何羽茜 柏 妮 王余德 俞 健 劉永樂 王發(fā)祥

(1. 長沙理工大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，湖南 長沙 410114；2. 湖南省水生資源食品加工工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410114；3. 湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南 長沙 410081)

魚糜是魚肉經(jīng)過一定工序制得的魚肉制品[1]。傳統(tǒng)魚糜加工需要通過漂洗工序濃縮魚肌纖維蛋白，除去魚肉中的脂肪、血液和色素等，增強魚糜的凝膠強度和感官質(zhì)量。但漂洗過程會產(chǎn)生水的消耗和廢物處理等問題，還會降低魚糜營養(yǎng)和風(fēng)味物質(zhì)[2]。因此，研究開發(fā)不漂洗魚糜近年來逐漸成為熱點，但目前其加工技術(shù)在基礎(chǔ)理論研究和實際應(yīng)用中仍存在諸多問題，如凝膠形成能力較差、貯藏過程中易品質(zhì)劣變等[3]。

冷凍保藏是目前最常用的食品貯藏方法之一，被廣泛應(yīng)用于肉、禽、水產(chǎn)等易腐食品的生產(chǎn)、運輸和貯藏。魚糜加工成型后一般需要迅速凍結(jié)，然后在冷凍條件下貯藏一段時間，在凍結(jié)和長期凍藏過程中，冰晶的形成和冷凍濃縮效應(yīng)導(dǎo)致肌原纖維蛋白變性和組織損傷，魚糜的凝膠特性和質(zhì)量逐漸下降[4-5]。為最大程度保持魚糜產(chǎn)品的質(zhì)量，延長保質(zhì)期，除添加高效抗凍劑外，各類速凍技術(shù)也應(yīng)運而生[6]。浸漬式冷凍是指冷凍物料與液體載冷劑接觸，換熱后物料迅速降溫及凍結(jié)，是一種新型高效的冷凍技術(shù)，相對于傳統(tǒng)的板式冷凍和空氣冷凍，具有冷凍速率快、能耗低、凍品品質(zhì)高等優(yōu)點[7]。Qian等[8]利用浸漬冷凍處理鳙魚樣品，發(fā)現(xiàn)其組織纖維的結(jié)構(gòu)完整性比空氣冷凍處理組更好；Yang等[9]研究發(fā)現(xiàn)河豚魚片浸漬冷凍的凍結(jié)速度是空氣冷凍的4.17倍，且形成的冰晶更小更均勻。盡管研究表明凍結(jié)過程對食品質(zhì)量的損害更大[10]，但凍藏過程中環(huán)境溫度的波動也會使蛋白質(zhì)發(fā)生變性、聚集與功能特性喪失[3,11]，嚴(yán)重影響魚糜的質(zhì)地和凝膠性能，因為溫度波動會導(dǎo)致冰晶重結(jié)晶[12-13]，對組織會造成更大的機(jī)械損傷[14]，同時加速魚糜中蛋白質(zhì)變性、氧化和脂肪氧化等不良生化反應(yīng)[15]。因此，除了提高凍結(jié)速率，減少凍藏過程中的溫度波動也是改善魚糜貯藏過程中品質(zhì)劣變的關(guān)鍵。

浸漬冷凍以液體為載冷介質(zhì)，傳熱效率是傳統(tǒng)空氣凍結(jié)的20倍以上，能夠快速吸收食品內(nèi)部的熱量，到達(dá)速凍的效果[16]。然而，目前對浸漬冷凍技術(shù)的研究和應(yīng)用基本集中在凍結(jié)環(huán)節(jié)，而對于浸漬凍藏過程則很少涉及。相對于傳統(tǒng)魚糜，不漂洗鰱魚魚糜中含有較多的水溶性蛋白質(zhì)(酶)、不飽和脂肪酸及金屬離子等，在凍藏過程中更容易發(fā)生氧化、降解等生化變化，但目前關(guān)于浸漬凍藏對不漂洗魚糜品質(zhì)變化影響的研究還十分匱乏。研究擬通過比較分析浸漬凍藏和空氣凍藏60 d期間不漂洗鰱魚魚糜凝膠特性、蛋白質(zhì)和脂肪氧化等品質(zhì)指標(biāo)的變化規(guī)律，揭示浸漬凍藏技術(shù)對提升魚糜凍藏穩(wěn)定性的作用，為開發(fā)新型水產(chǎn)品冷鏈物流技術(shù)提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮鰱魚：每尾重(2.0±0.2) kg，市售；

氯化鈉、三氯乙酸(TCA)、沒食子酸丙酯(PG)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、2，4-二硝基苯肼(DNPH)、2-硫代巴比妥酸(TBA)及其他試劑：國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

斬拌機(jī)：ZB-20型，山東省諸城市華鋼機(jī)械有限公司；

電熱偶測溫記錄儀：YET-620L型，興華市蘇瑪電器儀表有限公司；

熱電偶：KPS-T-1000-SMPW-G 開普森T型，泰州眾投貿(mào)易有限公司；

掃描電鏡：JEOL JSM 5900LV型，日本日立公司；

質(zhì)構(gòu)儀：TA·XTplus型，英國Stable Micro System 公司；

臺式低速離心機(jī)：LD5-10型，北京京立離心機(jī)有限公司；

恒溫?fù)u床：HZQ-X100型，常州諾基儀器有限公司；

紫外分光光度計：TU-1901型，北京普析通用儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 不漂洗鰱魚魚糜及魚糜凝膠的制備 參考李婷等[17]的方法，將新鮮鰱魚宰殺后采背部肌肉，放入斬拌機(jī)中于0～4 ℃下預(yù)斬1 min，按每100 g魚肉加入2.5 g食鹽繼續(xù)斬拌5 min，即為生魚糜樣品。將生魚糜分裝于若干帶蓋塑料盒中(每盒23 g)并用包裝袋密封(以確保過冷液不與魚糜直接接觸)，然后等分成兩部分，第一部分直接置于(-20±2) ℃冰箱凍藏，另一部分先浸入過冷液[280 g/L的CaCl2溶液，提前24 h置于(-20±2) ℃的冰箱中預(yù)凍備用]中，再置于和第一部分相同的冰箱凍藏(凍藏期間樣品一直浸入過冷液中)，分別在凍藏第0，1，7，15，30和60天取出，于4 ℃解凍12 h進(jìn)行后續(xù)試驗。

稱取上述凍藏不同時間的生魚糜樣品約10 g置于15 mL塑料離心管(Φ17 mm×120 mm)中，于4 ℃、6 000 r/min 離心10 min后，40 ℃預(yù)加熱30 min，再90 ℃ 加熱30 min制得魚糜凝膠，于冰水中冷卻20 min后保存于4 ℃冰箱待測。

1.2.2 魚糜樣品中心溫度監(jiān)控 魚糜樣品凍結(jié)和凍藏期間的溫度變化監(jiān)測參考Diao等[7]的方法稍作修改。將外徑尺寸為2 mm×0.5 mm的熱電偶插入魚糜樣品中心并連接測溫記錄儀，實時監(jiān)測魚糜樣品中心溫度。魚糜樣品凍結(jié)曲線的采樣率為10 s/個，測量至兩組魚糜樣品中心溫度均達(dá)到-20 ℃并平衡1 h左右后停止；魚糜樣品凍藏期間溫度波動的采樣率為60 s/個，測量24 h后停止。

1.2.3 凝膠強度的測定 魚糜凝膠從冰箱取出，室溫下平衡30 min后切成高2.5 cm的圓柱體。參考王嵬等[18]的方法使用配置球形探頭P/5S的質(zhì)構(gòu)儀測定其破斷力(N)和破斷距離(cm)，兩者之積即為凝膠強度(N·cm)。質(zhì)構(gòu)儀設(shè)定為壓縮距離測定模式，參數(shù)設(shè)置：測前、測中、測后速度分別為1.00，1.10，10.00 mm/s，壓縮距離為15.000 mm，觸發(fā)力為0.1 N。

1.2.4 持水力的測定 參考胡曼子等[19]的方法并稍作修改。將魚糜凝膠切成5 mm厚的薄片，準(zhǔn)確稱重，用兩層濾紙包裹樣品于50 mL離心管中，4 ℃、3 000 r/min離心20 min，根據(jù)離心前后樣品質(zhì)量計算魚糜凝膠的持水力。

1.2.5 魚糜Ca2+-ATPase活性和羰基含量測定

(1) 魚糜蛋白樣品制備：參考Li等[20]的方法，稱取2 g 解凍后生魚糜樣品，加入40 mL磷酸緩沖液(pH為7.0，含0.5 mol/L NaCl和15.6 mmol/L NaH2PO4)，充分勻漿后于4 ℃靜置提取1 h，4 ℃、6 000 r/min離心10 min，上清液即為魚糜蛋白質(zhì)提取液，以福林酚試劑法測定其蛋白含量，將其質(zhì)量濃度調(diào)整為1.0 g/L進(jìn)行Ca2+-ATPase活性和羰基含量測定。

(2) Ca2+-ATPase活性測定：參考Benjakul等[21]和Li等[20]的方法，取2 mL的魚糜蛋白樣品與0.5 mL Tris-HCl緩沖液(0.5 mol/L，pH 7.0)，8 mL CaCl2溶液(10 mmol/L)和0.5 mL ATP(20 mmol/L，pH 7.0)反應(yīng)8 min；立即加入5 mL 15 g/100 mL三氯乙酸(TCA，4 ℃)終止反應(yīng)，混合物以6 000 r/min離心5 min，通過鉬酸銨比色法測量上清液中的無機(jī)磷含量，Ca2+-ATPase活性以每毫克蛋白每分鐘釋放的無機(jī)磷(Pi)微克數(shù)表示。

(3) 羰基含量測定：參考Li等[20]的方法稍作修改。取1.8 mL 魚糜蛋白樣品于離心管中，加入1.8 mL 10 mmol/L DNPH溶液，在室溫下暗處反應(yīng)1 h后加入20% TCA，于4 ℃下6 000 r/min離心15 min，棄上清液，用3 mL乙酸乙酯—乙醇溶液(V乙酸乙酯∶V乙醇溶液=1∶1)清洗沉淀3次，加3 mL 6 mol/L鹽酸胍后，置于37 ℃、150 r/min的搖床中振搖1 h后，在370 nm處測定其吸光值，計算羰基含量。

1.2.6 硫代巴比妥酸(TBA值)的測定 參考米紅波等[22]的方法并稍作修改，準(zhǔn)確稱取1.00 g生魚糜樣品加入10 mL 7.5% TCA混合液(含有0.1%沒食子酸丙酯、0.1% EDTA-2Na)，均質(zhì)30 s，用雙層濾紙過濾后取5 mL上清液，再加入5 mL 0.02 mol/L的TBA，置于90 ℃ 水浴鍋中加熱30 min，冷卻后在532 nm處測吸光值。同時做空白和標(biāo)曲。TBA值以每克魚糜樣品中丙二醛(MDA)的毫克數(shù)表示。

1.2.7 魚糜凝膠微觀形貌 參考Li等[20]的方法。魚糜凝膠從冰箱取出，室溫下平衡30 min 后切成厚度為1 mm的薄片，用液氮冷凍3 min后置于預(yù)冷的真空冷凍干燥機(jī)中凍干14 h。樣品噴金1 min后，使用SEM在20.0 kV的加速電壓下觀察。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 每組試驗至少重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；試驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件處理，以O(shè)rigin 9軟件作圖；使用SPSS 23軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)，采用多重比較分析法對各組進(jìn)行顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同凍藏方式下魚糜樣品的中心溫度變化

如圖1(a)所示，在凍結(jié)階段，浸漬凍藏組溫度下降較快，魚糜中心溫度從10 ℃降至0 ℃僅需5 min，從0 ℃降至-20 ℃約需要94 min，而空氣凍藏組魚糜降到相同的溫度分別耗時19，198 min。此外，浸漬凍藏組魚糜凍結(jié)時通過最大冰晶生成帶(-1～-5 ℃)[23]的時間約為10 min，為空氣凍藏組(78 min)1/8左右。一般來說，樣品在最大冰晶生成帶停留時間越短，形成的冰晶顆粒越小越均勻，對樣品品質(zhì)影響越小。因此，浸漬冷凍因為液體媒介導(dǎo)冷快而具有速凍效果，可減少凍結(jié)對魚糜質(zhì)量的損傷。

除了冷凍速率，凍藏或轉(zhuǎn)運過程中的溫度波動也對凍品質(zhì)量具有很大影響[24]。由圖1(b)可見，在魚糜中心溫度達(dá)到-20 ℃后，兩組樣品在凍藏過程中均存在明顯的溫度波動，其中浸漬凍藏組的波動幅度為0.72 ℃(-20.79～-20.07 ℃)，明顯小于空氣凍藏組(1.43 ℃)，空氣凍藏組的溫度波動約為浸漬組的2倍。這可能與液體媒介的比熱容較大，溫度變化受環(huán)境影響較小有關(guān)。因此，浸漬凍藏過程中樣品的溫度波動相對較小，有利于抑制冰的重結(jié)晶，阻止冰晶尺寸和形狀變化，從而穩(wěn)定凍品的質(zhì)量。

圖1 凍結(jié)及凍藏(24 h)過程中魚糜中心溫度變化監(jiān)測Figure 1 Freezing curve and a 24-hours temperature monitoring during frozen storage for surimi samples

2.2 浸漬凍藏過程中魚糜Ca2+-ATPase活性和羰基含量變化

Ca2+-ATPase活性能反映肌球蛋白的完整性和變性程度。其活性下降可視為是肌球蛋白頭部巰基氧化和蛋白交聯(lián)引起的蛋白質(zhì)變性[25]。由圖2(a)可見，兩種凍藏方式下魚糜蛋白質(zhì)Ca2+-ATPase活性均隨凍藏時間的延長顯著下降(P<0.05)，表明凍藏過程中蛋白質(zhì)變性程度不斷增加；可能是因為冰晶的生長導(dǎo)致蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)破壞、體系濃度增加以及蛋白質(zhì)重排交聯(lián)，使肌球蛋白頭部發(fā)生變化而變性[26]。凍藏15 d，浸漬凍藏組Ca2+-ATPase活性由0.39 μg Pi/(mg·min)劇烈下降至0.23 μg Pi/(mg·min)，降幅為41%，而相同空氣凍藏組樣品的降幅為47%，降幅明顯低于空氣凍藏組；凍藏60 d，浸漬凍藏組Ca2+-ATPase活性為0.12 μg Pi/(mg·min)，顯著高于空氣凍藏組的(P<0.05)。這可能與圖1中浸漬凍藏的速凍效果及溫度波動較小有關(guān)，速凍使魚糜內(nèi)部形成的冰晶體積較小且均勻，從而減輕了肌原纖維蛋白變性；此外，肌球蛋白頭部巰基氧化也是Ca2+-ATPase活性降低的部分原因[25]，而控制樣品溫度波動可有效減輕氧化反應(yīng)的發(fā)生[27]。

大寫字母不同表示同一凍藏方式不同貯藏時間之間差異顯著(P<0.05)；小寫字母不同表示同一貯藏時間不同凍藏方式之間差異顯著(P<0.05)

蛋白羰基含量是蛋白質(zhì)氧化損傷的敏感指標(biāo)。由圖2(b) 可見，無論是浸漬凍藏還是空氣凍藏，魚糜蛋白質(zhì)羰基含量均隨凍藏時間增加而顯著上升(P<0.05)，表明凍藏過程中魚糜蛋白質(zhì)持續(xù)發(fā)生了不同程度的氧化。在相同的凍藏周期，浸漬凍藏組樣品的羰基含量均低于空氣凍藏組，尤其在凍藏15～60 d，浸漬凍藏組樣品的羰基含量增加了2.1倍，而空氣凍藏組則增加了2.5倍，顯著高于浸漬凍藏組(P<0.05)。這可能是因為凍藏期間魚糜樣品內(nèi)部的氧化反應(yīng)依然在進(jìn)行，而傳統(tǒng)空氣凍藏誘導(dǎo)了更多的蛋白質(zhì)變性或去折疊[26]，比浸漬凍藏組更有利于形成席夫堿等反應(yīng)，從而使胺與羰基之間的反應(yīng)速度更快[28]，生成更多的羰基化合物，這也與Ca2+-ATPase活性變化的結(jié)果吻合。

2.3 浸漬凍藏過程中魚糜TBA值的變化

TBA值反映了脂質(zhì)氧化過氧化物降解產(chǎn)物丙二醛(MDA)的水平，是表征食品脂肪氧化程度的常用指標(biāo)[29]，魚糜樣品在凍藏過程中TBA值的變化如圖3所示。隨著凍藏時間的延長，兩種凍藏方式下魚糜樣品的TBA值均顯著上升(P<0.05)，表明凍藏過程中發(fā)生了脂質(zhì)氧化反應(yīng)，可能與不漂洗魚糜中含有較高含量的不飽和脂肪酸有關(guān)，其不斷氧化導(dǎo)致產(chǎn)生了更多的氫過氧化物降解產(chǎn)物(如MDA)。凍藏過程中，浸漬凍藏組的魚糜樣品TBA值明顯低于空氣凍藏組，且凍藏前15 d差異更顯著(P<0.05)，說明浸漬凍藏一定程度上能抑制魚糜中脂質(zhì)氧化，可能是因為其形成的冰晶較小，減輕了魚糜組織的損傷，從而減少了血紅素、金屬離子等促氧化劑的釋放，延緩了脂質(zhì)氧化，與Wang等[30]的研究結(jié)論一致。此外，與傳統(tǒng)漂洗魚糜相比，不漂洗魚糜初始TBA值較高，貯藏過程上升也較快[31]，但其凍藏60 d內(nèi)的蛋白質(zhì)羰基含量差異不顯著[32]，說明脂質(zhì)氧化對不漂洗魚糜貯藏過程中的品質(zhì)變化影響更大，加工過程中可以考慮添加合適的抗氧化物質(zhì)。

2.4 浸漬凍藏過程中魚糜凝膠強度的變化

魚糜凝膠主要是由肌原纖維蛋白分子中暴露在一定溫度下的疏水基團(tuán)之間的分子間相互作用形成[33]，是冷凍魚糜商業(yè)價值的重要指標(biāo)。由圖4可見，隨著凍藏時間增加，魚糜凝膠的凝膠強度呈下降趨勢，且凍藏前7 d下降尤為顯著(P<0.05)，可能是因為凍結(jié)及凍藏過程中肌原纖維蛋白發(fā)生了冷凍變性，導(dǎo)致魚糜凝膠強度下降，從而降低了魚糜品質(zhì)。與空氣凍藏組相比，浸漬凍藏組樣品的凝膠強度下降幅度較小，如凍藏第60天，浸漬凍藏組樣品的凝膠強度下降了39%，而空氣凍藏組的降幅為44%；但可能是因為質(zhì)構(gòu)儀測定結(jié)果的誤差較大，兩組樣品凝膠強度的差異并不顯著。此外，不漂洗魚糜因未經(jīng)漂洗除去影響魚糜凝膠形成的各種成分，通常其制品的凝膠強度要低于傳統(tǒng)漂洗魚糜[34]，加工過程中可以通過添加某些改良劑[35]提高凝膠強度，改善口感。

大寫字母不同表示同一凍藏方式不同貯藏時間之間差異顯著(P<0.05)；小寫字母不同表示同一貯藏時間不同凍藏方式之間差異顯著(P<0.05)

2.5 浸漬凍藏過程中魚糜凝膠持水力的影響

持水力反映了魚糜凝膠結(jié)合(截留)水的能力，是決定魚糜品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價值的重要指標(biāo)，貯藏過程中魚糜凝膠持水力的降低主要與肌原纖維的損傷和變性有關(guān)[36]。由圖5可知，隨著凍藏時間的增加，兩組魚糜的持水力均呈下降趨勢，表明凍藏改變了肌原纖維蛋白性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，損害了凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[36]。整個凍藏期間，浸漬凍藏組的持水力顯著高于空氣凍藏組(P<0.05)；其中凍藏60 d，浸漬凍藏組的持水力為85.84%，下降了4.1%，而空氣凍藏組的持水力為84.63%，下降了5.4%。說明浸漬凍藏有利于抑制魚糜凝膠持水力的下降，主要是因為浸漬凍藏能減輕肌原纖維蛋白的變性和氧化，延緩了凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)劣化，從而使魚糜凝膠的保水能力得到改善，這也與圖2中的結(jié)果相符。

大寫字母不同表示同一凍藏方式不同貯藏時間之間差異顯著(P<0.05)；小寫字母不同表示同一貯藏時間不同凍藏方式之間差異顯著(P<0.05)

2.6 浸漬凍藏過程中魚糜凝膠結(jié)構(gòu)變化

魚糜凝膠結(jié)構(gòu)主要取決于肌肉蛋白質(zhì)分子間的相互作用和肌原纖維蛋白的有序聚集[37]，與魚糜凝膠特性密切相關(guān)。由圖6可見，未冷凍魚糜凝膠結(jié)構(gòu)致密，孔洞較小且均勻，具有良好的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；隨著凍藏時間增加，兩組魚糜凝膠均有孔洞變大趨勢，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)逐漸變得無序并坍塌，表明凍藏?fù)p害了魚糜凝膠結(jié)構(gòu)，這與其凝膠強度和持水力逐漸下降的結(jié)果(圖4、圖5)一致，可能與魚糜蛋白質(zhì)冷凍變性及冰晶形成和重結(jié)晶導(dǎo)致的魚糜結(jié)構(gòu)損傷有關(guān)[38]。與空氣凍藏組相比，浸漬凍藏組樣品凝膠結(jié)構(gòu)在凍藏過程中的變化相對較小，如凍藏第1天其凝膠網(wǎng)絡(luò)的孔洞明顯較空氣凍藏組小且均勻；凍藏第15天，空氣凍藏組凝膠網(wǎng)絡(luò)中可觀察到明顯的碎片，而浸漬凍藏組則相對完整；凍藏第60天，空氣凍藏組凝膠網(wǎng)絡(luò)變得雜亂無章，觀察到明顯結(jié)構(gòu)坍塌，而浸漬凍藏組雖然也嚴(yán)重碎片化，但仍具有完整的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。因此，浸漬凍藏因具有速凍和減小溫度波動的效果，在一定程度上能夠減輕魚糜凝膠結(jié)構(gòu)的冷凍損傷，但仍難以有效抑制魚糜凝膠結(jié)構(gòu)和品質(zhì)劣化，添加抗凍保護(hù)劑仍然非常必要。

大寫字母不同表示同一凍藏方式不同貯藏時間之間差異顯著(P<0.05)；小寫字母不同表示同一貯藏時間不同凍藏方式之間差異顯著(P<0.05)

圖6 魚糜凍藏過程中凝膠結(jié)構(gòu)的變化Figure 6 Changes in the structure of surimi gels during frozen storage (×500)

3 結(jié)論

浸漬凍藏處理不僅凍結(jié)速度快，而且貯藏過程中的溫度波動較小，有利于提高不漂洗鰱魚魚糜的凍藏穩(wěn)定性。與空氣凍藏相比，浸漬凍藏可顯著減輕魚糜蛋白質(zhì)變性(Ca2+-ATPase活性下降)和氧化(羰基含量上升)，抑制魚糜脂質(zhì)氧化(TBA值上升)，同時也能減緩魚糜凝膠強度和持水力的下降，一定程度上延緩了凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)劣化，從而減少魚糜產(chǎn)品凍藏過程中的品質(zhì)變化。因此，浸漬凍藏是一種有效的穩(wěn)定魚糜產(chǎn)品質(zhì)量方案，同時節(jié)能、安全，在食品冷鏈物流技術(shù)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。