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        豬源唾液酸黏附素受體的表達及其納米抗體篩選

        2023-03-21 01:39:32洪偉鳴郭子杰李睿婷
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2023年4期
        關(guān)鍵詞:噬菌體親和力特異性

        洪偉鳴,郭子杰,李睿婷,李 玲,徐 海,張 亮,宋 亮

        (江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,江蘇泰州 225300)

        病毒受體是指在宿主細(xì)胞內(nèi)部或者細(xì)胞膜表面可特異性地與病毒結(jié)合,并促使病毒感染的糖類、脂類以及蛋白質(zhì)類分子單體或復(fù)合物,其主要功能是識別細(xì)胞內(nèi)外的病毒粒子并與之結(jié)合[1]。當(dāng)前研究較為深入的病毒受體已達30多種,其中,唾液酸黏附素(Sialoadhesin,Sn),又被稱為Siglec-1或者CD169,是一種巨噬細(xì)胞限制的Ⅰ型跨膜糖蛋白,屬于唾液酸凝集素受體家族[2-3]。豬源Sn是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)入侵宿主的特異性細(xì)胞受體之一[4],PRRSV與Sn受體的結(jié)合增強了病毒向細(xì)胞表面的聚集,然后由網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞作用進入細(xì)胞[5]。由于Sn受體在PRRSV感染宿主過程中發(fā)揮著重要作用,使其成為了抗PRRSV藥物研究的重要靶點。

        早期研究表明,利用完整的靶細(xì)胞或者靶細(xì)胞膜免疫小鼠可篩選出能夠阻斷病毒結(jié)合的抗體。在研究PRRSV與巨噬細(xì)胞互作的過程中,發(fā)現(xiàn)2個肺泡巨噬細(xì)胞特異性單克隆抗體(mAb41D3、mAb41D5)能夠阻斷PRRSV的感染[6]。因此,分離純化細(xì)胞表面的病毒受體分子,再制備針對受體的單克隆抗體,通過特異性單克隆抗體競爭性阻斷病毒與受體的結(jié)合,是開發(fā)抗病毒藥物的重要策略之一[7]。由于病毒受體分子在細(xì)胞表面豐度較低,其占比不足細(xì)胞膜總蛋白的萬分之一,并且多為整合蛋白的形式包埋于脂質(zhì)雙層膜中,因此直接分離純化受體分子的可操作性不強[8]。以豬源Sn受體為例,其完整的分子結(jié)構(gòu)包含17個結(jié)構(gòu)域,又可分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)3個部分,其中胞外區(qū)具有免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)的區(qū)域是病毒結(jié)合位點[9]。利用基因工程方法表達Sn受體胞外區(qū)蛋白分子,用于制備特異性抗體是值得嘗試的途徑。

        納米抗體是一種新型的基因工程抗體,因其天然缺失輕鏈,分子大小為納米級,故被稱為納米抗體[10]。相比傳統(tǒng)抗體而言,納米抗體因其分子量小、穩(wěn)定性強、親和力高、組織穿透力強、易于生產(chǎn)和制備等諸多優(yōu)勢,在疾病診斷、治療和預(yù)防領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[11]。因此,本研究通過大腸桿菌表達系統(tǒng)制備Sn受體胞外區(qū)作為目標(biāo)分子,利用T7噬菌體展示的納米抗體文庫中對其進行親和篩選,以獲得特異性結(jié)合Sn受體的納米抗體分子,旨在為后續(xù)開展抗病毒活性研究打下基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        菌株與載體:DH5a、BL21-DE3大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,購于諾唯贊公司;納米抗體T7噬菌體展示文庫、pET-30a(+)載體由筆者所在實驗室保存。主要試劑:限制性內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶均為寶生物公司產(chǎn)品;膠回收試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒,購自天根公司;HisTrap HP層析柱,購自美國GE公司;其余試劑均為分析純。主要儀器:臺式離心機,購自美國Beck-man公司;BTX電轉(zhuǎn)化儀、PCR儀,購自寶生物公司;Geldoc-It Imaging System,購自美國UVP公司。

        1.2 重組表達載體pET-30a-Sn4D的構(gòu)建

        參考GenBank中上傳的豬源Sn序列,并根據(jù)大腸桿菌表達系統(tǒng)進行密碼子優(yōu)化,由金斯瑞公司合成Sn受體4個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(Sn4D)基因序列,并在該基因序列的上下游分別添加NdeⅠ、XhoⅠ限制性酶切位點。利用上述酶切位點將Sn4D基因插入原核表達載體pET-30a(+),雙酶切鑒定和測序分析,將鑒定正確的重組載體命名為pET-30a-Sn4D并導(dǎo)入BL21-DE3感受態(tài)細(xì)胞,凍存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3 Sn4D蛋白的表達與純化

        挑取攜帶重組表達載體pET-30a-Sn4D的大腸桿菌單菌落,37 ℃搖床過夜培養(yǎng),次日按1 ∶100比例轉(zhuǎn)接新鮮LB(Kan+)培養(yǎng)液,37 ℃搖床培養(yǎng)至菌液D600 nm=0.5,加入IPTG終濃度為0.5 mmol/L,繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h,收獲細(xì)菌,SDS-PAGE鑒定Sn4D蛋白表達情況。利用HRP Anti-6X His Tag抗體,Western-blot鑒定純化蛋白的反應(yīng)活性。根據(jù)HisTrap HP說明書,純化目的蛋白,經(jīng)NanoDrop測定蛋白濃度。

        1.4 納米抗體文庫篩選Sn4D特異性結(jié)合抗體

        取10 μL純化的Sn4D蛋白(100 μg/mL)加入到900 μL NaHCO3(1 mol/L,pH值=8.6)包被緩沖液中,100 μL/孔包被酶標(biāo)板,放置4 ℃過夜。次日,PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板1次,加入5% BSA封閉液,37 ℃封閉2 h,PBST緩沖液洗板3 次。用包被緩沖液調(diào)整納米抗體T7噬菌體展示文庫至1×1011PFU/mL 濃度,每孔加入100 μL并于37 ℃孵育1 h,使納米抗體與Sn4D蛋白充分作用。回收反應(yīng)溶液,PBST洗滌酶標(biāo)板10次,然后每孔加入 100 μL 1% SDS溶液洗脫與靶蛋白結(jié)合的噬菌體。取10 μL洗脫產(chǎn)物經(jīng)雙層瓊脂夾心法測定噬菌體滴度,剩余洗脫產(chǎn)物加入至對數(shù)生長早期的BL21宿主細(xì)菌中進行擴增,直至宿主細(xì)菌完全裂解。PEG-NaCl 法回收擴增的噬菌體,調(diào)整回收的噬菌體濃度,重復(fù)上述篩選步驟2次,每輪篩選逐步降低Sn4D蛋白包被量,同時增加PBST中Tween-20濃度,以獲得高親和力的納米抗體。利用公式:產(chǎn)出比=(洗脫噬菌體量/投入噬菌體量)×100%,計算每一輪篩選的得率。

        1.5 陽性噬菌體的鑒定

        測定第3輪洗脫產(chǎn)物的滴度并從平板上隨機挑取72個單克隆噬斑,用T7噬菌體特異性引物T7 Select UP Primer 5′-G G A G C T G T C G T A T T C C A G T C-3′和T7 Select DOWN Primer 5′-A A C C C C T C A A G A C C C G T T T A-3′進行噬斑PCR鑒定。挑選PCR陽性擴增產(chǎn)物送金斯瑞公司測序分析,用DNAstar軟件分析納米抗體氨基酸序列。

        1.6 納米抗體與Sn4D結(jié)合的親和力、特異性測定

        根據(jù)序列分析結(jié)果,選取展示不同納米抗體的噬菌體進行培養(yǎng),回收噬菌體擴增產(chǎn)物,并統(tǒng)一調(diào)整濃度至1×1010PFU/mL。分別向包被Sn4D、BSA (50 ng/孔)酶標(biāo)板中依次加入100 μL噬菌體。37 ℃ 孵育1 h后,棄去反應(yīng)液,PBST洗滌酶標(biāo)板10次,然后每孔加入100 μL 1% SDS溶液洗脫與蛋白結(jié)合的噬菌體。雙層瓊脂法測定洗脫產(chǎn)物中噬菌體滴度,將Sn4D孔洗脫噬菌體量設(shè)為P、BSA孔洗脫噬菌體量設(shè)為N,計算P/N值,比較不同納米抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合的特異性及親和力強弱。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建與蛋白表達

        將人工合成的Sn4D基因插入原核表達載體pET-30a(+)構(gòu)建重組表達載體pET-30a-Sn4D。由圖1可知,通過NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定切出約1 300 bp目的條帶,大小與預(yù)計相符合。序列測定結(jié)果顯示,插入的Sn4D基因片段序列完全正確,閱讀框無移碼。IPTG誘導(dǎo)攜帶重組表達載體的大腸桿菌。由圖2可知,SDS-PAGE檢測可見大小約50 ku的疑似Sn4D蛋白表達,通過超聲波破碎分析發(fā)現(xiàn)該蛋白主要以包涵體的形式存在。

        2.2 Sn4D蛋白鑒定與純化

        由圖3可知,將回收Sn4D包涵體通過變復(fù)性處理,然后經(jīng)HisTrap HP柱純化得到條帶相對單一的純蛋白(圖3-A);Western-blot檢測顯示,目標(biāo)蛋白與HRP Anti-6X His Tag抗體呈現(xiàn)良好的反應(yīng)性(圖3-B)。將Ni柱純化回收的蛋白經(jīng)NanoDrop測定含量,并調(diào)整濃度至100 μg/mL,-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

        2.3 Sn4D特異性重組噬菌體篩選

        將純化后的Sn4D蛋白作為靶分子并包被在固相載體上,使T7噬菌體展示的納米抗體與之結(jié)合。由表1可知,篩選過程中包被的靶分子用量逐輪降低,而洗滌液PBST中Tween-20含量逐漸升高,通過加壓篩選有利于獲得高親和的納米抗體分子。第1輪篩選產(chǎn)出比僅為0.072%,而第2輪篩選則提高到1.27%,第3輪進一步降低了投入噬菌體的量,但仍有1.13%產(chǎn)出比,因此經(jīng)過3輪篩選特異性結(jié)合Sn4D蛋白的噬菌體得到有效富集。

        表1 親和篩選過程中噬菌體的富集

        2.4 單克隆噬菌體的鑒定

        納米抗體基因插入在T7噬菌體衣殼蛋白p10B基因下游,融合表達的衣殼蛋白在組裝成T7噬菌體頭部的同時將納米抗體展示于表面。通過PCR方法檢測插入位點的納米抗體基因。由圖4可知,攜帶納米抗體基因的噬菌體PCR可擴增出約 750 bp 條帶,而未攜帶納米抗體基因的噬菌體僅擴增出250 bp條帶。從第三輪洗脫產(chǎn)物中隨機挑選72個單克隆噬菌斑進行PCR鑒定,共計鑒定得到63個攜帶納米抗體基因的噬菌體。 將PCR產(chǎn)物進行序列測定,通過比對納米抗體氨基酸序列,獲得42個不同氨基酸組成的納米抗體。

        2.5 納米抗體親和力、特異性檢測

        選取40株展示不同納米抗體的T7噬菌體分別與Sn4D、BSA相作用。通過比較不同株噬菌體與Sn4D結(jié)合數(shù)量的多少,以此評價其展示的納米抗體分子與Sn4D結(jié)合能力的強弱;比較同一株噬菌體分別與Sn4D、BSA結(jié)合數(shù)量的比值,以此來判定其展示的納米抗體與Sn4D結(jié)合的特異性。由圖5可知,第9、24株噬菌體雖然能夠高親和力地結(jié)合Sn4D,但也能高效結(jié)合BSA(圖5-A),因此其展示的納米抗體特異性較低(圖5-B);第11、21、31株噬菌體僅與Sn4D有高親和力結(jié)合,而不與BSA結(jié)合,表現(xiàn)出良好的親和力與特異性。

        3 討論

        Sn受體由部分分化的巨噬細(xì)胞亞群表達,而豬源Sn受體僅存在于肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)上[12],從細(xì)胞中直接分離、純化難度較大。因此,本研究中截取與病毒互作的Sn4D結(jié)構(gòu)域,并在大腸桿菌表達系統(tǒng)中實現(xiàn)了高效表達。雖然原核表達系統(tǒng)缺乏加工、折疊以及修飾等功能,但可快速制備高純度的靶標(biāo)蛋白,這可為納米抗體文庫的淘選奠定良好的基礎(chǔ)。

        納米抗體是一種發(fā)現(xiàn)于駱駝科、鯊魚科的重鏈抗體,相比傳統(tǒng)抗體而言有著許多無可比擬的優(yōu)勢,在抗病毒研究中的得到廣泛應(yīng)用。Liu等以PRRSV相對保守的Nsp-9蛋白為靶標(biāo),從噬菌體展示文庫中篩選出8株抗PRRSV Nsp-9蛋白的納米抗體,然后構(gòu)建MARC-145細(xì)胞系來穩(wěn)定表達活性最好的Nb6株納米抗體,發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞系可以抑制PRRSV基因組復(fù)制與轉(zhuǎn)錄,感染病毒后不出現(xiàn)病變[13]。本研究利用已構(gòu)建的羊駝納米抗體T7噬菌體展示文庫[14],針對Sn4D蛋白開展3輪親和篩選,通過降低靶標(biāo)蛋白包被量、提高洗滌緩沖液中吐溫含量等手段,加壓篩選能夠高親和力結(jié)合Sn4D蛋白的納米抗體分子。由表1可知,產(chǎn)出比在逐輪升高,目的噬菌體得到了有效富集。由于納米抗體分子大約包含150個氨基酸,在T7噬菌體表面展示構(gòu)成一定的空間位阻,隨著次級文庫的反復(fù)擴增,部分噬菌體克隆可能會出現(xiàn)納米抗體基因丟失的現(xiàn)象,因此需要對篩選產(chǎn)物中噬菌體單克隆進行鑒定,以確定納米抗體分子的完整性。由圖4可知,約15%的噬菌體克隆丟失了納米抗體基因。

        采用固相載體包被靶標(biāo)蛋白的方式進行親和篩選,篩選體系中除了Sn4D靶標(biāo)蛋白,還有BSA封閉蛋白,因此洗脫產(chǎn)物中的噬菌體可能針對Sn4D和BSA同時進行了有效富集,有必要分別測定單克隆噬菌體與Sn4D、BSA結(jié)合的特異性以及結(jié)合能力的強弱。由圖5可知,第9、24株噬菌體能夠同時高親和力地結(jié)合Sn4D、BSA蛋白,故其結(jié)合的特異性不強;而第11、21、31株噬菌體僅與Sn4D高親和力結(jié)合,顯示出良好的特異性。考慮到原核表達的Sn4D蛋白與PAM細(xì)胞表面的天然Sn蛋白存在構(gòu)象差異,因此仍需要制備PAM細(xì)胞,對篩選到的納米抗體分子做進一步的親和力、特異性鑒定。

        本研究通過構(gòu)建原核重組表達載體,制備高純度Sn4D受體蛋白作為靶標(biāo),經(jīng)過3輪親和篩選成功獲得6株能夠高親和力、特異性結(jié)合Sn4D蛋白的納米抗體分子,為后續(xù)進一步開展抗病毒活性研究奠定了堅實基礎(chǔ)。

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