王怡民 李清華

桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 廣西神經(jīng)系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學研究中心 桂林醫(yī)學院廣西腦與認知神經(jīng)科學重點實驗室，桂林 541001

小分子熱休克蛋白（small heat shock proteins，sHSPs）是一類不依賴三磷酸腺苷（ATP）的分子伴侶，包括HSPB1、HSPB5、HSPB6、HSPB8等［1］。它的特征是在高度靈活可變的c端和不太保守無序的n端之間有80～100個氨基酸的保守序列，稱為晶體蛋白結(jié)構(gòu)域。晶體蛋白結(jié)構(gòu)域?qū)τ趕HSPs的二聚化和功能至關(guān)重要［2］。sHSPs 的單體分子量一般在10～42 kDa之間，但在自然狀態(tài)下，它們在不同的條件下形成12～32個亞基的低聚物。電子顯微鏡和X射線晶體學表明，這些低聚物形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)部空腔由對稱堆積的二聚亞基所組成［3］。像其他分子伴侶一樣，它們有一個高能力結(jié)合且未折疊的蛋白質(zhì)和促進底物復(fù)合的功能。它們保護細胞免受蛋白質(zhì)聚集的影響，但必須將容易聚集的客戶蛋白釋放到其他下游伴侶，以促進重新折疊［4］。與其他HSPs 相比，sHSPs底物結(jié)合和伴侶功能的機制還有待進一步研究。

凋亡是所有細胞的一種死亡形式，腫瘤細胞也包括在內(nèi)。腫瘤細胞凋亡的發(fā)生表現(xiàn)為細胞形態(tài)學的明顯變化，包括膜漂浮、核碎裂、細胞固縮和mRNA 衰變［5-6］。最后剩下的細胞被包裝成凋亡小體，在胞吐的過程中被吞噬細胞迅速清除［7］。腫瘤凋亡的標志性核心是半胱氨酸蛋白酶（caspases）的激活以及達到頂峰，它介導細胞內(nèi)重要蛋白質(zhì)的蛋白水解裂解。而死亡細胞到達凋亡執(zhí)行點的方式可以通過內(nèi)在和外在2種機制來實現(xiàn)［8］。近年來，國內(nèi)外有許多研究表示sHSPs 有可能通過凋亡途徑影響腫瘤的遷移增殖等一系列表型，以及可能對腫瘤的增殖產(chǎn)生抑制作用，本文將以上兩者關(guān)系予以綜述，以期對腫瘤的治療及研究方向給予參考。

HSPB1（HSP27）的概述與腫瘤凋亡

HSP27 是sHSPs 家族中研究較多的成員，在許多信號通路中發(fā)揮著重要作用，例如腫瘤的發(fā)生、治療抗性和抑制凋亡以及其他的通路中，和其他sHSPs 類似，它的存在也不依賴于ATP［9-10］。在一定條件下，它可以用來調(diào)節(jié)多種信號傳導途徑和細胞功能，這一般發(fā)生在磷酸化之后［11］。HSP27 在人類細胞中表達程度較為普遍，且在心肌、骨骼肌中高度表達［12］。HSP27 的表達在細胞生長、環(huán)境應(yīng)激條件（如熱誘導、氧化應(yīng)激）和癌癥中都會被上調(diào)［13-14］。

有研究者在A549 細胞（人肺癌細胞）的基礎(chǔ)上，用槲皮素（HSP27 抑制劑）、KRIBB3（HSP27 磷酸化抑制劑）和SB203580 與超氧化物或細胞毒劑共同作用，以上幾組都能增加caspase-9 和caspase-3 的裂解，而使用促凋亡劑處理后凋亡增加［15］。有文獻指出，用pCMV6-AC-HSP27、pCMV6-AC 轉(zhuǎn)染U2OS 細胞（人骨肉瘤細胞），并與Bufalin（50 nM）或不與Bufalin 孵化48 h，與對照組相比，過表達的HSP27凋亡率明顯下降［16］。為了觀察HSP27下調(diào)對細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響：Bax、Bcl-2 和PARP1，研究者觀察了光動力療法（PDT）后KB 細胞（人口腔表皮樣癌細胞）的蛋白表達水平。結(jié)果顯示，HP（5 μM）處理HSP27 siRNA 細胞后，Bax、PARP 水平下降［17］。通過將HSP27 或c-FLIP 基因的siRNA 轉(zhuǎn)染到人前列腺癌細胞（PC-3）中，在多梯度濃度的多沙唑嗪處理后，研究者發(fā)現(xiàn)，與非沉默細胞相比，TUNEL陽性細胞的數(shù)量都有所增加。而當他們同時將上述2 種基因轉(zhuǎn)染時，TUNEL 陽性細胞的數(shù)量增加更明顯［18］。眾所周知，TUNEL陽性細胞中會出現(xiàn)核濃縮和核碎裂，這是細胞凋亡的特征性表現(xiàn)。有研究者通過Hoechst 33258 染色檢測法檢測細胞凋亡來驗證HSP27下調(diào)對人鼻咽癌細胞（CNE1-IR 細胞）輻射的敏感性。結(jié)果顯示在6 Gy 輻照1 d后，轉(zhuǎn)染HSP27 反義寡核苷酸（ASO）的CNE1-IR 細胞與轉(zhuǎn)染SO 的CNE1-IR 細胞相比，前者的凋亡細胞更多。此外，轉(zhuǎn)染了HSP27 ASO 的CNE1-IR 細胞在輻照后的細胞比轉(zhuǎn)染了SO 的CNE1-IR 細胞存活率降低［19］。以上結(jié)果均可說明，HSP27 在腫瘤凋亡中可以影響相應(yīng)凋亡蛋白的表達，以及影響腫瘤細胞存活率，可以為后續(xù)研究提供更寬廣的方向。

HSPB5（αβ晶體蛋白）的表達與腫瘤細胞凋亡通路

目前研究表示，HSPB5 可以保護細胞免受不利條件的影響，調(diào)節(jié)與生存和壓力恢復(fù)有關(guān)的幾個細胞過程，如蛋白質(zhì)降解、細胞骨架穩(wěn)定和細胞凋亡［20-22］。在沒有壓力誘導的情況下，它也可以表達。在健康成年人及生物體的發(fā)育過程中也可被檢測到［23］。例如，在骨骼肌和心肌中，HSPB5的表達對于適當?shù)募」?jié)排列和線粒體結(jié)構(gòu)以及維持被動硬度和氧化還原平衡至關(guān)重要［23］。

有文獻指出，HSPB5 可以通過與半胱天冬酶-3 酶原（procaspase-3）的結(jié)合和抑制其自身蛋白裂解進而產(chǎn)生抗凋亡的作用，或與Bax 和Bcl-XS 結(jié)合，避免其轉(zhuǎn)入線粒體，從而有利于異常細胞增殖［24-26］。HSPB5 上調(diào)后通過與Bcl-2家族成員（如caspase-3、Bax和Bcl-XS）的直接相互作用以及Akt 和Raf/MEK/ERK 通路的組成性對細胞激活負向調(diào)控凋亡過程。CRYAB還被發(fā)現(xiàn)通過抑制Ras激活來抑制由鈣激活細胞介導的p53 依賴性細胞凋亡Raf/MEK/ERK 信號通路［27］。CRYAB還可以通過參與調(diào)節(jié)PKCalpha 和Raf/MEK/ERK 信號通路蛋白來阻斷UVA 細胞凋亡［28］。由于其抗凋亡作用，其也被認為是乳腺癌中的一種癌蛋白，因為它在凋亡抵抗中的作用可以解釋癌細胞的侵襲性［29］。更準確地說，磷酸化的HSPB5 與抗凋亡蛋白Bcl-2 相互作用，在抗癌藥物治療的細胞中可以增加凋亡。此外，在人腦膠質(zhì)母細胞瘤中，αβ 晶體蛋白在耐凋亡的侵襲性腫瘤細胞中高表達。在U-373MG中，抑制αβ 晶體蛋白的表達可使腫瘤細胞對放線菌素D誘導的凋亡敏感［30］。

HSPB6（HSP20）

HSPB6 屬于在生物體中表達普遍的sHSPs，在平滑肌、骨骼肌和心肌細胞中表達程度最高［31-36］。大鼠比目魚肌的HSPB6表達水平也有一定程度升高［37］。HSPB6的表達有可能與熱誘導關(guān)系不大，因此可能不依賴于熱休克因子（HSF）-1的作用。有試驗指出，把脊髓分離出去，去除神經(jīng)的支配，有可能導致大鼠比目魚肌、跖肌和長收肌中的HSPB6表達減少［34，37-39］。把大鼠的膀胱結(jié)扎掉之后，在其中也檢測到HSPB6 的變化，而這種變化與前者正好相反［40］。這表明，某些生理因素和試驗可以影響細胞內(nèi)的HSPB6水平。

有文獻報道，HSPB6 可以激活Huh-7 細胞的凋亡途徑并誘導凋亡。在caspase 信號的上游，有線粒體介導的系統(tǒng)，可以調(diào)節(jié)凋亡途徑，這其中就包括Bcl-2 家族［41］。Bcl-2 家族包括2 種與凋亡相關(guān)的蛋白，一種是促進作用，另一種與之相反。眾所周知，異硫氰酸熒光素是一種常用的熒光染料，可以與磷脂酰絲氨酸結(jié)合，這種物質(zhì)一般位于細胞膜內(nèi)側(cè)。在凋亡早期，這種物質(zhì)可以產(chǎn)生異位，從而來到細胞表面。而碘化丙啶只能對中晚期的凋亡細胞產(chǎn)生反應(yīng)。二者結(jié)合則可分辨出凋亡的時期。有文獻指出，與植入LLC細胞對照組的小鼠相比，對照組、即注射了HSPB6組的腫瘤細胞上Annexin V-FITC 的結(jié)合很少。而對照組在第14 天的結(jié)合率遠遠高于HSPB6組［42］。以上結(jié)果說明，HSPB6 可以對LLC 腫瘤產(chǎn)生影響，而且這種影響一部分是通過減少細胞凋亡來實現(xiàn)的。在接下來的增殖實驗、遷移實驗以及血管生長因子基因和蛋白定量實驗中，都取得了與之前實驗一致的趨勢。有文獻報道，將野生型HSP20 cDNA 轉(zhuǎn)染肝細胞癌（HCC）來源Huh-7細胞后，檢測了凋亡的相關(guān)指標。結(jié)果顯示高表達HSP20的Huh-7細胞與空載組相比，PARP 的裂解明顯增加，而前者的裂解一般提示細胞發(fā)生了凋亡程序，以上提示HSP20 誘導caspase 級聯(lián)導致細胞凋亡［43］。眾所周知，Bcl-2家族蛋白是線粒體介導凋亡的關(guān)鍵死亡調(diào)節(jié)因子［41］。以上實驗還顯示，HSP20 過表達細胞中的HSP20 蛋白與BAD、Bcl-2 或Bcl-XL 蛋白沒有免疫共沉淀，但與Bax 的結(jié)果卻相反，說明與后者可直接作用，而與前者卻沒有作用。

HSPB8（HSP22）的特點和腫瘤細胞凋亡

在所有sHSPs 家族中，HSPB8（也被命名為HSP22、H11、E2IG1）近年來尤其受到關(guān)注。HSPB8 在許多組織中都有表達，在人類骨骼肌和平滑肌、心臟及大腦中表達量較高。但在人類皮膚中，HSPB8卻在角質(zhì)細胞中表達，角質(zhì)細胞因此表現(xiàn)出長期的增長潛力［44］。其他的sHSPs 主要以包含其他sHSPs 伴侶的同質(zhì)或異質(zhì)多聚體形式存在，而HSPB8 主要以單體和二聚體的平衡混合物形式存在，這點是兩者的區(qū)別［45］。HSPB8 可以誘導促凋亡和抗凋亡信號，這點是相互矛盾的，而這取決于細胞類型以及蛋白的表達水平［46］。一般情況下，在壓力誘導以及細胞類型不同的情況下，HSPB8的表達程度不盡相同，且這種程度呈正相關(guān)。

有文獻報道，恢復(fù)HSPB8 通過激活新的轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β激活的激酶1（TAK1）依賴的死亡途徑可以導致黑色素瘤生長停滯和凋亡［47］。而Huh-7 細胞中HSPB8 蛋白的下調(diào)通過抑制PI3K/Akt/p70 S6激酶信號傳導明顯增強了TGF-α 誘導的細胞遷移，也表明HSPB8 在HCC 細胞遷移中的抑制作用［48］。有文獻指出，將轉(zhuǎn)染了HSPB8-siRNA1 和NC 的AGS 和BGC803 細胞進行Annexin V-FITC/7AAD 染色和流式細胞儀檢測，結(jié)果表明在AGS 和BGC-803 細胞系中，HSPB8敲除對早期凋亡影響不明顯，但晚期凋亡細胞的比例增加較多［49］。這表明敲除了HSPB8后，對以上細胞系的凋亡有明顯影響，且跟細胞的時期有關(guān)。HSPB8 在胃癌細胞系中是一種促增殖的蛋白，它也可以幫助胃癌細胞逃避凋亡對其的影響，在這點上，HSPB8的致癌作用與大多數(shù)其他sHSPs 成員基本一致。體外下調(diào)的HSPB8 表達抑制了乳腺癌細胞的增殖，而過表達的HSPB8 則能促進乳腺癌細胞增殖生長［50］。另有文獻指出，HSPB8 在黑色素瘤細胞系和原發(fā)性黑色素瘤組織中的表達水平高于正常黑色素細胞［51］。綜上，根據(jù)細胞類型和條件，HSPB8可能同時顯示抗凋亡和促凋亡活性。

總結(jié)與展望

癌癥是目前威脅人類健康的其中疾病之一，且目前沒有較為有效的治療手段。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，HSPs扮演著舉足輕重的角色，尤其是sHSPs。sHSPs 參與了腫瘤細胞多種機制，如細胞增殖、分化、侵襲等。由上所述，3 種sHSPs具有一定的抗凋亡功能，研究者認為敲減sHSPs可能會增加腫瘤細胞對凋亡的敏感性，從而對腫瘤的治療有一定的指導意義。目前關(guān)于sHSPs 與腫瘤凋亡之間仍有亟待明確的問題，例如：大部分用傳統(tǒng)的凋亡途徑解釋了問題，如Bcl-2 家族蛋白、Raf/MEK/ERK 信號通路等，是否存在其他途徑，如泛素化蛋白酶體途徑或自噬溶酶體途徑；大部分研究者是通過基因敲減或過表達來實現(xiàn)對蛋白的調(diào)控，是否有其他方法來實現(xiàn)蛋白的過表達，抗凋亡和促凋亡的細胞系之間是否有某種聯(lián)系等，這些問題都有待于進一步研究與探討?？梢灶A(yù)見的是，隨著研究的深入，不斷對上下游的機制進行探索，可能會發(fā)掘更多的聯(lián)系，以對腫瘤在凋亡方面的解釋更加明晰，從而提供一個在治療上的新思路和新策略。