯微鏡觀察。將收獲的BC凝膠使用液氮迅速凍結(jié)，然后放入-50 ℃的冷凍干燥機中凍干至恒重。將干燥好的BC凝膠從冷凍干燥機中取出后，使用小刀以垂直方向?qū)⑵淝谐杉s為3 mm×3 mm的小塊，放于離子濺射儀中噴金處理1 min。觀測電壓設置為15 kV，對于BC從不少于3個不同的隨機位置進行觀察，放大倍數(shù)設定為10 000倍。

2 結(jié)果與分析

2.1 木糖駒形氏菌ATCC 53582和ATCC 700178的菌體數(shù)目和產(chǎn)量關系

由圖1-a可見，在1個發(fā)酵周期(7 d)內(nèi)，木糖駒形氏菌的菌體從第2天進入對數(shù)生長期，在第5天時達到最高峰，而在第5～7天出現(xiàn)下降。相對的，BC在第1～3天緩慢合成，第4～5天時合成速度加快，第6～7天進入合成高峰期。在發(fā)酵第6～7天菌體數(shù)目下降時，BC產(chǎn)量卻達到最高值，可能存在2種原因。首先，根據(jù)一般規(guī)律，BC作為木糖駒形氏菌的一種次級代謝產(chǎn)物，更傾向于在菌體生長的穩(wěn)定期之后進行合成[11]；此外，先前研究表明，木糖駒形氏菌在合成BC的過程中，菌體傾向于存在于BC凝膠之中，而分布在液體培養(yǎng)基中的菌體較少[12]。因此，在發(fā)酵的第6～7天時除應該補充碳源和氮源外，也應該及時補充活力更高的新種子液以彌補液體培養(yǎng)基中菌體的損失。

圖1 發(fā)酵1個周期內(nèi)木糖駒形氏菌ATCC 53582和 ATCC 700178的OD值、BC產(chǎn)量(a) 及BC干重與OD比值(b)Fig.1 The OD value, yields of BC (a) and the ratio of BC dry weight/OD (b) produced by Komagataeibacter genus bacterial strain ATCC 53582 and ATCC 700178

經(jīng)過對比，菌株ATCC 53582的菌體生長速度和BC產(chǎn)量均高于ATCC 700178。2株菌的OD值在發(fā)酵第5天時分別為(0.091±0.015)和(0.073±0.015)，在第7天時分別下降到(0.064±0.006)和(0.030±0.003)，說明ATCC 53582菌體的整體生長情況優(yōu)于ATCC 700178。同時，在發(fā)酵第7天時，菌株ATCC 53582的BC產(chǎn)量為(0.17±0.01)g,以發(fā)酵液總體積20 mL計算，產(chǎn)率為8.5 g/L，而ATCC 700178的產(chǎn)量僅為(0.014±0.004)g,產(chǎn)率為0.7 g/L，ATCC 53582的BC產(chǎn)量約是ATCC 700178的12倍。通過計算單位OD值菌體的產(chǎn)量可以發(fā)現(xiàn)，在BC產(chǎn)量最高的發(fā)酵第7天，ATCC 53582每單位OD菌體可以合成BC約3.33 g，而ATCC 700178單位OD的BC合成能力僅為0.47 g(圖1-b)。這也與先前對于木糖駒形氏菌BC生產(chǎn)能力的研究報道結(jié)果一致[13]。ATCC 53582高產(chǎn)的原因可能與其基因組中含有比一般木糖駒形氏菌菌株多的纖維素合成酶相關基因有關[14]。因此，ATCC 53582可能更適合作為BC合成的生產(chǎn)用菌株[15]。

2.2 補料分批發(fā)酵中碳源及氮源殘留量

在不補充任何碳源和氮源時，菌株ATCC 53582和ATCC 700178培養(yǎng)基中的碳源均幾乎消耗殆盡(圖2-a)。而在補料1次后，ATCC 53582仍然可以用盡幾乎所有添加的碳源，而ATCC 700178則殘留有(1.49±0.87) g/L的碳源。但在第2、第3次補料之后，2株木糖駒形氏菌對碳源的利用率均出現(xiàn)下降。在第3次補料之后，ATCC 53582殘留有(9.42±1.03) g/L的碳源，而ATCC 700178殘留約(8.42±1.91) g/L。而ATCC 53582的殘留氮源濃度則較為穩(wěn)定，始終保持在0.03～0.05 g/L，而ATCC 700178對氮源的消耗量相對更高(圖2-b)。因此，此實驗結(jié)果證實了在1次補料后發(fā)酵底物利用效率，尤其是對碳源的利用效率較高[16]。而增加補料次數(shù)可能會造成碳源原料的浪費。

a-碳源殘留量；b-氮源殘留量圖2 不同補料次數(shù)后培養(yǎng)基中碳源及氮源殘留量Fig.2 The residual of carbon and nitrogen source in the medium after different number of batch-fed

2.3 補料分批發(fā)酵對BC產(chǎn)量的影響

圖3展示了2株木糖駒形氏菌通過補料分批發(fā)酵法生產(chǎn)的不同批次BC的產(chǎn)量(以干重記)。菌株ATCC 53582在補料3次后生產(chǎn)的BC總產(chǎn)量為(0.34±0.032)g,3次補料后以發(fā)酵液總體積26 mL計算，產(chǎn)率為13.08 g/L，對比補料0次時的產(chǎn)量(0.17±0.018)g,0次補料發(fā)酵液總體積20 mL，產(chǎn)率8.5 g/L總產(chǎn)量增加了約1倍(圖3-a)。而ATCC 700178通過補料后產(chǎn)量增加得更多，從0次補料時產(chǎn)量(0.016±0.002)g，即產(chǎn)率0.8 g/L，增長到3次補料的(0.11±0.048)g，即產(chǎn)率4.23 g/L，總產(chǎn)量約增長了5.9倍(圖3-b)。因此，分批補料法可以顯著增加BC產(chǎn)量。但先前結(jié)果發(fā)現(xiàn)3次補料后的培養(yǎng)基中殘留了大量未被利用的碳源[17]，因此應該綜合考慮碳源成本和BC產(chǎn)量以確定所需最優(yōu)工藝條件。

a-菌株ATCC 53582；b-菌株ATCC 700178圖3 分批補料生產(chǎn)BC總產(chǎn)量和分批收獲BC產(chǎn)量Fig.3 The total yields of BC and the BC harvested in each batch in fed batch fermentation

此外，在每次補料后1個周期發(fā)酵結(jié)束后收獲的BC產(chǎn)量有所差異。ATCC 53582的產(chǎn)量隨補料次數(shù)增加而分批收獲的BC干重逐漸減少，從0次補料的0.17 g(產(chǎn)率8.5 g/L)下降到第3次補料后的0.043 g(產(chǎn)率1.65 g/L)。而ATCC 700178在補料后分批收獲的BC干重出現(xiàn)逐漸增加的趨勢，從0次補料的0.016 g(產(chǎn)率0.8 g/L)增加到第3次補料后的0.043 g(產(chǎn)率1.65 g/L)。此結(jié)果說明ATCC 700178可能更適合以補料分批發(fā)酵法的培養(yǎng)基環(huán)境。據(jù)報道，菌株ATCC 700178是在振蕩培養(yǎng)環(huán)境下篩選出的耐高剪切力菌株，因此可以適應補料時產(chǎn)生的剪切力而合成更高產(chǎn)量的BC[18]。但ATCC 53582更適宜在靜置環(huán)境下合成BC[19]，因而在補料時引入的高剪切力可能會對其BC合成能力造成一定影響[20]。此外，在收獲BC后，殘留的培養(yǎng)基和菌體仍可以合成一部分BC，但總體產(chǎn)量非常低(<0.001 g)因此對培養(yǎng)基補充氮源、碳源和種子液是實現(xiàn)連續(xù)生產(chǎn)的必須手段。

2.4 補料分批發(fā)酵對BC凝膠流變性能的影響

為了研究補料分批發(fā)酵法對BC凝膠流變學特性的影響，使用小振幅振蕩剪切試驗，通過剪切頻率掃描測定了發(fā)酵中不同菌株及批次收獲的BC凝膠的黏彈特性[21]。由圖4可見，菌株ATCC 53582和ATCC 700178生產(chǎn)的BC凝膠都為彈性(儲能)模量G′大于黏性(損耗)模量G″的凝膠體，與先前報道一致[22]。其G′與G″在0.1～100 rad/s的角頻率范圍內(nèi)呈幾乎平行的關系，說明是彈性特征較強的膠體[23]。由ATCC 53582生產(chǎn)的BC凝膠的凝膠強度總體高于ATCC 700178生產(chǎn)的BC凝膠。在角頻率100 rad/s時，通過0次補料，由ATCC 53582生產(chǎn)的BC凝膠(A組，圖4-a)具有最高的彈性模量(12 825±3 980)Pa，而通過0次補料，由ATCC 700178生產(chǎn)的BC凝膠的彈性模量最低(936±266)Pa。BC凝膠的彈性模量主要由振蕩剪切時纖維的交聯(lián)數(shù)量決定[24]，因此ATCC 53582生產(chǎn)的凝膠可能具有更高的纖維密度，這也與其擁有較高的干重一致。此外，同一菌種在不同補料批次中收獲的BC凝膠的凝膠強度存在一定差異[25]，因此，利用補料分批發(fā)酵法獲取具有不同彈性模量的BC凝膠是一種可行的手段。

a-菌株ATCC 53582；b-菌株ATCC 700178圖4 補料分批發(fā)酵生產(chǎn)BC凝膠在頻率掃描測試中的 彈性模量G′與黏性模量G″Fig.4 Elastic modulus (G′) and viscous modulus (G″) in the frequency sweep of BC gels produced in the fed batch fermentation

2.5 補料分批發(fā)酵對BC微觀結(jié)構的影響

由圖5可知，不同菌株和補料批次中生產(chǎn)的BC都展現(xiàn)出明顯的無規(guī)則纖維網(wǎng)絡結(jié)構[26]。纖維的直徑分布在1 nm～1 μm，與先前報道一致[27]。

a-53582 A組;b-53582 B組;c-53582 C組;d-53582 D組;e-700178 A組;f-700178 B組;g-700178 C組;h-700178 D組圖5 補料分批發(fā)酵法生產(chǎn)BC的微觀結(jié)構(×10 000倍)Fig.5 Microstructure of BC produced in fed batch fermentation (×10 000)

以ATCC 53582為發(fā)酵菌株，通過0次補料收獲的BC樣品(圖5-a)的纖維網(wǎng)絡密度最高，孔徑最小[28]。而由ATCC 700178為發(fā)酵菌株，通過0次和1次補料收獲的BC(圖5-e、5-f)纖維纏繞成較粗的纖維束，且平均孔徑較大，密度較小。先前研究發(fā)現(xiàn)，這樣的大孔徑結(jié)構減少了BC凝膠在液體培養(yǎng)基中的浮力，不利于BC凝膠的進一步合成[29]。而隨著補料次數(shù)的增加，補料2次和3次的ATCC 700178菌株生產(chǎn)的BC網(wǎng)絡變得更加致密。這也與先前的產(chǎn)量結(jié)果和流變特性結(jié)果一致，高纖維密度的BC樣品在流變測試中表現(xiàn)出更高的彈性模量[30]。因此，補料分批發(fā)酵法可以顯著增加ATCC 700178的BC網(wǎng)絡密度和凝膠強度，但對ATCC 53582生產(chǎn)的BC凝膠影響有限。

3 結(jié)論與討論

研究考察了2株木糖駒形氏菌ATCC 53582和ATCC 700178在補料分批發(fā)酵法生產(chǎn)中的碳源氮源利用率、BC產(chǎn)量、結(jié)構及流變學特性。結(jié)果表明ATCC 53582的單位OD菌株生產(chǎn)效率遠高于ATCC 700178，BC在發(fā)酵第7天左右進入高峰期，但菌體數(shù)出現(xiàn)下降。在發(fā)酵第7天時補充碳源、氮源和種子液時，可以使發(fā)酵繼續(xù)進行，菌株ATCC 53582和ATCC 700178經(jīng)3次補料后生產(chǎn)的BC總干重分別為0.34和0.11 g，對比單次發(fā)酵總產(chǎn)量增加顯著，但第3次補料后殘留的碳源較多，無法被細菌充分利用。相比ATCC 53582，菌株ATCC 700178表現(xiàn)出更加適合補料分批發(fā)酵的特性，生成的BC產(chǎn)量隨補料次數(shù)增加而增加。BC凝膠為彈性特性為主的強凝膠，由多孔狀的納米纖維網(wǎng)絡構成。補料分批發(fā)酵法對BC凝膠的流變學特性影響較小。本研究為連續(xù)生產(chǎn)品質(zhì)穩(wěn)定的BC凝膠產(chǎn)品提供了經(jīng)驗和方法。