倪海平 ,劉祥萍* ,霍宗利 ,李登昆 ,張 云

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京市疾病預(yù)防控制中心,南京 210003;2.江蘇省疾病預(yù)防控制中心,南京 210001)

尼古丁又稱煙堿,來源于自然界,當(dāng)pH 大于10時,主要以分子態(tài)存在[1]。尼古丁會使人心跳加速、血壓升高,大劑量攝入會引起嘔吐和惡心,嚴(yán)重時會致死[2]。尼古丁在進(jìn)入人體后,部分在肝臟中代謝為可替寧。食用菌中的可替寧為菌體內(nèi)源性代謝產(chǎn)物,其含量與尼古丁含量呈正相關(guān)[3]。2009年歐盟修訂鮮食用菌中尼古丁的最大殘留限量為0.036 mg·kg-1,引起人們對鮮食用菌中尼古丁含量的關(guān)注[4]。

目前,尼古丁和可替寧的檢測方法主要有高效液相色譜法[5]、毛細(xì)管電泳-紫外檢測法[2]、氣相色譜-質(zhì)譜法[6]、固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法[7]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4]等。由于食用菌種類繁多,基質(zhì)成分復(fù)雜,常規(guī)檢測方法難以達(dá)到測定要求。鑒于此,本工作采用丙酮結(jié)合Qu ECh ERS 試劑包提取目標(biāo)物,以二苯胺為內(nèi)標(biāo)[8],通過優(yōu)化色譜條件和質(zhì)譜參數(shù),提出了氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測定鮮食用菌中尼古丁和可替寧含量的方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

GCMS-TQ8050 NX 三重四極桿型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀;Sorvall LYNX6000型高速落地離心機(jī);QL-861型渦旋儀;XS-204 型電子天平;Milli-Q 型純水機(jī);0.45μm 聚四氟乙烯(PTFE)針式過濾器。

尼古丁和可替寧單標(biāo)準(zhǔn)溶液:1 000 mg·L-1。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:100.0 mg·L-1,準(zhǔn)確吸取尼古丁和可替寧單標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.00 mL 于10 mL容量瓶中,用丙酮定容,配制成尼古丁和可替寧質(zhì)量濃度均為100.0 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。使用時,用丙酮稀釋至所需質(zhì)量濃度。

內(nèi)標(biāo)溶液:2.0 mg·L-1,準(zhǔn)確稱取20.0 mg二苯胺,用丙酮溶解后定容至10 mL,再用丙酮逐級稀釋,配制成2.0 mg·L-1內(nèi)標(biāo)溶液。

二苯胺為美國化學(xué)會(ACS)級試劑;QuECh-ERS試劑包,含6 g 硫酸鎂和1.5 g 乙酸鈉,貨號5982-5755。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

DB-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25μm);載氣為氦氣,流量1.2 mL·min-1;進(jìn)樣口溫度280 ℃;進(jìn)樣壓力220 kPa;不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣時間1 min;進(jìn)樣量1μL。柱升溫程序:初始溫度50 ℃,保持1 min;以10 ℃·min-1速率升溫至140 ℃,保持1 min;以5 ℃·min-1速率升溫至210 ℃后,再以50 ℃·min-1速率升溫至280 ℃,保持1 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊離子(EI)源;離子源溫度25 ℃,接口溫度28 ℃;溶劑延遲時間8 min;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;其他質(zhì)譜參數(shù)見表1,其中“*”為定量離子對。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

稱取5.00 g樣品于50 mL離心管中,準(zhǔn)確加入丙酮5.00 mL和2.0 mg·L-1內(nèi)標(biāo)溶液25μL,渦旋1 min,加入Qu ECh ERS試劑包后再渦旋1 min,以12 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min,所得上清液經(jīng)0.45μm PTFE針式過濾器過濾,取濾液待測。以尼古丁、可替寧的保留時間以及離子豐度比定性,內(nèi)標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件、質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

采用文獻(xiàn)[9]報道的柱升溫程序(初始溫度50 ℃,保 持2 min;以30 ℃·min-1速率升溫至150 ℃,保 持1 min;以20 ℃·min-1速率升溫至220 ℃,保持5 min)分析50.0μg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和加標(biāo)樣品溶液(加標(biāo)量為0.5μg)。結(jié)果表明:混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和加標(biāo)樣品溶液中可替寧的出峰情況一致,保留時間為18.41 min;混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中尼古丁保留時間為6.13 min,但加標(biāo)樣品溶液中尼古丁色譜峰在6.10 min附近有干擾,并且離子豐度比與混合標(biāo)準(zhǔn)溶液不符。因此,試驗對柱升溫程序進(jìn)行優(yōu)化,使干擾物與目標(biāo)物完全分離。優(yōu)化后的柱升溫程序見1.2.1節(jié),上述加標(biāo)樣品溶液在此條件下的色譜圖見圖1。

圖1 加標(biāo)樣品溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of the spiked sample solution

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中尼古丁m/z84.10/82.10的離子對、可替寧m/z98.05/70.10的離子對響應(yīng)較高,但加標(biāo)樣品溶液中這兩個離子對均存在嚴(yán)重干擾,因此試驗選擇m/z162.10/84.10 和m/z176.10/98.10分別作為為尼古丁和可替寧的定量離子對。

2.2 提取條件的優(yōu)化

2.2.1 提取劑

試驗考察了66.7%(體積分?jǐn)?shù),下同)二氯甲烷溶液、乙腈、丙酮等3種提取劑的提取效果。結(jié)果表明:3種提取劑均能提取目標(biāo)物,但66.7%二氯甲烷溶液提取后溶液顏色較深,干擾物較多;乙腈結(jié)合QuECh ERS試劑包提取得到的目標(biāo)物色譜圖展寬,影響定量分析;而丙酮結(jié)合QuECh ERS 試劑包提取得到的溶液可以直接進(jìn)行檢測,且尼古丁回收率為81.9%,可替寧回收率為89.3%。因此,試驗選擇的提取劑為丙酮。

2.2.2 Qu ECh ERS試劑包

試驗考察了不同QuEChERS試劑包[①4 g硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸氫二鈉;②6 g硫酸鎂和1.5 g乙酸鈉]對加標(biāo)樣品中目標(biāo)物的提取效果。結(jié)果顯示:使用Qu ECh ERS 試劑包①時,尼古丁和可替寧的回收率均不大于40.0%;使用QuEChERS試劑包②時,目標(biāo)物回收率為96.7%～120%。可能是由于尼古丁和可替寧為弱堿性物質(zhì),乙酸鈉為提取溶液提供了弱堿性環(huán)境,在鹽析作用下目標(biāo)物被萃取至丙酮中。并且試驗發(fā)現(xiàn)在5.00 g樣品中加入6 g硫酸鎂和1.5 g乙酸鈉可充分除去提取溶液中的水分,以防止尼古丁溶于水。因此,試驗選用含6 g硫酸鎂和1.5 g乙酸鈉的Qu ECh ERS試劑包提取目標(biāo)物。

試驗還考察了QuECh ERS凈化包(含885 mg硫酸鎂、150 mgN-丙基乙二胺和15 mg石墨化碳黑)對提取溶液的凈化效果,發(fā)現(xiàn)該QuEChERS凈化包會吸附尼古丁,凈化效果不明顯。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)、工作曲線和檢出限

用空白提取溶液配制50.0μg·L-1基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照儀器工作條件測定該溶液和相同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。根據(jù)基質(zhì)效應(yīng)(ME)值＝目標(biāo)物在基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中的峰面積/目標(biāo)物在混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中的峰面積×100%計算ME值,結(jié)果得尼古丁ME值為156%,可替寧ME值為169%,表明存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。

用空白提取溶液和丙酮分別配制質(zhì)量濃度為5.0,10.0,20.0,50.0,100.0,200.0μg·L-1的基質(zhì) 匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。以目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo),二者峰面積比為縱坐標(biāo)繪制工作曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示:兩條曲線的線性范圍均為5.0～200.0μg·L-1;尼古丁和可替寧工作曲線的線性回歸方程為y＝0.030 79x＋0.030 80 和y＝0.047 34x＋0.002 130,相關(guān)系數(shù)為0.999 7和0.999 4;尼古丁和可替寧標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y＝0.025 22x-0.004 355 和y＝0.033 35x-0.009 486,相關(guān)系數(shù)為0.999 6和0.999 0。經(jīng)協(xié)方差分析,P值小于0.05,說明在5.0～200.0μg·L-1內(nèi)兩條曲線的斜率和截距均有差異,并且工作曲線斜率大于標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率,進(jìn)一步說明尼古丁和可替寧均存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。綜上分析,試驗選用工作曲線進(jìn)行定量分析。

分別以信噪比大于3和10計算檢出限和測定下限。結(jié)果顯示:尼古丁的檢出限為0.5μg·kg-1,測定下限為1.5 μg·kg-1;可替寧的檢出限為2.0μg·kg-1,測定下限為5.0μg·kg-1。

2.4 精密度和回收試驗

按照試驗方法對空白樣品進(jìn)行3個濃度水平的加標(biāo)回收試驗,每個濃度水平測試6個平行樣,計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表2。

表2 精密度和回收試驗結(jié)果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.5 樣品分析

采集南京市市售15份鮮食用菌,按照試驗方法進(jìn)行分析。結(jié)果表明,有13份樣品檢出尼古丁,檢出率為86.7%,檢出量為0.000 9～0.038 0 mg·kg-1,15份樣品均未檢出可替寧。

本工作以丙酮為提取劑,結(jié)合QuEChERS 試劑包提取尼古丁和可替寧,通過優(yōu)化色譜條件和質(zhì)譜參數(shù),提出了一種快速、簡便、穩(wěn)定的氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測定鮮食用菌中尼古丁和可替寧含量的方法。