樊亞光，朱盈蕊，榮劍鋒，李 琦，李杜娟

（鄭州市食品藥品檢驗所，河南鄭州 450000）

類固醇類激素在生理學中起著多種生物反應(yīng)的調(diào)節(jié)器作用，包括細胞代謝、炎癥、免疫功能、壓力管理、發(fā)育和生理學等。類固醇激素又稱為甾體激素，是由腎上腺皮質(zhì)、卵巢和睪丸中的膽固醇通過代謝途徑合成的，類固醇激素的產(chǎn)生或代謝異常是內(nèi)分泌疾病發(fā)生的原因，甾體激素失調(diào)會造成女性月經(jīng)失調(diào)、青春期提前、乳房提前發(fā)育等異?，F(xiàn)象；也會造成男性精子質(zhì)量下降等異常情況[1]。雌激素可造成機體免疫失調(diào)等病理反應(yīng)[2]。雌激素活性物質(zhì)主要分為內(nèi)源性雌激素和外源性雌激素，內(nèi)源性雌激素主要是人體和動物體自身分泌的激素，如雌醇、雌酮、雌二醇等[3]。

當前，動物源性食品中雌激素的檢測方法主要包括液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、免疫分析法等[4-5]。但是因為前體和代謝物結(jié)構(gòu)相似，且在生物樣品中濃度較低，很難同時確定多種雌激素，對日常檢測造成了不便[6]。常用的免疫分析法具有基質(zhì)干擾，與結(jié)構(gòu)相似的代謝物交叉激活的準確性不足，靈敏度不高，檢測范圍有限[7]等缺點。基于質(zhì)譜的色譜方法，如GC-MS/MS和LC-MS/MS，被認為是目前主流的檢測方法，但氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法需要衍生化步驟，使雌激素在氣相中揮發(fā)或增加電離性質(zhì)，但衍生步驟、非特異性質(zhì)譜裂解和結(jié)合雌激素的可能水解會損害樣品的通量和準確性，阻礙其在實際應(yīng)用中的實用性[8-9]。為了檢測復雜樣品中的低水平雌激素，進行UPLCMS/MS 檢測前的樣品制備至關(guān)重要。如今檢測已經(jīng)可以采用多種樣品制備技術(shù)，現(xiàn)有方法分析一次只能評估一種或兩種類固醇激素，而同時測量多種類固醇可節(jié)省極大的物料成本及時間成本。現(xiàn)有方法多采用正負離子相結(jié)合的方式，而本文開發(fā)和驗證了液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜的新方法，只采用正離子模式，無需任何衍生步驟，使用0.1%甲酸水和0.1%甲酸甲醇溶液作為流動相，通過Oasis PRiME HLB Cartridge 固相萃取柱純化樣品，深入研究了內(nèi)源性雌激素的檢測，通過不同前處理方法之間的比較，可以一次定量分析包括雌激素、孕激素、雄性激素等3 種內(nèi)源性激素及其衍生物。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑

甲酸（電子純，美國fisher 公司）；乙腈（色譜純，美國fisher 公司）；乙酸（色譜純，美國fisher 公司）；雌酮（Estrone、E1）、雌二醇（Estradiol、E2）、雌三醇（Estriol，E3），純度均大于97%，購自TRCCANADA 公司；實驗用水為超純水。3 種標準物質(zhì)信息見表1。

表1 3 種標準物質(zhì)信息

1.1.2 儀器

Waters?Xevo TQ-S 微串聯(lián)質(zhì)譜儀配電噴霧電離（ESI）源，Waters 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準儲備液的配制

使用十萬分之一天平準確稱取3 種雌激素及其衍生物各10 mg，分別加入到3 個10 mL 的棕色容量瓶中，使用適量甲醇溶解，再進行定容，搖勻，配成 1.0 mg·mL-1的標準溶液儲備液，-18 ℃避光存放。使用移液槍分別吸取3 種雌激素各0.1 mL，使用70%甲醇水定容至10 mL 容量瓶中，配制成10 mg·L-1的中間液，使用時根據(jù)需要配制成5 ng·mL-1、 10 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1和500 ng·mL-1的標準溶液。所有中間液避光存放在-18 ℃冰箱中。

1.2.2 樣品前處理

使用含0.1%甲酸的酸化乙腈對樣品進行提取，與陽性基質(zhì)樣品渦旋振蕩15 min，超聲提取 15 min，-4 ℃低 溫 離 心，10 000 r·min-1離 心 15 min，取上清液4 mL 凈化。凈化柱選擇Oasis PRiME HLB Cartridge。將上清液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱，重力過柱，收集濾液，直接過濾膜進樣。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

為了避免不同填料的色譜柱的影響，本研究選擇Waters?Acquity UPLC C18HILIC BEH（100 mm× 2.1 mm，2.1 μm）、Waters?Acquity UPLC C18BEH（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Waters?Acquity UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）3 種 色 譜 柱。經(jīng) 對 比 后 發(fā) 現(xiàn)，Waters?Acquity UPLC C18BEH （100 mm×2.1 mm，1.7 μm）分離效果最好。流動相A為含有0.1%甲酸的水溶液，流動相B 為含有0.01%甲酸的甲醇溶液，梯度洗脫見表2，柱溫40 ℃，流速：0.2 mL·min-1，進樣量10 μL。

表2 流動相條件

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），采用正離子快速切換掃描模式；毛細管電壓：3. 0 kV（ESI+）；錐孔電壓：35 V（ESI+）；錐孔氣流量：150 L·h-1；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：500 ℃；脫溶劑氣流量： 1 000 L·h-1；碰撞氣流速：0.18 mL·min-1；霧化氣壓力：0.7 MPa；采用多離子反應(yīng)監(jiān)控（MRM）掃描方式。質(zhì)譜優(yōu)化MRM 參數(shù)見表3。

表3 3 類內(nèi)源性雌激素的質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線

使用70% 甲醇水溶液將中間液配制成5 ～ 500 ng·mL-1的標準曲線，以峰面積（Y）為縱坐標，以濃度（X）為橫坐標，繪制標準曲線。結(jié)果顯示3 種內(nèi)源性雌激素及其衍生物在5 ～500 ng·mL-1線性良好。相關(guān)系數(shù)（R2）均≥0.990，檢出限為0.5 ～ 1.0 ng·mL-1，定量限為1.5 ～3.0 ng·mL-1，詳見表4。

表4 3 類內(nèi)源性雌激素及其代謝物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.2 回收率與精密度

為了評價該方法的有效性，測定了回收率和日內(nèi)精密度等參數(shù)。將高（70 ng·mL-1）、中（40 ng·mL-1）、低（10 ng·mL-1）3 個濃度的標準溶液加入空白陰性樣品，回收率為80.20%～105.92%，日間穩(wěn)定性（n=3）為4.7%～11.5%，詳見表5。這些結(jié)果表明，該方法所提供的穩(wěn)定性是合理的，適用于常規(guī)分析。

表5 3 類內(nèi)源性雌激素及其代謝物的加標回收率及相對標準偏差（n=3）

3 結(jié)論

本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了一種同時測定乳制品中3 種內(nèi)源性雌激素的檢測方法，無需衍生化和復雜步驟，選擇含0.1%甲酸的酸化乙腈為提取溶劑，Oasis PRiME HLB Cartridge 固相萃取柱凈化，使用含0.1%甲酸水溶液和含有0.1%甲酸甲醇溶液為流動相，得出的結(jié)果線性關(guān)系良好。本方法快速、便捷，應(yīng)用范圍廣，具有較高的靈敏度、選擇性和準確性，易于實現(xiàn)高通量處理，適用于乳制品中內(nèi)源性雌激素及其代謝物含量的分析。此外，該方法還有較強的擴展性，對于多種基質(zhì)中內(nèi)源性雌激素及其衍生物的檢測都具有可借鑒性，可進一步開展新的研究。