胡祥祥，許 姣，2，宋夢瑤，2，朱畇昊，2

(1.河南中醫(yī)藥大學藥學院，河南鄭州 450046； 2.呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州 450046)

Ca2+作為第二信使，負責協(xié)調植物對內外界各種刺激的感知，在植物體內多種信號途徑傳導過程中起重要作用。鈣信號感應器識別Ca2+濃度變化，將信號傳遞至下游級聯(lián)系統(tǒng)，激活植物逆境響應機制。鈣依賴蛋白激酶(CDPK)是CDPK-SnRK超家族的主要成員[1]，廣泛存在于植物和一些原生生物中，具有典型的絲氨酸和蘇氨酸激酶結構域及EF-hand結構域，在植物生長和發(fā)育、激素信號傳導中發(fā)揮重要作用[2]。研究表明，CDPK在植物中主要以器官分布為主，且參與植物生長發(fā)育的大部分過程，如細胞骨架建成、氣孔運動、以及生物與非生物脅迫響應等[3-5]。此外，CDPK還參與植物細胞內其他的信號通路，如脫落酸(ABA)信號通路、茉莉酸信號通路、水楊酸合成途徑等等[6]。目前，已有研究對許多植物的全基因組水平進行CDPK及相關基因家族鑒定。

紅花(CarthamustinctoriusL.)是菊科紅花屬植物，一種重要的草本植物，以花入藥，有活血化瘀之功效。紅花種子含油率為20%～40%，平均亞油酸含量高于75%，素有“亞油酸之王”的美譽，同時還含有豐富的維生素和人體必需的氨基酸[7]。紅花喜歡溫暖、干燥的氣候，較一般植物有著較強的抗寒能力。但是紅花對栽培條件要求較高，抗旱怕澇，這也是目前影響紅花產業(yè)發(fā)展的一個重要因素。然而，對于CDPK基因家族是否介導紅花生長發(fā)育的調控目前尚無研究報道。

本研究通過對紅花全基因組數據庫的搜索，篩選出CDPK基因家族成員，通過構建系統(tǒng)進化樹、染色體定位、基因組比較等生物信息學方法，分析CDPK基因的進化關系，以期為探究紅花CDPK基因家族功能奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 紅花CDPK基因家族的鑒定

分別從紅花基因組數據庫(http：//safflower.scuec.edu.cn)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)數據庫TAIR (https：//www.ara‐bidopsis.org/)下載紅花的30個CDPK基因蛋白序列以及擬南芥21個CDPK基因的蛋白序列，進行本地BLASTp比對，得到最佳比對結果，通過Pfam 和CDD在線工具對得到的序列進行結構域確認，選擇同時含有CDPK蛋白典型結構域的蛋白序列，利用在線工具Expasy ProtParam對CtCDPK蛋白的分子量、等電點(pI)等進行分析。利用GPS-Lipid 網站預測N-豆蔻?；褪轷；奈稽c。利用CELLO V2.5網站預測紅花CDPK蛋白的亞細胞定位信息。

1.2 紅花CDPK基因家族染色體定位

利用 Perl 程序從紅花基因組注釋信息中獲取得到CtCDPK基因的染色體位置信息，之后利用MapChart軟件構建紅花染色體定位圖。

1.3 系統(tǒng)進化樹的構建與分析

利用從擬南芥數據庫TAIR下載21個AtCDPK蛋白序列，運用MEGA 7.0軟件，將下載的21個ATCDPK蛋白與鑒定得到的30個CtCDPK蛋白進行序列比對，通過鄰接法構建系統(tǒng)進化樹[8]。

1.4 基因結構和保守基序、保守結構域分析

根據紅花基因組注釋信息GFF文件中CDPK基因的外顯子和內含子位置信息，利用GSDS 網站(http://gsds.gao-lab.org/)繪制紅花CDPK基因結構圖。利用MEME在線網站(http://meme-suite.org/tools/meme)對紅花CDPK蛋白序列保守基序進行分析。

1.5 順式作用元件預測

利用TBTools提取紅花CtCDPK基因家族成員密碼子上游1 500 bp，然后提交到PlantCARE數據庫預測順式作用元件，然后利用GSDS網站繪圖。

1.6 蛋白互作網絡分析

將紅花CDPK蛋白序列導入STRING數據庫(https：//string-db.org/)，建立蛋白互作網絡(protein-protein interaction networks，PPI)，將結果保存為TSV文件，然后通過Cytoscape軟件將PPI網絡可視化。

1.7 紅花CDPK基因家族表達模式分析

從NCBI數據庫分別下載紅花3個部位：葉、花瓣、種子(PRJNA76135)上傳于2011年10月29日的高通量測序原始數據；5個時期：小芽期、中芽期、初花期、盛花期、爛花期(PRJNA774916)上傳于2021年10月27日的高通量測序原始數據，利用NCBI SRA Toolkit將測序數據sra文件轉換為fasta文件，利用轉錄組定量工具Kallisto計算TPM，將其作為基因表達量，利用Tbtools將結果可視化。

2 結果與分析

2.1 紅花CDPK基因家族的理化性質分析

根據鑒定篩選結果在紅花中共獲得30個CDPK基因家族成員，并依次命名為CtCDPK1～CtCDPK30(表1)。隨后通過對紅花CDPK蛋白基因家族進行分子量及等電點的理化性質分析，分析結果表明，其中最長的CtCDPK16編碼855個氨基酸，分子量為93 251.66；最短的CtCDPK12編碼418個氨基酸，分子量為47 781.96。30個CDPK蛋白家族等電點介于5.09～9.26之間，大部分蛋白等電點小于7。亞細胞定位結果表明，大部分成員定位在葉綠體和細胞質中，小部分定位在線粒體等其他地方。與此同時，大部分基因家族成員N端并沒有發(fā)現豆蔻?；Ｊ匦蛄形稽c，但是均有十六烷?；谋Ｊ匦蛄形稽c。

表1 紅花CtCDPK基因家族蛋白理化性質

2.2 染色體定位分析

由紅花CDPK基因在染色體上的位置分布(圖1)可知，CtCDPK基因在各條染色體上分布不均勻，除2號、4號染色體上沒有分布外，其余10條染色體上均有分布，在8號染色體上分布數量最多，有5條；在5號染色體上只分布1條。

2.3 系統(tǒng)進化分析

通過MEGA構建紅花與擬南芥CDPK基因家族進化樹。參照擬南芥CDPK分組情況，可將所有的CDPK基因分成6類(Ⅰ～Ⅵ)。第Ⅰ組家族成員最多，并且紅花CtCDPK家族成員主要集中在此家族，有8個擬南芥CDPKs和19個紅花CDPKs；第Ⅲ組的數量最少，包含1個紅花CDPKs(圖2)。

2.4 紅花CDPK基因家族結構特征

根據全基因組注釋信息中基因的內含子、外顯子信息，繪制紅花CtCDPK基因家族成員基因結構圖，結果(圖3-C)顯示，CtCDPK基因內含子數量在5～13個之間，外顯子數量在6～13個之間，含有內含子數最少的是CtCDPK12，含有5個內含子，內含子數量最多的是CtCDPK16，含有14個內含子，并且CtCDPK16所含外顯子數量也是最多的，為13個，同一亞家族的外顯子數量較為穩(wěn)定。在同一個基因家族中，含有共同motif的成員有可能功能相似，使用MEME在線軟件來識別它們的保守基序，結果(圖3-B)顯示，motif2、motif1、motif5、motif4、motif12、motif7、motif9存在于每個家族成員，這些motif構成了CDPK基因典型的結構域，motif3存在于除CtCDPK29外的每個家族成員；motif6存在于除CtCDPK4、CtCDPK18、CtCDPK1外的所有成員；同時，只有CtCDPK6、CtCDPK2和CtCDPK29不含motif8，且CtCDPK29也不含motif10，除此之外，CtCDPK12和CtCDPK13既不含motif10也不含motif11。同一亞家族的成員，結構相似。

2.5 順式作用元件分析

根據PlantCARE數據庫預測順式作用元件，GSDS網站的繪圖結果表明，在多數CtCDPK基因中出現頻率最高的順式作用元件是光響應元件，有25種，包括G-Box、G-box、Box 4、GT1-motif、TCT-motif、GA-motif、I-box等，由此推測CtCDPK在紅花響應光調控過程中發(fā)揮重要作用。此外還有脅迫響應元件、激素應答響應元件、生長發(fā)育響應元件，其中脅迫響應元件主要有厭氧誘導(ARE)、防御與應激(TC-rich repeats)、干旱誘導(MBS)、低溫響應(LTR)、損傷響應(WUN-motif)等5種，表明含有這些響應元件的基因可能會在受到脅迫的情況下提高植物的抗逆性，其中LTR主要存在于CtCDPK14中；WUN-motif只存在于CtCDPK11中；激素應答響應元件及生長發(fā)育響應元件出現頻率比較低，只能在少數CtCDPK基因中預測到。

2.6 紅花CDPK基因家族蛋白互作網絡

如圖5所示，紅花CDPK蛋白之間以及與其他如ABF1、OZS1、XLG2、ABF4等蛋白間存在較強的關聯(lián)，其中尤其是與XLG2蛋白關聯(lián)最強。根據互作網絡節(jié)點大小可以直觀地看出核心蛋白除上述關聯(lián)性較強的蛋白之外還有AT4G34150、CtCDPK28、CtCDPK21、CtCDPK23等。XLG2蛋白屬于G-alpha超家族，作為對觸發(fā)水楊酸 (SA) 途徑的病原體抗性的正調節(jié)劑。ABF1鑒定為與脫落酸反應元件結合的蛋白質，可能介導ABA反應的轉錄調控，屬于bZIP家族，能夠與rd29B基因啟動子的ABA反應元件特異性結合。擬南芥CDPK基因家族中的AT5G66210.1作為協(xié)調莖伸長和血管發(fā)育的發(fā)育控制調節(jié)劑，與之對應的CtCDPK1、CtCDPK4、CtCDPK16均有此作用。此外，CtCDPK19、CtCDPK23均與ABF4互作，作為鈣介導的脫落酸信號通路的調節(jié)劑。

2.7 紅花CDPK基因家族表達模式分析

根據Tbtools的結果(圖6)，對CtCDPK基因在3個不同組織部位中(種子、葉、花瓣)的表達模式進行分析，發(fā)現只有CtCDPK12未在任一組織中檢測到，大部分CtCDPK基因都可以在3種不同的組織中被檢測到。其他該家族基因的表達模式也不相同，一些CtCDPK基因在3個不同組織中都有著較高的表達量，如CtCDPK2、CtCDPK4、CtCDPK23、CtCDPK24，說明這些CtCDPK基因在紅花的生長發(fā)育過程中有著不可替代的作用，還有一些CtCDPK基因只在1種組織中表達，具有表達特異性，如CtCDPK18、CtCDPK27只在紅花花瓣中表達；此外，CtCDPK1、CtCDPK5和CtCDPK29只在葉和花瓣中表達，在種子中不表達，表明這3個基因家族成員調控紅花的葉和花瓣的發(fā)育，在紅花葉和花瓣的發(fā)育過程中有一定的調控作用，但還需要進一步研究其功能機制。

根據NCBI不同發(fā)育階段下的轉錄組數據對CtCDPK基因的表達量作圖(圖6-B)，發(fā)現CtCDPK12在初花期及腐爛花期均不表達，在其他的生長發(fā)育階段表達量比較低，而與此相反的是CtCDPK21、CtCDPK22、CtCDPK23、CtCDPK24這幾個基因家族的成員在紅花生長的任意階段，無論是小芽期、中芽期、初花期、盛花期、腐爛花期的表達量都普遍高于其他家族成員，說明這幾個成員對于調控紅花的整個生長發(fā)育階段有著比較重要的作用，CtCDPK25在腐爛花期-1階段的表達量明顯高于其他發(fā)育階段，說明它在該階段有特異性表達。

3 討論與結論

紅花作為一種常用的中藥材，主要含紅花黃色素、紅花甙、紅花多糖等，可用于治療閉經痛經、跌打損傷、心腦血管等疾病[9]，具有廣闊的發(fā)展前景。CDPK基因家族的身影在植物界中隨處可見，二倍體棉花基因組中鑒定出41個CDPK基因[10]，辣椒30個[11]，山核桃25個[12]，楊樹30個[13]，葡萄19個[14]。本研究從紅花基因組中鑒定出30個CtCDPK基因家族成員，進一步和擬南芥CDPK基因家族構建系統(tǒng)發(fā)育樹，共獲得了6個亞家族，6個亞家族的成員大部分定位于葉綠體，說明這些CtCDPK基因家族成員主要在葉綠體中和細胞質中發(fā)揮作用。對CtCDPK蛋白結構域進行分析，發(fā)現所有的CtCDPK蛋白均含有典型結構域Ser/Thr蛋白激酶區(qū)，該結構域也是CDPK蛋白的主要功能結構域[15-16]。

自然界中有許多基因或蛋白參與植物生長發(fā)育的調控，目前已有研究證明，熱激蛋白HSP101在非脅迫條件下會促進擬南芥開花，這種促進過程取決于與開花相關基因FLC及SVP基因的表達[17]。有關研究表明，牡丹PI基因能夠調控植物花器官的形成，牡丹中PsPI基因在生殖器官中的表達相對于營養(yǎng)器官來說是高表達的，花瓣中表達量最高[18]?；虻谋磉_模式可能與其功能特征相關，而CDPK基因在不同植物組織中、不同發(fā)育期表達量差異顯著，其中CtCDPK12在紅花的任意組織部位表達量為零，CtCDPK18和CtCDPK27具有表達選擇性，只在花瓣中有一定的表達量，在其他組織部位不表達，在有些植物中也存在這種情況，如玉米中的1個CDPK基因只在花粉中表達[19]。

相關研究表明，CDPK基因家族的成員主要參與植株生長和發(fā)育的調控，對矮牽牛在花粉期表達的2種CDPK基因PiCDPK1和PiCDPK2的研究發(fā)現，若二者均過量表達，則前者影響花粉管的生長極性；后者則抑制了花粉管的伸長能力[20]。進一步研究表明，在許多植物體內發(fā)現CDPK基因與抗氧化酶有密切的聯(lián)系[21]，酶在植物體內廣泛分布，參與植物的多種代謝途徑，研究結果表明，玉米體內CDPK的過量表達，能夠明顯提高超氧化物歧化酶和過氧化物酶的活性[22]，從而加快植物的代謝過程。此外，CDPK基因還能調節(jié)種子的萌發(fā)過程，在蓖麻(RicinuscommunisL.)種子早期發(fā)育過程中，RcCDPK2的表達量先上升后下降[23]。同時CDPK還參與對植物細胞骨架的調節(jié)以及對離子和水分跨膜轉運的調節(jié)等[24]。

CDPK基因編碼的蛋白質作為Ca2+感受器，貫穿植物的整個生命周期，參與植物體內的各種生命活動。本研究基于紅花基因組數據，共鑒定出30個CtCDPK基因，并通過生物信息學分析，明確30個CtCDPK基因家族成員的基本信息，包括進化關系、結構域及酰化位點、互作關系等，本研究結果為后續(xù)深入探究CtCDPK基因的功能提供了思路。