王雅琪，凡林林，李文瑤，李弘軒，杜麗平,2，王洪，馬立娟,2*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)2(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300457) 3(中國輕工業(yè)濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓，644000)

脂肪酶(EC3.1.1.3)可以催化長鏈?；视驮谥|(zhì)-水界面分解為二酰基甘油酯、單甘油酯、甘油和游離脂肪酸[1-2]。目前研究發(fā)現(xiàn)脂肪酶還可以催化酯合成、酰胺化、醇解、酯交換等一系列反應(yīng)[3]，在食品工業(yè)、紙漿工業(yè)、化妝品行業(yè)以及精細(xì)化學(xué)品加工中有著廣泛的應(yīng)用。

近年來，真菌脂肪酶得到了廣泛關(guān)注，已有不少真菌脂肪酶如來源于南極假絲酵母的脂肪酶B(Novozyme 435)和來源于米黑根毛霉的脂肪酶(Novozyme Lipozyme RMIM)等實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化，并被應(yīng)用于食品釀造行業(yè)中[4]。例如，王丹丹等[5]研究了Novozym 435在兩相體系中合成白酒中四大酯類物質(zhì)的能力，結(jié)果表明己酸乙酯在有機(jī)相合成轉(zhuǎn)化率最高，丁酸乙酯在水相合成轉(zhuǎn)化率最高。絲狀真菌黑曲霉因其獨(dú)特的食品安全特性和優(yōu)良的蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)和修飾能力，已成為食品酶生產(chǎn)的重要宿主之一[6]。2007年，黑曲霉CBS513.88基因組被完全解析并公布[7]，生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)其基因組中存在大量編碼脂肪酶基因的開放閱讀框。此后，黑曲霉脂肪酶得到了廣泛的關(guān)注。2009年，SHU等[8-9]首次克隆得到黑曲霉F044脂肪酶基因并實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌和畢赤酵母中的異源表達(dá)。2020年，XING等[10]克隆黑曲霉胞外脂肪酶基因EXANL1在畢赤酵母中異源表達(dá)，研究了其結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。研究表明，黑曲霉脂肪酶種類繁多且其三維結(jié)構(gòu)和催化特性也有著顯著的差異[11-13]，因此，研究不同類型黑曲霉脂肪酶的催化特性對其在食品工業(yè)中的應(yīng)用具有非常重要的指導(dǎo)意義。

脂肪酸乙酯是白酒中重要的風(fēng)味化合物[14]，白酒中脂肪酸乙酯的合成主要依賴于羧酸水解酶家族、脂肪酶、酯酶和角質(zhì)酶[15]。目前，關(guān)于脂肪酶催化酯化反應(yīng)的研究主要集中在有機(jī)相體系中進(jìn)行[16]，其中少數(shù)酶在水相條件下可以催化酯的合成[17]。2020年，XU等[18]報(bào)道了一種來源于Monascuspurpureus的羧酸酯酶在水相體系中催化脂肪酸乙酯的合成。本實(shí)驗(yàn)室早期的研究中發(fā)現(xiàn)黑曲霉可以顯著提高白酒中脂肪酸乙酯的含量，因此對黑曲霉進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，本研究根據(jù)黑曲霉基因組注釋，從中挑選出一個轉(zhuǎn)錄水平較高的脂肪酶基因LipA進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，成熟的脂肪酶Lip A由279個氨基酸組成，之后對該酶的酶學(xué)性質(zhì)和酯化特性進(jìn)行深入研究，為其在食品工業(yè)中得到有效應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌株

EscherichiacoliDH5α、EscherichiacoliRosetta(DE3)、質(zhì)粒pET-28a(+)，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶，大連寶生物工程有限公司；2×TaqMaster Mix DNA聚合酶、同源重組酶、質(zhì)粒提取試劑盒，Vazyme公司；IPTG、卡那霉素、氯霉素、Bradford蛋白濃度測定試劑盒，Solarbio公司；Ni柱、PD-10脫鹽柱，GE公司；10 kDa超濾管，Millipore公司；對硝基苯酚丁酸酯等系列底物，Sigma公司；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純，天津市江天化工技術(shù)有限公司。

1.3 重組菌株的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中脂肪酶的氨基酸序列，將黑曲霉脂肪酶成熟蛋白編碼序列(去掉信號肽及內(nèi)含子)進(jìn)行合成并根據(jù)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行密碼子優(yōu)化。將合成后的片段以上、下游引物5′-TAAGAAGGAGATATACCATGGCGCCGACCCCGCTGGATG-3′和5′-ACGGAGCTCGAATTCGGATCCTTAATGATGATGATGATGATGCAGC-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增后通過同源重組與載體pET-28a(+)連接，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α中，提取質(zhì)粒并測序驗(yàn)證成功后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliRosetta(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將重組菌株在37 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG溶液，在25 ℃、220 r/min條件下誘導(dǎo)發(fā)酵20 h后，離心收集菌體，使用pH 7.4 PBS洗滌菌體后重懸菌體。使用高壓均質(zhì)機(jī)破碎菌體收集上清液即為粗酶液，將粗酶液經(jīng)Ni柱進(jìn)行洗脫，洗脫后的重組蛋白使用PD-10和超濾管去除咪唑分子，蛋白質(zhì)濃度測定使用Bradford試劑盒測定。

1.4 脂肪酶Lip A的酶活力測定及氣相檢測

1.4.1 脂肪酶活力測定

參照文獻(xiàn)[19]的方法進(jìn)行。500 μL反應(yīng)體系中包括400 μL的Tris-HCl緩沖液(20 mmol/L、pH 8.0)、50 μL的pNPB(10 mmol/L)和50 μL酶液，37 ℃下反應(yīng)5 min，500 μL無水乙醇終止反應(yīng)，410 nm下測量吸光度值。酶活力定義：在一定溫度和pH下，1 min內(nèi)催化生成1 μmol對硝基苯酚所需要的酶量定義為一個活力單位(U)。

1.4.2 氣相色譜的檢測

氣相色譜檢測條件：色譜柱為HP-INNOWax(30 m×0.32 mm×0.5 μm)，檢測器為氫火焰離子化檢測器(flame ionization detector, FID)。進(jìn)樣器溫度260 ℃，進(jìn)樣量1.0 μL，檢測器溫度300 ℃。柱溫在65 ℃保持5 min，以5 ℃/min上升到150 ℃，保持2 min，共24 min。載氣N2，色譜柱流速0.8 mL/min。

1.5 脂肪酶Lip A的生化特性分析

按照1.4.1的方法，對脂肪酶進(jìn)行生化特性分析，每個反應(yīng)平行3次，以最高酶活力定義為100%，計(jì)算相對酶活力。

(1)最適溫度和熱穩(wěn)定性

在不同溫度(20～70 ℃)測定重組脂肪酶的酶活力，將酶液分別放置在不同溫度(40～70 ℃)保溫，間隔2 h取樣，以未經(jīng)處理的酶的酶活力定義為100%，測定殘余酶活力。

(2)最適pH和pH穩(wěn)定性

在不同pH條件下(pH 5.0～11.0)測定重組脂肪酶的酶活力，將酶液分別置于pH 4.0～10.0的不同緩沖液中，于4 ℃放置1 h后，測定殘留酶活力。所用緩沖液為：20 mmol/L Na3PO4緩沖液(pH 4.0～6.0)、20 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 6.0～7.0)、20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0～9.0)、20 mmol/L甘氨酸-KOH緩沖液(pH 9.0～11.0)。

(3)金屬離子和螯合劑對酶活力的影響

在反應(yīng)體系中加入不同金屬離子(Co2+、Cu2+、Fe3+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Li2+)和金屬螯合劑至終濃度為1和10 mmol/L，以未處理酶的酶活力為100%，計(jì)算相對酶活力。

(4)有機(jī)試劑耐受性

將酶液與有機(jī)試劑按照9∶1(體積比)混合均勻后，置于4 ℃放置1 h后，對照組使用緩沖液代替有機(jī)試劑，以未處理酶的酶活力為100%，計(jì)算相對酶活力。

(5)底物特異性及動力學(xué)參數(shù)測定

分別配制10 mmol/L不同碳鏈長度的對硝基苯酚酯(p-nitrophenyl,pNP)為底物，測量脂肪酶的酶活力。使用異丙醇配制不同濃度的底物，測定脂肪酶在不同濃度下的酶活力，利用Graphpad Prime 7.0 軟件中的Michaelis-Menten方程擬合得到不同底物的動力學(xué)參數(shù)[20]。

1.6 脂肪酶Lip A酯化乳酸乙酯特性分析

參考文獻(xiàn)[21-22]的方法，乳酸和乙醇濃度分別為0.3和1.2 mol/L，溶劑為PBS，反應(yīng)體系為5 mL，酶10 mg，40 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，反應(yīng)時間12 h。同時以高溫滅活的脂肪酶Lip A作空白對照離心，取上清液。留作氣相分析。

(1)溫度對酯化反應(yīng)的影響

低溫下脂肪酶無法發(fā)揮應(yīng)有的催化活性，溫度過高又會使脂肪酶變性而無法進(jìn)行催化反應(yīng)，因此找到合適的催化溫度會大大提高乳酸乙酯合成量，按照上述的反應(yīng)體系，反應(yīng)溫度在30、40、50、60 ℃操作，計(jì)算催化乳酸乙酯生成量。

(2)反應(yīng)體系中酸醇物質(zhì)的量比對酯化反應(yīng)的影響

因?yàn)槿樗岬某杀靖哂谝掖迹瑫r乳酸的電離系數(shù)高，含量過多會使整個體系的pH急劇下降，因此固定乳酸含量，改變乙醇的含量探究酸醇比對酯化反應(yīng)的影響。按照上述的反應(yīng)體系，酸醇物質(zhì)的量比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4，計(jì)算催化乳酸乙酯生成量。

1.7 脂肪酶生物信息學(xué)分析

使用The Lipase Engineering Database(LED，http://www.led.uni-stuttgart.de/)BLAST查詢與脂肪酶Lip A親緣性較近的蛋白序列，使用MEGA 7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，采用鄰域連接法(neighbor-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 黑曲霉脂肪酶Lip A表達(dá)菌株的構(gòu)建及其表達(dá)純化

構(gòu)建質(zhì)粒pET-28a(+)-LipA的結(jié)果如圖1-a所示，重組質(zhì)粒提取驗(yàn)證如圖1-b所示，重組質(zhì)粒大小為6 127 bp。重組菌經(jīng)誘導(dǎo)、菌體破碎以及Ni柱純化后SDS-PAGE結(jié)果如圖1-c所示，目的蛋白條帶在大約27 kDa處出現(xiàn)，蛋白的分子質(zhì)量大小與理論值一致，采用PD-10去除咪唑小分子，測定純化后的脂肪酶Lip A測定比酶活力為58.31 U/mg，超濾后的脂肪酶Lip A比酶活力為132.4 U/mg，純化倍數(shù)為2.27倍。

a-表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-LipA圖譜；b-重組質(zhì)粒(M-Marker； 1-重組質(zhì)粒6 127 bp)；c-SDS-PAGE分析(M-Protein Marker； 1-重組脂肪酶粗酶液；2-純化流穿液；3-高鹽洗脫液； 4-純化后樣品)圖1 脂肪酶Lip A表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果分析Fig.1 Construction and induced expression of lipase Lip A

2.2 黑曲霉脂肪酶Lip A的生化性質(zhì)解析

2.2.1 溫度與pH對脂肪酶Lip A的影響

如圖2-a所示，脂肪酶Lip A最適溫度為50 ℃，且在40～60 ℃下孵育8 h后殘余酶活力均在60%以上(圖2-b)，隨著時間延長，重組酶活力出現(xiàn)顯著下降。當(dāng)孵育溫度升高至70 ℃時，酶活力下降較快，8 h后其殘余酶活力僅為40%左右(圖2-b)，此時酶的構(gòu)象在高溫下已經(jīng)被破壞，導(dǎo)致酶的不可逆變性[23]。

a-最適反應(yīng)溫度；b-溫度穩(wěn)定性；c-最適反應(yīng)pH；d-pH穩(wěn)定性圖2 溫度和pH對脂肪酶Lip A活性的影響Fig.2 Effect of temperature and pH on the activity of lipase Lip A

如圖2-c所示,脂肪酶Lip A的最適pH為8.0，在pH 6.0～8.0，酶活力保持在70%以上，具有較寬泛的pH適用范圍，當(dāng)pH>10后，酶活力驟降，表明該酶不適應(yīng)在極端堿性條件下使用。如圖2-d所示，在pH 4.0的環(huán)境下孵育1 h后，重組酶剩余酶活力依然可以保持在60%左右，在pH 5.0出現(xiàn)降低是由于脂肪酶Lip A的等電點(diǎn)在這一范圍，該酶在酸性及弱堿性條件下具有較好的穩(wěn)定性可能取決于蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，環(huán)境pH的變化會影響蛋白質(zhì)中三維結(jié)構(gòu)中離子鍵的改變，從而導(dǎo)致酶的構(gòu)象發(fā)生變化[24]。

2.2.2 金屬離子對脂肪酶Lip A的影響

如表1所示，在1 mmol/L金屬離子條件下，Ca2+和Mg2+對脂肪酶Lip A具有促進(jìn)作用，其他金屬離子則有不同程度的抑制作用。在10 mmol/L金屬離子條件下，Ca2+對于脂肪酶Lip A的促進(jìn)作用更加明顯，相較于對照提高了55%。而高濃度的Mg2+對脂肪酶Lip A的酶活力卻由低濃度時的促進(jìn)作用轉(zhuǎn)變?yōu)橐种谱饔?，其他金屬離子對酶活力的抑制作用也進(jìn)一步增強(qiáng)，其中Cu2+、Fe3+等最為明顯，重金屬離子作為親電試劑可能與脂肪酶中的氨基酸殘基發(fā)生電荷相互作用，改變其構(gòu)象，從而使脂肪酶變性[25]。

表1 金屬離子及螯合劑對脂肪酶Lip A活性的影響 單位：%

2.2.3 有機(jī)試劑對脂肪酶Lip A的影響

對照組用PBS替代有機(jī)溶劑，實(shí)驗(yàn)組中酶液與有機(jī)溶劑按照9∶1(體積比)混合。如圖3所示，正庚烷、正己烷明顯提高了脂肪酶Lip A的催化活性，正庚烷對該酶活性提高50%左右；醇對脂肪酶Lip A的酶活力基本無明顯影響，其他有機(jī)溶劑則呈現(xiàn)出不同的抑制作用。脂肪酶的結(jié)構(gòu)通常由疏水的催化核心和親水的表面構(gòu)成，其催化活性需要一定極性的溶劑來維持，正庚烷和己烷作為極性溶劑使得蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，底物更容易進(jìn)入催化口袋進(jìn)行催化反應(yīng)[26]，然而大多數(shù)有機(jī)溶劑則會削弱蛋白質(zhì)的疏水鍵，使酶分子內(nèi)部斥力增加，造成蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)延展，最終導(dǎo)致脂肪酶喪失催化活性[27]。由此可見，脂肪酶Lip A可以耐受有機(jī)相的環(huán)境，為其在有機(jī)相中應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

圖3 有機(jī)試劑對脂肪酶Lip A活性的影響Fig.3 Effect of organic solvents on the activity of lipase Lip A

2.2.4 脂肪酶Lip A底物特異性分析

由圖4可見，脂肪酶Lip A作用于對硝基苯酚乙酸酯(pNP-C2)的水解活性最高，作用于對硝基苯酚月桂酸酯(pNP-C12)和對硝基苯酚棕櫚酸酯(pNP-C16)的水解活性分別為作用于pNP-C2水解活性的23.04%和9.71%，可見，脂肪酶Lip A偏好于水解中短鏈對硝基苯酚酯，對長鏈底物表現(xiàn)出較低的水解活性。

圖4 脂肪酶Lip A的底物特異性Fig.4 Substrate specificity of lipase Lip A

米氏常數(shù)Km代表酶與底物的親和力，Km越小表明酶與底物的親和力最強(qiáng)，以pNP-C2為底物時，該酶的Km為(0.228±0.05) mmol/L(表2)，表明pNP-C2為脂肪酶Lip A的最佳底物，脂肪酶Lip A對C2～C8的對硝基苯酚酯等具有較高水解酶活性，表明該酶更可能為羧酸酯酶，而不是真正的脂肪酶[28-29]。

表2 脂肪酶Lip A動力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of lipase Lip A

2.3 脂肪酶Lip A酯化特性分析

脂肪酶Lip A催化脂肪酸乙酯的研究中發(fā)現(xiàn)，脂肪酶Lip A在水相條件下可以催化乳酸和乙醇合成乳酸乙酯。溫度對其催化乳酸和乙醇合成乳酸乙酯的影響結(jié)果如圖5-a所示，50 ℃時脂肪酶催化乳酸乙酯合成含量最高，為40.81 mg/L，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明脂肪酶Lip A在較低溫度下無法最大程度發(fā)揮催化活性，而較高的溫度又會使酶失活，使其蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆性損傷[23]。由圖5-b可知，隨著乙醇濃度的增加，乳酸乙酯生成量逐漸降低，說明乙醇作為一種短鏈醇，同時也作為酶的失活劑，高濃度的乙醇會破壞酶的三維構(gòu)象，并最終導(dǎo)致酶的催化效率降低。

a-最佳反應(yīng)溫度；b-最佳酸醇物質(zhì)的量比圖5 脂肪酶Lip A催化合成乳酸乙酯的最佳反應(yīng) 溫度和最佳酸醇物質(zhì)的是比Fig.5 Optimum reaction temperature and substrate molar ratio for the synthesis of ethyl lactate by lipase Lip A

2.4 脂肪酶Lip A系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

蛋白序列相似性分析是蛋白質(zhì)研究過程中不可或缺的一步，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹可以快速準(zhǔn)確地概括不同生物體間的親緣關(guān)系，進(jìn)而反映進(jìn)化關(guān)系[30]。本研究中利用LED數(shù)據(jù)庫比對脂肪酶Lip A編碼的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)該酶屬于abH23同源家族[29]，abH23同源家族中包含大量不同來源的脂肪酶序列，它們被劃分為4個組(圖6)，脂肪酶Lip A被劃分到Rhizomucormihei組，該酶與來源于米曲霉的二酰基甘油酯酶(BAA12912.1)和來源于粗糙脈孢菌的三?；视王ッ?EAA32130.1)同屬于一個進(jìn)化分支，表明它們有共同的祖先，并且可能在某些催化特性方面具有相似的性質(zhì)。

圖6 脂肪酶Lip A與abH23同源家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of lipase Lip A and abH23 homologous family

3 結(jié)論

本論文成功克隆表達(dá)了來源于黑曲霉CBS513.88中具有潛在脂肪酶催化特性的Lip A蛋白，該酶的蛋白分子質(zhì)量約為27 kDa。酶學(xué)性質(zhì)分析表明，脂肪酶Lip A的最適溫度和pH分別為50 ℃和8.0，且在40～60 ℃和pH 5.0～8.0有較好的穩(wěn)定性。該酶對有機(jī)試劑有較好的耐受性，Ca2+、Mg2+、正庚烷和正己烷對脂肪酶Lip A的水解活性有促進(jìn)作用，該酶對不同長度碳鏈底物均表現(xiàn)出活性，動力學(xué)參數(shù)表明其作用于對硝基苯酚乙酸酯時催化活性最高。序列相似性分析結(jié)果表明脂肪酶Lip A為abH23同源家族Rhizomucormihei脂肪酶中的一員。此外，該酶可以在水相介質(zhì)催化乳酸乙酯的合成，這一特性使其在食品加工與釀酒工業(yè)中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。