唐毓萍,孫曉梅,王艷旗,閆志強(qiáng),李慧良

(華熙生物科技股份有限公司上海研發(fā)中心，上海 200131)

肌肽是由β-丙氨酰與L-組氨酸殘基構(gòu)成的二肽，具有相對分子質(zhì)量小，性質(zhì)穩(wěn)定、易吸收等優(yōu)點(diǎn)。肌肽可以調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)酸堿度、螯合金屬離子、抑制非酶糖基化，具有抗氧化性等生理活性[1-3]。肌肽可通過清除或抑制自由基阻止或緩解皮膚衰老，被廣泛地應(yīng)用于抗衰老化妝品中。不同濃度水平的肌肽對修復(fù)皮膚損傷、改善皮膚等功效方面有明顯區(qū)別，如果過量使用則會導(dǎo)致皮膚過敏等副作用[4]，因此在化妝品研制過程中，需要控制肌肽的添加量。

肌肽的檢測方法主要有電泳法[5]和高效液相色譜法(HPLC)[6-8]，其中HPLC 應(yīng)用較多。文獻(xiàn)[6]采用PrevailTMCarbohydrate ES色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)作固定 相，以甲醇-乙酸溶 液(pH 3.5)體系作流動相進(jìn)行等度洗脫分離，在檢測波長210 nm 處測定化妝品中肌肽的含量，但是肌肽在該色譜柱上的保留較弱;文獻(xiàn)[7]采用鄰苯二甲醛衍生肌肽，以附熒光檢測器的HPLC 測定其含量;文獻(xiàn)[8]則采用2，4-二硝基氟苯衍生肌肽，以附二極管陣列檢測器(DAD)的HPLC 測定其含量。柱前衍生法雖然可以解決肌肽保留弱的問題，但是前處理過程比較繁瑣。親水相互作用液相色譜法(HILIC)[9]是一種用于分析強(qiáng)極性、可離解化合物的強(qiáng)有力的分析技術(shù)，所使用的親水、極性固定相可從流動相中吸附水分子，在其表面形成“富水層”，分析物通過在固定相表面的“富水層”和流動相中的“有機(jī)溶劑層”間的親水液液分配而滯留，從而達(dá)到色譜分離目的?；瘖y品基質(zhì)比較復(fù)雜，肌肽添加量較少，為了降低復(fù)雜前處理帶來的影響，試驗(yàn)以親水相互作用色譜柱為固定相，以體積比60∶40的乙腈和乙酸鹽緩沖溶液(用乙酸調(diào)節(jié)10 mmol·L－1乙酸銨溶液酸度至pH 3.5)的混合溶液為流動相進(jìn)行等度洗脫，以附DAD 的HPLC 測定化妝品中肌肽的含量，該方法操作簡單、色譜柱保留能力好、分離能力強(qiáng)，可為化妝品中肌肽的檢測提供參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1260型高效液相色譜儀，配DAD;KQ-300DE型超聲波清洗器;IKA Vortex 2型渦旋混合器;ME 204型分析天平;MIlli-Q 型超純水機(jī)。

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:10 g·L－1，取0.1 g(精確至0.000 1 g)L-肌肽標(biāo)準(zhǔn)品，用流動相溶解并定容至10 mL，搖勻備用。

標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用流動相逐級稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為5，10，20，50，100，200 mg·L－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

L-肌肽標(biāo)準(zhǔn)品的純度為99%;乙腈、乙酸銨、乙酸均為色譜純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

Agilent Poroshell 120 Hilic色譜柱(100 mm×3.0 mm，2.7 μm);柱溫30 ℃;流量0.5 mL·min－1;流動相為體積比60∶40的乙腈和乙酸鹽緩沖溶液(pH 3.5)的混合溶液，等度洗脫;檢測波長220 nm;進(jìn)樣量5μL。

1.3 試驗(yàn)方法

取1 g(精確至0.000 1 g)化妝品樣品，置于10 mL具塞比色管中。加入5 mL 流動相，渦旋1 min，用流動相稀釋至10 mL，超聲提取20 min。取出，冷卻至室溫，必要時以10 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心10 min。上清液過0.22μm 濾膜，濾液供HPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

空白樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖1。

圖1 空白樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of the blank sample solution and standard solution

由圖1可知:化妝品基質(zhì)對肌肽的測定基本無干擾;肌肽保留效果良好，其保留時間約2.5 min。

2.2 色譜條件的選擇

試驗(yàn)比較了分別以乙腈-0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)三氟乙酸溶液體系和乙腈-乙酸銨溶液體系作流動相時肌肽的分離效果。結(jié)果顯示:以乙腈-0.1%三氟乙酸溶液體系作流動相時，肌肽在色譜柱上的保留較弱(保留時間為1.3 min)，且色譜峰拖尾嚴(yán)重;以乙腈-乙酸銨溶液體系作流動相時，肌肽在色譜柱上有良好的保留，色譜峰峰形良好。進(jìn)一步考察了水相中乙酸銨濃度分別為10，20 mmol·L－1，水相酸度分別為pH 3.5，4.0時對肌肽分離效果的影響。結(jié)果顯示，水相中乙酸銨的濃度和水相酸度對肌肽分離效果影響不大。考慮到鹽類物質(zhì)對儀器的影響等因素，試驗(yàn)選擇的流動相為體積比60∶40的乙腈和乙酸鹽緩沖溶液(用乙酸調(diào)節(jié)10 mmol·L－1乙酸銨溶液酸度至pH 3.5)的混合溶液。

肌肽的最大吸收波長為218 nm，故試驗(yàn)選擇220 nm 作為肌肽的檢測波長。

2.3 提取劑的選擇

肌肽極易溶于水，不溶于乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑。考慮到肌肽的溶解特性和化妝品基質(zhì)的性質(zhì)，在進(jìn)行樣品前處理時，要求提取劑既能有效破乳又能充分提取肌肽。鑒于此，試驗(yàn)考察了分別采用流動相、體積比60∶40 甲醇-水體系以及體積比70∶30的乙腈-水體系作提取劑時對肌肽提取效果的影響。結(jié)果顯示，以流動相提取樣品時肌肽的回收率為86.7%～102%，以體積比60∶40的甲醇-水體系提取樣品時肌肽的回收率為83.1%～88%，以體積比70∶30的乙腈-水體系提取時效果不佳，樣品溶液呈渾濁態(tài)。因此，試驗(yàn)選擇以流動相作提取劑。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照儀器工作條件測定標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，以肌肽的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，肌肽標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為5～200 mg·L－1，線性回 歸方程 為y＝13.93x－22.27，相關(guān)系數(shù)為0.999 6。

分別以3，10倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N)，所得檢出限為0.3 mg·L－1，測定下限為1.0 mg·L－1。

2.5 精密度和回收試驗(yàn)

對化妝水、乳液和膏霜空白基質(zhì)進(jìn)行低、中、高等3個濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個濃度水平做6個平行樣，計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，所得結(jié)果見表1。

表1 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.1 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表1可知，肌肽的回收率為86.7%～102%，RSD 為1.3%～5.5%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將質(zhì)量濃度為50 mg·L－1的肌肽標(biāo)準(zhǔn)溶液分別放置0，2，6，8，12，24 h 后按照儀器工作條件測定，計算肌肽保留時間和峰面積的RSD，結(jié)果分別為0.57%和3.6%，表明肌肽標(biāo)準(zhǔn)溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 樣品分析

按照試驗(yàn)方法分析7 款市售的含肌肽的化妝水、精華液、膏霜樣品，除了1款樣品未檢出肌肽，其他6款樣品中肌肽的檢出量為12～958μg·g－1。

本工作采用親水相互作用液相色譜法測定化妝品中肌肽的含量。該法操作簡單、精密度高、回收率好，可為化妝品中肌肽的定性、定量監(jiān)測提供參考。