洪偉鳴，郭子杰，李睿婷，李 玲，徐 海，張 亮，宋 亮

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300)

病毒受體是指在宿主細(xì)胞內(nèi)部或者細(xì)胞膜表面可特異性地與病毒結(jié)合，并促使病毒感染的糖類、脂類以及蛋白質(zhì)類分子單體或復(fù)合物，其主要功能是識(shí)別細(xì)胞內(nèi)外的病毒粒子并與之結(jié)合[1]。當(dāng)前研究較為深入的病毒受體已達(dá)30多種，其中，唾液酸黏附素(Sialoadhesin，Sn)，又被稱為Siglec-1或者CD169，是一種巨噬細(xì)胞限制的Ⅰ型跨膜糖蛋白，屬于唾液酸凝集素受體家族[2-3]。豬源Sn是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)入侵宿主的特異性細(xì)胞受體之一[4]，PRRSV與Sn受體的結(jié)合增強(qiáng)了病毒向細(xì)胞表面的聚集，然后由網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞[5]。由于Sn受體在PRRSV感染宿主過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，使其成為了抗PRRSV藥物研究的重要靶點(diǎn)。

早期研究表明，利用完整的靶細(xì)胞或者靶細(xì)胞膜免疫小鼠可篩選出能夠阻斷病毒結(jié)合的抗體。在研究PRRSV與巨噬細(xì)胞互作的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)2個(gè)肺泡巨噬細(xì)胞特異性單克隆抗體(mAb41D3、mAb41D5)能夠阻斷PRRSV的感染[6]。因此，分離純化細(xì)胞表面的病毒受體分子，再制備針對(duì)受體的單克隆抗體，通過(guò)特異性單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)性阻斷病毒與受體的結(jié)合，是開發(fā)抗病毒藥物的重要策略之一[7]。由于病毒受體分子在細(xì)胞表面豐度較低，其占比不足細(xì)胞膜總蛋白的萬(wàn)分之一，并且多為整合蛋白的形式包埋于脂質(zhì)雙層膜中，因此直接分離純化受體分子的可操作性不強(qiáng)[8]。以豬源Sn受體為例，其完整的分子結(jié)構(gòu)包含17個(gè)結(jié)構(gòu)域，又可分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)3個(gè)部分，其中胞外區(qū)具有免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)的區(qū)域是病毒結(jié)合位點(diǎn)[9]。利用基因工程方法表達(dá)Sn受體胞外區(qū)蛋白分子，用于制備特異性抗體是值得嘗試的途徑。

納米抗體是一種新型的基因工程抗體，因其天然缺失輕鏈，分子大小為納米級(jí)，故被稱為納米抗體[10]。相比傳統(tǒng)抗體而言，納米抗體因其分子量小、穩(wěn)定性強(qiáng)、親和力高、組織穿透力強(qiáng)、易于生產(chǎn)和制備等諸多優(yōu)勢(shì)，在疾病診斷、治療和預(yù)防領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[11]。因此，本研究通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備Sn受體胞外區(qū)作為目標(biāo)分子，利用T7噬菌體展示的納米抗體文庫(kù)中對(duì)其進(jìn)行親和篩選，以獲得特異性結(jié)合Sn受體的納米抗體分子，旨在為后續(xù)開展抗病毒活性研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌株與載體：DH5a、BL21-DE3大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)于諾唯贊公司；納米抗體T7噬菌體展示文庫(kù)、pET-30a(+)載體由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。主要試劑：限制性內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶均為寶生物公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，購(gòu)自天根公司；HisTrap HP層析柱，購(gòu)自美國(guó)GE公司；其余試劑均為分析純。主要儀器：臺(tái)式離心機(jī)，購(gòu)自美國(guó)Beck-man公司；BTX電轉(zhuǎn)化儀、PCR儀，購(gòu)自寶生物公司；Geldoc-It Imaging System，購(gòu)自美國(guó)UVP公司。

1.2 重組表達(dá)載體pET-30a-Sn4D的構(gòu)建

參考GenBank中上傳的豬源Sn序列，并根據(jù)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，由金斯瑞公司合成Sn受體4個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(Sn4D)基因序列，并在該基因序列的上下游分別添加NdeⅠ、XhoⅠ限制性酶切位點(diǎn)。利用上述酶切位點(diǎn)將Sn4D基因插入原核表達(dá)載體pET-30a(+)，雙酶切鑒定和測(cè)序分析，將鑒定正確的重組載體命名為pET-30a-Sn4D并導(dǎo)入BL21-DE3感受態(tài)細(xì)胞，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Sn4D蛋白的表達(dá)與純化

挑取攜帶重組表達(dá)載體pET-30a-Sn4D的大腸桿菌單菌落，37 ℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)，次日按1 ∶100比例轉(zhuǎn)接新鮮LB(Kan+)培養(yǎng)液，37 ℃搖床培養(yǎng)至菌液D600 nm=0.5，加入IPTG終濃度為0.5 mmol/L，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h，收獲細(xì)菌，SDS-PAGE鑒定Sn4D蛋白表達(dá)情況。利用HRP Anti-6X His Tag抗體，Western-blot鑒定純化蛋白的反應(yīng)活性。根據(jù)HisTrap HP說(shuō)明書，純化目的蛋白，經(jīng)NanoDrop測(cè)定蛋白濃度。

1.4 納米抗體文庫(kù)篩選Sn4D特異性結(jié)合抗體

取10 μL純化的Sn4D蛋白(100 μg/mL)加入到900 μL NaHCO3(1 mol/L，pH值=8.6)包被緩沖液中，100 μL/孔包被酶標(biāo)板，放置4 ℃過(guò)夜。次日，PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板1次，加入5% BSA封閉液，37 ℃封閉2 h，PBST緩沖液洗板3 次。用包被緩沖液調(diào)整納米抗體T7噬菌體展示文庫(kù)至1×1011PFU/mL 濃度，每孔加入100 μL并于37 ℃孵育1 h，使納米抗體與Sn4D蛋白充分作用?；厥辗磻?yīng)溶液，PBST洗滌酶標(biāo)板10次，然后每孔加入 100 μL 1% SDS溶液洗脫與靶蛋白結(jié)合的噬菌體。取10 μL洗脫產(chǎn)物經(jīng)雙層瓊脂夾心法測(cè)定噬菌體滴度，剩余洗脫產(chǎn)物加入至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期的BL21宿主細(xì)菌中進(jìn)行擴(kuò)增，直至宿主細(xì)菌完全裂解。PEG-NaCl 法回收擴(kuò)增的噬菌體，調(diào)整回收的噬菌體濃度，重復(fù)上述篩選步驟2次，每輪篩選逐步降低Sn4D蛋白包被量，同時(shí)增加PBST中Tween-20濃度，以獲得高親和力的納米抗體。利用公式：產(chǎn)出比=(洗脫噬菌體量/投入噬菌體量)×100%，計(jì)算每一輪篩選的得率。

1.5 陽(yáng)性噬菌體的鑒定

測(cè)定第3輪洗脫產(chǎn)物的滴度并從平板上隨機(jī)挑取72個(gè)單克隆噬斑，用T7噬菌體特異性引物T7 Select UP Primer 5′-G G A G C T G T C G T A T T C C A G T C-3′和T7 Select DOWN Primer 5′-A A C C C C T C A A G A C C C G T T T A-3′進(jìn)行噬斑PCR鑒定。挑選PCR陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送金斯瑞公司測(cè)序分析，用DNAstar軟件分析納米抗體氨基酸序列。

1.6 納米抗體與Sn4D結(jié)合的親和力、特異性測(cè)定

根據(jù)序列分析結(jié)果，選取展示不同納米抗體的噬菌體進(jìn)行培養(yǎng)，回收噬菌體擴(kuò)增產(chǎn)物，并統(tǒng)一調(diào)整濃度至1×1010PFU/mL。分別向包被Sn4D、BSA (50 ng/孔)酶標(biāo)板中依次加入100 μL噬菌體。37 ℃ 孵育1 h后，棄去反應(yīng)液，PBST洗滌酶標(biāo)板10次，然后每孔加入100 μL 1% SDS溶液洗脫與蛋白結(jié)合的噬菌體。雙層瓊脂法測(cè)定洗脫產(chǎn)物中噬菌體滴度，將Sn4D孔洗脫噬菌體量設(shè)為P、BSA孔洗脫噬菌體量設(shè)為N，計(jì)算P/N值，比較不同納米抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合的特異性及親和力強(qiáng)弱。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與蛋白表達(dá)

將人工合成的Sn4D基因插入原核表達(dá)載體pET-30a(+)構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-30a-Sn4D。由圖1可知，通過(guò)NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定切出約1 300 bp目的條帶，大小與預(yù)計(jì)相符合。序列測(cè)定結(jié)果顯示，插入的Sn4D基因片段序列完全正確，閱讀框無(wú)移碼。IPTG誘導(dǎo)攜帶重組表達(dá)載體的大腸桿菌。由圖2可知，SDS-PAGE檢測(cè)可見大小約50 ku的疑似Sn4D蛋白表達(dá)，通過(guò)超聲波破碎分析發(fā)現(xiàn)該蛋白主要以包涵體的形式存在。

2.2 Sn4D蛋白鑒定與純化

由圖3可知，將回收Sn4D包涵體通過(guò)變復(fù)性處理，然后經(jīng)HisTrap HP柱純化得到條帶相對(duì)單一的純蛋白(圖3-A)；Western-blot檢測(cè)顯示，目標(biāo)蛋白與HRP Anti-6X His Tag抗體呈現(xiàn)良好的反應(yīng)性(圖3-B)。將Ni柱純化回收的蛋白經(jīng)NanoDrop測(cè)定含量，并調(diào)整濃度至100 μg/mL，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 Sn4D特異性重組噬菌體篩選

將純化后的Sn4D蛋白作為靶分子并包被在固相載體上，使T7噬菌體展示的納米抗體與之結(jié)合。由表1可知，篩選過(guò)程中包被的靶分子用量逐輪降低，而洗滌液PBST中Tween-20含量逐漸升高，通過(guò)加壓篩選有利于獲得高親和的納米抗體分子。第1輪篩選產(chǎn)出比僅為0.072%，而第2輪篩選則提高到1.27%，第3輪進(jìn)一步降低了投入噬菌體的量，但仍有1.13%產(chǎn)出比，因此經(jīng)過(guò)3輪篩選特異性結(jié)合Sn4D蛋白的噬菌體得到有效富集。

表1 親和篩選過(guò)程中噬菌體的富集

2.4 單克隆噬菌體的鑒定

納米抗體基因插入在T7噬菌體衣殼蛋白p10B基因下游，融合表達(dá)的衣殼蛋白在組裝成T7噬菌體頭部的同時(shí)將納米抗體展示于表面。通過(guò)PCR方法檢測(cè)插入位點(diǎn)的納米抗體基因。由圖4可知，攜帶納米抗體基因的噬菌體PCR可擴(kuò)增出約 750 bp 條帶，而未攜帶納米抗體基因的噬菌體僅擴(kuò)增出250 bp條帶。從第三輪洗脫產(chǎn)物中隨機(jī)挑選72個(gè)單克隆噬菌斑進(jìn)行PCR鑒定，共計(jì)鑒定得到63個(gè)攜帶納米抗體基因的噬菌體。 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，通過(guò)比對(duì)納米抗體氨基酸序列，獲得42個(gè)不同氨基酸組成的納米抗體。

2.5 納米抗體親和力、特異性檢測(cè)

選取40株展示不同納米抗體的T7噬菌體分別與Sn4D、BSA相作用。通過(guò)比較不同株噬菌體與Sn4D結(jié)合數(shù)量的多少，以此評(píng)價(jià)其展示的納米抗體分子與Sn4D結(jié)合能力的強(qiáng)弱；比較同一株噬菌體分別與Sn4D、BSA結(jié)合數(shù)量的比值，以此來(lái)判定其展示的納米抗體與Sn4D結(jié)合的特異性。由圖5可知，第9、24株噬菌體雖然能夠高親和力地結(jié)合Sn4D，但也能高效結(jié)合BSA(圖5-A)，因此其展示的納米抗體特異性較低(圖5-B)；第11、21、31株噬菌體僅與Sn4D有高親和力結(jié)合，而不與BSA結(jié)合，表現(xiàn)出良好的親和力與特異性。

3 討論

Sn受體由部分分化的巨噬細(xì)胞亞群表達(dá)，而豬源Sn受體僅存在于肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)上[12]，從細(xì)胞中直接分離、純化難度較大。因此，本研究中截取與病毒互作的Sn4D結(jié)構(gòu)域，并在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。雖然原核表達(dá)系統(tǒng)缺乏加工、折疊以及修飾等功能，但可快速制備高純度的靶標(biāo)蛋白，這可為納米抗體文庫(kù)的淘選奠定良好的基礎(chǔ)。

納米抗體是一種發(fā)現(xiàn)于駱駝科、鯊魚科的重鏈抗體，相比傳統(tǒng)抗體而言有著許多無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，在抗病毒研究中的得到廣泛應(yīng)用。Liu等以PRRSV相對(duì)保守的Nsp-9蛋白為靶標(biāo)，從噬菌體展示文庫(kù)中篩選出8株抗PRRSV Nsp-9蛋白的納米抗體，然后構(gòu)建MARC-145細(xì)胞系來(lái)穩(wěn)定表達(dá)活性最好的Nb6株納米抗體，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞系可以抑制PRRSV基因組復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，感染病毒后不出現(xiàn)病變[13]。本研究利用已構(gòu)建的羊駝納米抗體T7噬菌體展示文庫(kù)[14]，針對(duì)Sn4D蛋白開展3輪親和篩選，通過(guò)降低靶標(biāo)蛋白包被量、提高洗滌緩沖液中吐溫含量等手段，加壓篩選能夠高親和力結(jié)合Sn4D蛋白的納米抗體分子。由表1可知，產(chǎn)出比在逐輪升高，目的噬菌體得到了有效富集。由于納米抗體分子大約包含150個(gè)氨基酸，在T7噬菌體表面展示構(gòu)成一定的空間位阻，隨著次級(jí)文庫(kù)的反復(fù)擴(kuò)增，部分噬菌體克隆可能會(huì)出現(xiàn)納米抗體基因丟失的現(xiàn)象，因此需要對(duì)篩選產(chǎn)物中噬菌體單克隆進(jìn)行鑒定，以確定納米抗體分子的完整性。由圖4可知，約15%的噬菌體克隆丟失了納米抗體基因。

采用固相載體包被靶標(biāo)蛋白的方式進(jìn)行親和篩選，篩選體系中除了Sn4D靶標(biāo)蛋白，還有BSA封閉蛋白，因此洗脫產(chǎn)物中的噬菌體可能針對(duì)Sn4D和BSA同時(shí)進(jìn)行了有效富集，有必要分別測(cè)定單克隆噬菌體與Sn4D、BSA結(jié)合的特異性以及結(jié)合能力的強(qiáng)弱。由圖5可知，第9、24株噬菌體能夠同時(shí)高親和力地結(jié)合Sn4D、BSA蛋白，故其結(jié)合的特異性不強(qiáng)；而第11、21、31株噬菌體僅與Sn4D高親和力結(jié)合，顯示出良好的特異性。考慮到原核表達(dá)的Sn4D蛋白與PAM細(xì)胞表面的天然Sn蛋白存在構(gòu)象差異，因此仍需要制備PAM細(xì)胞，對(duì)篩選到的納米抗體分子做進(jìn)一步的親和力、特異性鑒定。

本研究通過(guò)構(gòu)建原核重組表達(dá)載體，制備高純度Sn4D受體蛋白作為靶標(biāo)，經(jīng)過(guò)3輪親和篩選成功獲得6株能夠高親和力、特異性結(jié)合Sn4D蛋白的納米抗體分子，為后續(xù)進(jìn)一步開展抗病毒活性研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。