張明輝，時(shí)曼麗

(南陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南南陽 473000)

氮素是小麥生長(zhǎng)發(fā)育過程中所需的最多的礦質(zhì)元素之一，氮素對(duì)保證小麥產(chǎn)收、品質(zhì)及成品風(fēng)味具有至關(guān)重要的作用[1]。然而在小麥田間生產(chǎn)中，施氮量與產(chǎn)量間存在閾值，近年來，氮肥的過量施用已成為小麥可持續(xù)化生產(chǎn)的瓶頸問題，其在造成環(huán)境污染的同時(shí)伴隨著小麥生產(chǎn)成本的增加[2]。小麥根系的氮素?cái)z取、同化能力與地上部氮素同化、轉(zhuǎn)運(yùn)以及氨基酸、蛋白質(zhì)的合成密切相關(guān)[3]。小麥對(duì)土壤氮的攝取能力一方面受土壤環(huán)境因素影響(例如土壤水分、氮濃度)，另一方面取決于植物自身的基因差異[4]。一般而言，耐低氮、氮高效品種可通過調(diào)控根系構(gòu)型、根系分泌物組成等策略增加植株對(duì)氮素的吸收量，且氮素代謝更旺盛、同化能力更強(qiáng)[5]。

鉬(Mo)是高等植物生長(zhǎng)發(fā)育的必需微量元素之一。在我國(guó)由于對(duì)鉬的功能缺乏認(rèn)識(shí)，缺Mo在酸性土壤中較為普遍，據(jù)相關(guān)報(bào)道大約4 450萬hm2的耕地處于輕度缺鉬狀態(tài)[12]。大量研究表明，Mo在植株光合作用、氮代謝、激素信號(hào)傳導(dǎo)和非生物脅迫中扮演重要作用，深刻影響著植物的生長(zhǎng)發(fā)育和生理代謝過程[13]。此外，Mo也是鉬輔因子生物合成的必需金屬元素，鉬輔因子是相關(guān)酶促反應(yīng)的重要元件，其可提高NR、NiR、GS等的活性，在氮素還原、同化及固定過程中發(fā)揮不可替代的作用[14]。以往的研究主要集中于植物對(duì)不同氮源的響應(yīng)，但關(guān)于施Mo與不同氮源下對(duì)冬小麥氮代謝及同化的影響鮮有報(bào)道?；诖?，本研究探索了Mo與氮形態(tài)對(duì)不同氮效率小麥葉片中氮代謝酶活性、氮轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)及氮同化產(chǎn)物的影響，以期為小麥的鉬肥施用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)于2021年11月至2022年2月在南陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院進(jìn)行。供試小麥品種為周麥28、洛麥34，品種篩選結(jié)果表明周麥28、洛麥34分別為氮高效、氮低效基因型[15]，兩者全生育期分別為231、230 d，來自河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所。種子采用0.5%次氯酸鈉進(jìn)行表面滅菌15 min，然后用去離子水沖洗數(shù)次并浸泡12 h，放置于鋪墊潤(rùn)濕濾紙的培養(yǎng)皿中，于28 ℃培養(yǎng)箱中暗處理催芽24 h。

供試土壤取自河南省南陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)附近原始土，土壤類型為偏酸性沙壤土。土壤經(jīng)風(fēng)干后混勻過3 mm網(wǎng)篩，土壤pH值為6.54，土壤有機(jī)質(zhì)含量為11.62 g/kg、全氮含量為0.89 g/kg、堿解氮含量為44.58 mg/kg、有效磷含量為13.52 mg/kg、速效鉀含量為62.96 mg/kg、有效鉬含量為 0.13 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

盆栽裝置為黑色方形塑料盒(長(zhǎng)×寬×高，20 cm×15 cm×15 cm)，每盆裝2.5 kg土。每盆施1.2 g純磷，磷、鉀肥施用比例m(P2O5)∶m(K2O)=12 ∶8，相關(guān)氮磷鉀肥皆采用水溶方式提前施入，并保持土壤75%的持水量平衡1周。每盆播入小麥種子10粒，出苗后減至5株。于拔節(jié)—抽穗期(168 d)采用根施方式施入Mo溶液，1周后盆栽收獲。種植期間不定時(shí)加入無菌水，其他管理措施同小麥作物培育方法。

1.3 樣品采集及測(cè)定分析

小麥根系含氮同化物包含游離氨基酸、可溶性蛋白，游離氨基酸含量參照GB/T 30987—2020《植物中游離氨基酸的測(cè)定》借助Nano Drop 2000 UV-VIS紫外分光光度計(jì)(Thermo，F(xiàn)isher，Waltham，MA，USA)采用茚三酮比色法測(cè)定。可溶性蛋白含量使用考馬斯亮藍(lán)G-250法，采用用分光光度計(jì)在 595 nm 處測(cè)定[18]。

1.3.2 小麥根系構(gòu)型測(cè)定 用自來水輕輕沖洗根部以去除沙土，將植株根系漂浮在有機(jī)玻璃托盤約1 cm深度的水中，并使用臺(tái)式掃描儀(EPSON Perfection V800 Photo，Japan)進(jìn)行掃描，使用WinRHIZO圖像分析系統(tǒng)測(cè)定根系總根長(zhǎng)、表面積、平均直徑和根尖數(shù)。

1.3.3 小麥根系氮素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)水平測(cè)定 采用TRIzol試劑盒(Invitrogen)對(duì)小麥根系進(jìn)行總RNA提取，使用DNaseI-Verso cDNA合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)構(gòu)建cDNA。使用ReverTra Ace qPCR RT Kit從總RNA合成第一鏈cDNA。實(shí)時(shí)PCR采用SYBR Green mix與 7500快速實(shí)時(shí)PCR序列檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行。以小麥TaActin為對(duì)照基因，相關(guān)氮代謝同化酶基因及氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的引物序列見表1。熱曲線反應(yīng)程序如下：95 ℃ 30 s、95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。對(duì)熔化曲線進(jìn)行分析，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以保證擴(kuò)增子質(zhì)量。具體反應(yīng)體系、反應(yīng)程序步驟參照Wang等的研究[19]，采用2-ΔΔCT斷層掃描方法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄豐度。

表1 氮代謝同化酶基因及氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因的qRT-PCR引物序列信息

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用IBM SPSS 19.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析(α=0.05)，采用Origin 2021進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉬與氮形態(tài)對(duì)不同氮效率冬小麥根系氮組分含量的影響

由表2可知，單一硝態(tài)氮處理和硝銨組合處理下，周麥28、洛麥34均表現(xiàn)為亞硝態(tài)氮含量<銨態(tài)氮含量<硝態(tài)氮含量，而在單一銨態(tài)氮處理下2個(gè)基因型小麥均呈亞硝態(tài)氮含量<硝態(tài)氮含量<銨態(tài)氮含量。在單一硝態(tài)氮處理和硝銨組合處理供應(yīng)條件下，與-Mo處理相比，+Mo處理均降低了2個(gè)基因型小麥的硝態(tài)氮含量，而周麥28比洛麥34變幅更大。然而，與硝態(tài)氮含量含量相比，Mo的施用增加了2個(gè)氮效率基因型冬小麥的亞硝態(tài)氮含量和銨態(tài)氮含量，這表明Mo在硝態(tài)氮同化途徑中起著重要作用。

表2 鉬與氮形態(tài)對(duì)不同氮效率冬小麥葉片氮組分含量的影響 μmol/g

2.2 鉬與氮形態(tài)對(duì)不同氮效率冬小麥根系氮代謝酶活性的影響

2.3 鉬與氮形態(tài)對(duì)不同氮效率冬小麥氮同化物含量的影響

2.4 鉬與氮形態(tài)對(duì)不同氮效率冬小麥根系構(gòu)型的影響

2.5 鉬與氮形態(tài)對(duì)不同氮效率冬小麥氮轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)的影響

3 結(jié)論與討論