周力，侯生珍，王志有，楊葆春，韓麗娟，桂林生

（1. 青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016；2. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

玉米（Zea mays）具有適口性好、能值高且易于消化吸收等許多優(yōu)點(diǎn)，一直是動(dòng)物飼料中主要的能量來源［1］。但隨著玉米價(jià)格高漲，加上能量原料供應(yīng)量不能滿足規(guī)模化養(yǎng)羊業(yè)的需求，因此，積極尋找優(yōu)質(zhì)的能量飼料替代產(chǎn)品便成了當(dāng)前畜牧業(yè)研究的熱點(diǎn)。

棕櫚粕（palm kernel meal，PKM）作為棕櫚仁油加工后的副產(chǎn)物，產(chǎn)量豐富，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高且價(jià)格低廉，在畜禽飼料中的應(yīng)用日漸廣泛［2］。以福建龍巖麻鴨為研究對(duì)象［3］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)飼糧中棕櫚粕添加水平對(duì)蛋鴨平均蛋重、蛋黃重和蛋殼重具有顯著影響。樊慶山等［4］試驗(yàn)證實(shí)，3～5 月齡夏雜牛飼糧中棕櫚粕可明顯促進(jìn)犢牛生長(zhǎng)，同時(shí)還能提高機(jī)體的抗氧化功能。丁翠英［5］研究表明，在日糧中添加14.3%的棕櫚粕能夠提升荷斯坦奶牛的產(chǎn)奶量，改善乳成分，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率，并有效增加養(yǎng)殖效益。其他試驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)［6］，棕櫚粕可以代替部分日糧中的部分苜蓿（Medicago sativa）草粉，在日糧中添加20%棕櫚粕可以提高肉兔的生長(zhǎng)性能且對(duì)飼料消化率無負(fù)面影響。基于上述研究結(jié)論，可知在飼糧中添加適宜比例的棕櫚粕，可促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、降低飼養(yǎng)成本以及改善產(chǎn)品品質(zhì)。

目前有關(guān)棕櫚粕與反芻動(dòng)物關(guān)系的研究較少，將其應(yīng)用到綿羊飼糧中更是鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)采用不同比例的棕櫚粕替換母羊精料補(bǔ)充料中部分玉米，通過分析不同比例棕櫚粕飼糧對(duì)高原型藏羊腸道組織形態(tài)學(xué)、消化酶活性、pH、脂多糖及抗氧化能力的影響，以期為棕櫚粕在藏羊飼糧中的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

試驗(yàn)時(shí)間：2021年5-8 月；試驗(yàn)地點(diǎn)：青海省海南州共和縣香咔梅朵牧業(yè)有限公司。

1.2 動(dòng)物選擇與分組

試驗(yàn)以精料補(bǔ)充料中不同水平棕櫚粕（0%、15%、18%和21%）為單因素隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取發(fā)育健康的2～3 月齡高原型藏羊母羊120 只，隨機(jī)分為4 組，每組30 只，每組6 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5 只母羊。試驗(yàn)分預(yù)飼期7 d，正試期90 d。

1.3 飼糧組成及飼養(yǎng)管理

根據(jù)母羊不同飼養(yǎng)階段營(yíng)養(yǎng)需要量，參考中國(guó)《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 816-2004）［7］進(jìn)行飼料配制，基礎(chǔ)飼糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平見表1。棕櫚粕營(yíng)養(yǎng)成分委托中國(guó)科學(xué)院西北高原研究所測(cè)定，其中水分7.90%，粗灰分4.60%，粗蛋白16.50%，粗纖維31.10%，粗脂肪6.00%，酸性洗滌纖維33.20%，中性洗滌纖維72.20%。飼糧由精料補(bǔ)充料、燕麥（Avena sativa）青干草和燕麥青貯（干物質(zhì)基礎(chǔ)）組成。整個(gè)試驗(yàn)分兩個(gè)階段，第一階段為0～30 d，日糧精粗比為6∶4（精料∶燕麥青貯∶燕麥青干草=6∶2∶2），第二階段為31～90 d，日糧精粗比為7∶3（精料∶燕麥青貯∶燕麥青干草=7∶1.5∶1.5）。試驗(yàn)期間每天上午（08：30）和下午（17：30）通過人工將飼料攪拌均勻后飼喂母羊兩次，自由采食、自由飲水。試驗(yàn)開始前對(duì)圈舍清掃消毒，母羊進(jìn)圈后按照常規(guī)方法進(jìn)行防疫與驅(qū)蟲。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets（DM basis）

1.4 母羊屠宰及樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)每組選取5 只接近平均體重的母羊（禁食12 h、禁水2 h）切斷頸靜脈放血致死，迅速打開腹腔，按馬仲華［8］的方法分離出3 個(gè)腸段，剪取十二指腸、空腸和回腸2～3 cm 組織，生理鹽水沖洗干凈后放入4%的多聚甲醛中固定，時(shí)間不少于48 h，利用蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色制作常規(guī)的石蠟切片。同時(shí)采集空腸食糜分裝到離心管，立即投入液氮中保存待測(cè)。

1.5 小腸相關(guān)指標(biāo)及測(cè)定方法

1.5.1 切片制作及組織形態(tài)學(xué)觀察 運(yùn)用Olympus-BX51（奧林巴斯有限責(zé)任公司，日本）顯微照相系統(tǒng)觀察小腸各段（十二指腸、空腸以及回腸）組織形態(tài)并拍照，通過Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件測(cè)定十二指腸、空腸以及回腸的絨毛高度、絨毛寬度、隱窩深度、黏膜厚度，并計(jì)算絨毛高度/隱窩深度。每張切片選取5 個(gè)清晰完整的視野，每個(gè)視野測(cè)定4 組數(shù)據(jù)，結(jié)果取其平均值。

1.5.2 腸道食糜消化酶活性的分析 α-淀粉酶（α-amylase）、纖維素酶（cellulase，CE）、脂肪酶（lipase）、胰蛋白酶（trypsin，TPS）和糜蛋白酶（chymotrypsin）活性由江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司提供的試劑盒測(cè)定。

1.5.3 腸道食糜抗氧化能力的檢測(cè) 總抗氧化能力（total antioxygentic capacity，T-AOC）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活性由南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測(cè)定。

1.5.4 腸道食糜pH 和脂多糖的測(cè)定 現(xiàn)場(chǎng)使用便攜式PHS-3C 型pH 計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司，中國(guó)）對(duì)母羊小腸內(nèi)容物的pH 進(jìn)行測(cè)定并詳細(xì)記錄其數(shù)值，同時(shí)利用酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）方法在Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)分析儀（新加坡）上以空白孔調(diào)零，450 nm 波長(zhǎng)下依序測(cè)定各孔脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的吸光度（OD 值）。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016 初步統(tǒng)計(jì)后，采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），同時(shí)使用Duncan’s 法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果以“平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，以P＜0.05 表示差異顯著，以P＜0.01 表示差異極顯著，0.05＜P＜0.10 為統(tǒng)計(jì)學(xué)上有趨勢(shì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同比例棕櫚粕飼糧對(duì)藏羊母羊腸道形態(tài)發(fā)育的影響

從表2 和圖1 可知，0%組和15%組十二指腸的絨毛高度顯著高于其他2 組（P＜0.05）；其中0%組與15%組差異不顯著（P＞0.05）；0%組十二指腸的絨毛寬度極顯著高于18%組和21%組（P＜0.01），與15%組相比差異不顯著（P＞0.05）；各組間十二指腸的隱窩深度差異不顯著（P＞0.05）；0%組十二指腸的黏膜厚度顯著高于21%組（P＜0.05），相較于15%組和18%組差異不顯著（P＞0.05）；21%組十二指腸的絨毛高度/隱窩深度低于其他3 組，其中21%組與0%組、15%組差異極顯著（P＜0.01）。

表2 棕櫚粕替代玉米對(duì)藏羊母羊十二指腸組織形態(tài)的影響Table 2 Effect of palm meal instead of corn on duodenal tissue morphology of Tibetan sheep ewe

圖1 不同比例棕櫚粕飼糧條件下藏羊母羊十二指腸的石蠟切片F(xiàn)ig.1 Paraffin sections of duodenum of Tibetan sheep ewe fed with different proportion of palm meal（10×10）

從表3 和圖2 可知，18%組空腸的絨毛高度顯著低于15%組和21%組（P＜0.05），且與0%組差異不顯著（P＞0.05）；21%組空腸的絨毛寬度顯著高于0%組與18%組（P＜0.05），且與15%組差異不顯著（P＞0.05）；18%組空腸的隱窩深度、黏膜厚度低于其他3 組，其中18%組與15%組、21%組差異顯著（P＜0.05）；各組間空腸的絨毛高度/隱窩深度差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 不同比例棕櫚粕飼糧條件下藏羊母羊空腸的石蠟切片F(xiàn)ig.2 Paraffin sections of jejunum of Tibetan sheep ewe under different proportion of palm meal diet（10×10）

表3 棕櫚粕替代玉米對(duì)藏羊母羊空腸組織形態(tài)的影響Table 3 Effects of palm meal instead of corn on jejunum morphology of Tibetan sheep ewe

從表4 和圖3 可知，15%組回腸的絨毛高度高于其他3 組，其中15%組與18%組、21%組差異顯著（P＜0.05）；各組間回腸的絨毛寬度差異不顯著（P＞0.05）；0%組回腸的隱窩深度高于其他3 組（0.05＜P＜0.10）；0%組和15%組回腸的黏膜厚度顯著高于其他兩組（P＜0.05）；15%組回腸的絨毛高度/隱窩深度高于其他3 組（0.05＜P＜0.10）。

圖3 不同比例棕櫚粕飼糧條件下藏羊母羊回腸的石蠟切片F(xiàn)ig.3 Paraffin sections of ileum of Tibetan sheep ewe under different proportion of palm meal diet（10×10）

表4 棕櫚粕替代玉米對(duì)藏羊母羊回腸組織形態(tài)的影響Table 4 Effect of palm meal instead of corn on ileum morphology of Tibetan sheep ewe

2.2 不同比例棕櫚粕飼糧對(duì)藏羊母羊空腸消化酶活性的影響

從表5 可知，15%組空腸的α-淀粉酶活性顯著高于其他3 組（P＜0.05）；0%組空腸的纖維素酶活性顯著低于15%組和21%組（P＜0.05），且0%組與18%組間差異不顯著（P＞0.05）；15%組和21%組空腸的脂肪酶活性極顯著高于0%組與18%組（P＜0.01），其中15%組和21%組差異不顯著（P＞0.05）；0%組空腸的糜蛋白酶活性顯著低于15%組和18%組（P＜0.05），且與21%組差異不顯著（P＞0.05）；各組間空腸的胰蛋白酶活性差異不顯著（P＞0.05）。

表5 棕櫚粕替代玉米對(duì)藏羊母羊空腸消化酶活性的影響Table 5 Effect of palm meal instead of corn on jejunum digestive enzyme activity of Tibetan sheep ewe

2.3 不同比例棕櫚粕飼糧對(duì)藏羊母羊空腸抗氧化指標(biāo)的影響

從表6 可知，15%組空腸的谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著高于其他3 組（P＜0.05）；0%組空腸的過氧化氫酶活性顯著低于15%組和18%組（P＜0.05），與21%組差異不顯著（P＞0.05）；18%組空腸的總抗氧化能力高于其他3 組（0.05＜P＜0.10）；15%組空腸的超氧化物歧化酶活性高于其他3 組（0.05＜P＜0.10）；各組間空腸的丙二醛含量差異不顯著（P＞0.05）。

表6 棕櫚粕替代玉米對(duì)藏羊母羊空腸抗氧化能力的影響Table 6 Effect of palm meal instead of corn on jejunum antioxidant capacity of Tibetan sheep ewe

2.4 不同比例棕櫚粕飼糧對(duì)藏羊母羊空腸pH 和脂多糖的影響

從圖4 可知，與0%組相比，其他3 組空腸pH 值均有所下降（0.05＜P＜0.10）；0%組空腸脂多糖含量顯著或極顯著低于18%組和21%組（P＜0.05 或P＜0.01），且0%組與15%組間差異不顯著（P＞0.05）。

圖4 棕櫚粕替代玉米對(duì)藏羊母羊空腸pH 和脂多糖的影響Fig. 4 Effect of palm meal instead of corn on pH and lipopolysaccharide in jejunum of Tibetan sheep ewe不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05），不同大寫字母表示差異極顯著（P＜0.01），相同 字 母表 示差 異 不顯 著（P＞0.05）。Different small letters mean significant differences（P＜0.05），different capital letters mean significant differences（P＜0.01），and the same letter means no significant differences（P＞0.05）.

3 討論

3.1 不同比例棕櫚粕飼糧對(duì)藏羊母羊腸道形態(tài)發(fā)育的影響

反芻動(dòng)物腸道發(fā)育受多種因素影響與調(diào)節(jié)，如激素、斷奶日齡、生長(zhǎng)因子等，其中飼糧組成也是一個(gè)重要的方面［9］。眾所周知，小腸是反芻動(dòng)物養(yǎng)分消化、吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的主要場(chǎng)所［10］，其黏膜結(jié)構(gòu)是其消化吸收功能的前提基礎(chǔ)［11］。腸絨毛的高度越高，代表其成熟細(xì)胞越多，吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力就越強(qiáng)［12］。本研究中，與0%組相比，飼喂15%棕櫚粕具有促進(jìn)空腸和回腸的絨毛高度、寬度的趨勢(shì)。這說明15%棕櫚粕替代部分玉米對(duì)藏羊空腸和回腸發(fā)育無不利影響。隱窩深度是反映細(xì)胞生成率的指標(biāo)，當(dāng)小腸隱窩深度越淺，說明動(dòng)物腸道的分泌和吸收功能就越強(qiáng)［13］。此外，隱窩越淺還能表示進(jìn)一步加快腸道黏膜細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，增強(qiáng)腸道損傷的修復(fù)作用并能有效提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能。而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與0%組相比，15%組各腸段的隱窩深度差異不顯著。這表明飼喂15%棕櫚粕替代精料補(bǔ)充料中玉米未對(duì)藏羊小腸吸收能力產(chǎn)生顯著影響。黏膜作為機(jī)體免疫系統(tǒng)的第1 道免疫防線，對(duì)抵抗外來致病菌的入侵具有重要作用。研究表明，反芻動(dòng)物腸道黏膜厚度的增強(qiáng)有利于提高抗菌、抗炎的能力，可有效減少腸道疾病的發(fā)生［14］。從本試驗(yàn)結(jié)果來看，使用不同比例的棕櫚粕替代玉米，與0%組相比，15%棕櫚粕有利于增加藏羊小腸（除十二指腸外）的黏膜厚度。在湖羊上研究發(fā)現(xiàn)［15］，絨隱比（絨毛高度/隱窩深度）代表小腸黏膜的成熟度，其比值與絨毛中成熟細(xì)胞的占比有關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于0%組，飼喂18%和21%組極顯著降低了十二指腸的絨毛高度/隱窩深度，但使用15%棕櫚粕則差異不顯著。推測(cè)其原因：可能是15%棕櫚粕能夠有效調(diào)節(jié)藏羊腸道微生物區(qū)系和菌群，使其達(dá)到了一個(gè)最佳的平衡狀態(tài)，從而改善了腸道發(fā)育。因此，飼喂15%棕櫚粕能夠明顯促進(jìn)藏羊腸道絨毛生長(zhǎng)狀況，并有助于腸道黏膜結(jié)構(gòu)的完善。

3.2 不同比例棕櫚粕飼糧對(duì)藏羊母羊空腸消化酶活性的影響

消化酶活性的高低可反映反芻動(dòng)物采食性能，同時(shí)還能直接決定腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收和利用的程度［16］。機(jī)體的消化功能與其胃腸道所產(chǎn)生的消化酶活性及其分泌量呈正相關(guān)，繼而影響動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育［17］。研究證實(shí)，日糧中外源酶蛋白酶可促進(jìn)消化道中淀粉酶的活性，進(jìn)而提高日糧消化率［18］。蛋白酶活性對(duì)小腸中蛋白質(zhì)、氨基酸以及小肽消化吸收發(fā)揮著重要的作用［19］。在本試驗(yàn)中，與0%組相比，15%組空腸的胰蛋白酶活性差異不顯著，但0%組空腸的糜蛋白酶活性顯著低于15%組。本試驗(yàn)中，與0%組相比，15%組空腸的α-淀粉酶活性顯著增加，這可能由于消化酶之間的協(xié)同效應(yīng)所致。脂肪酶作為一種可誘導(dǎo)的胞外酶，其活性大小與攝入飼料中脂肪含量有關(guān)［20］。而本試驗(yàn)中，15%組空腸的脂肪酶活性極顯著高于0%組，推測(cè)可能是由于飼料總營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的來源差異導(dǎo)致的，棕櫚粕中含有較高的纖維含量以及脂肪含量，能夠?yàn)橹久柑峁└嗟淖饔玫孜?，進(jìn)而促進(jìn)脂肪酶的活性。此外，本試驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)，與0%組相比，15%組和21%組空腸的纖維素酶活性顯著增強(qiáng)。由此可見，高纖維含量的棕櫚粕能夠被消化道微生物分解成更多的揮發(fā)性脂肪酸，而揮發(fā)性脂肪酸可以作為纖維分解菌的能量來源，進(jìn)而增加纖維素酶的相對(duì)活性。因相關(guān)內(nèi)容報(bào)道較少，具體作用機(jī)理還有待接下來深入研究。

3.3 不同比例棕櫚粕飼糧對(duì)藏羊母羊空腸抗氧化能力的影響

正常情況下，機(jī)體內(nèi)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)之間處于平衡狀態(tài)。然而當(dāng)體內(nèi)氧化與抗氧化狀態(tài)失去平衡時(shí)，自由基可使腸道消化酶失去活性，蛋白質(zhì)發(fā)生變性，從而破壞腸道功能［21］。因此，提高腸道抗氧化能力對(duì)于發(fā)揮動(dòng)物腸道正常功能、促進(jìn)正常生長(zhǎng)以及維持健康均有著十分重要的意義。一般來講，總抗氧化能力、丙二醛含量，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶以及過氧化氫酶活性等是評(píng)判機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)［22］。研究證實(shí)［23］，灘羊血清中總抗氧化能力提高或丙二醛含量下降時(shí)，表明機(jī)體抗氧化能力增強(qiáng)。本試驗(yàn)對(duì)藏羊母羊空腸食糜進(jìn)行總抗氧化能力和丙二醛含量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)各組間總抗氧化能力與丙二醛含量差異不顯著。這提示采用不同比例的棕櫚粕替代玉米未對(duì)藏羊母羊腸道抗氧化能力產(chǎn)生不利影響，具有一定的可行性。另外，動(dòng)物體內(nèi)也存在多種抗氧化酶，包括超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶等，彼此之間相互協(xié)調(diào)構(gòu)成了體內(nèi)清除自由基的第1 道酶防御機(jī)制［24］。谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性增強(qiáng)也表示機(jī)體抗氧化酶活性提高。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與0%組相比，15%組空腸食糜谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶活性顯著增強(qiáng)。這意味著在飼糧中添加15%棕櫚粕可以顯著增強(qiáng)藏羊抗氧化酶活性。

3.4 不同比例棕櫚粕飼糧對(duì)藏羊母羊空腸pH 和脂多糖的影響

腸道酸堿度是維持動(dòng)物體內(nèi)菌群動(dòng)態(tài)平衡的一個(gè)重要因素［25］。pH 值的高低可直接影響腸道消化吸收功能。保持適宜的酸性環(huán)境可增強(qiáng)腸道的消化酶活性，提高對(duì)飼料的利用率，同時(shí)還能有效抑制有害微生物的生長(zhǎng)，維持反芻動(dòng)物機(jī)體健康［26］。研究表明，pH 值偏酸性有利于乳酸桿菌、雙歧桿菌等有益菌的繁殖，進(jìn)而提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能，增強(qiáng)抗病能力［27］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相較于0%組，其余3 組空腸食糜的pH 值均有所下降。由此可以看出，飼喂不同比例的棕櫚粕替代精料補(bǔ)充料中玉米能在一定程度上改善藏羊腸道菌群。脂多糖又稱內(nèi)毒素，廣泛存在于革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞外膜，在細(xì)菌快速生長(zhǎng)或裂解死亡時(shí)都會(huì)釋放大量脂多糖［28］。在奶牛上研究證實(shí)［29］，飼喂精料比例過高或有效中性洗滌纖維缺乏的飼糧時(shí)，可造成胃腸道中內(nèi)毒素濃度顯著增加。其他試驗(yàn)也表明，脂多糖能夠引起腸道形態(tài)學(xué)損傷，如黏膜出現(xiàn)水腫、出血，甚至發(fā)生壞死［30］。在本試驗(yàn)中，18%組與21%組藏羊空腸食糜脂多糖含量顯著或極顯著高于0%組，且0%組和15%組差異不顯著。這進(jìn)一步表明，在飼糧中添加過量的棕櫚粕能夠損傷腸道黏膜結(jié)構(gòu)。

4 結(jié)論

在本研究條件下，推薦使用15%棕櫚粕替代精料補(bǔ)充料中玉米更有利于完善高原型藏羊腸道黏膜結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)空腸消化酶活性和提高抗氧化能力。