王紅陽，孫佳姿，劉清清，閆 婧，張?zhí)焐轮匾?/p>

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619；2.山西省針灸醫(yī)院，山西 太原 030006）

甲狀腺功能減退癥（甲減）是一種由甲狀腺激素含量不足導(dǎo)致的內(nèi)分泌疾病，涉及多個器官系統(tǒng)。甲減的發(fā)病率正逐漸升高［1］。甲減的發(fā)病原因復(fù)雜，與免疫及機體的碘含量［2］等多種因素相關(guān)。甲狀腺自身抗體是甲減發(fā)病的影響因素之一，其檢出率女性高于男性［3］，甲減的發(fā)病率女性較高也與此有關(guān)。甲減已被發(fā)現(xiàn)與多種疾病相關(guān)［4-6］。最新研究還發(fā)現(xiàn)甲減與新冠的病情預(yù)后存在相關(guān)性［7］。甲減的臨床治療多采用激素替代法。激素替代治療因個體差異大，藥量控制難［8］，且研究表明激素替代治療可增加甲減患者心血管疾病及骨質(zhì)疏松癥的患病風(fēng)險［9］。課題組前期研究表明麥粒灸可調(diào)節(jié)甲減大鼠海馬乙酰膽堿含量［10］、抑郁狀態(tài)［11］、調(diào)節(jié)免疫失衡［12］，本實驗進一步探究艾灸對甲減的可能干預(yù)機制。麥粒灸操作難度大，存在推廣局限。本實驗通過觀察西藥加溫和灸對甲減模型大鼠血清甲狀腺過氧化物酶抗體（thyroid peroxidase antibody，TPOAb）、甲狀腺球蛋白抗體（thyroglobulin antibody，TGAb）、白 細 胞 介 素4（interleukin-4，IL-4）、白細胞介素23（interleukin-23，IL-23），甲狀腺組織鈉碘共轉(zhuǎn)運體（na/I symporter，NIS）的含量，及甲狀腺組織NISmRNA 表達量，探究西藥聯(lián)合溫和灸對甲減的干預(yù)作用，及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康清潔級8 周齡SD 大鼠32 只（雌雄各半），體質(zhì)量（180±20）g，購自北京市昌揚西山養(yǎng)殖場，許可證號SCXK（京）2019-0010。溫度（25±1） ℃，濕度（48±2）%，光照12 h，自由飲食飲水。將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，隨機分為4 組，分別為：空白組、模型組、西藥組、西藥加溫和灸組，每組8 只。實驗操作經(jīng)山西省針灸研究所動物倫理委員會審批（批準(zhǔn)號：倫審科2020 第003 號）。

1.2 主要儀器

37 度 酶 標(biāo) 儀 Rayto RT-6100 450 nm 波 長 微 量高速離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司TG16W

臺式高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司 TGL16M 120 g/0.1 mg 電子分析天平 上海良平生產(chǎn) AE1204 電子分析天平 瑞士PRECISA生 產(chǎn) XB220A 細 胞 破 碎 儀 EasyWeLL 系 列JY98-IIIN 正置顯微鏡 OLYMPUS 公司CX41 恒溫烘箱 上海恒一科學(xué)儀器有限公司 低溫冷凍離心機上海盧湘儀離心機儀器有限公司 TG-16M 移液槍吉爾森P 型移液器公司 青浦瀘西儀器廠K30 電動勻漿機 FLUKO 公司 PRO200

1.3 主要試劑

大鼠白細胞介素23（IL-23）ELISA 試劑盒 WKSUbio 20210810 大鼠白細胞介素4（IL-4）ELISA 試劑盒 WKSUbio 20210710 大鼠免疫球蛋白G4 ELLSA 試 劑 盒 WKSUbio 20210826 大 鼠TSH ELISA 檢測試劑WKSUbio 20210623 大鼠FT3 ELISA 檢測試劑盒 WKSUbio 20210705 大鼠FT4 ELISA 檢測試劑盒 WKSUbio 20210705 石蠟 上海國藥集團 69018961 甲醛 上海國藥集團 10010018二甲苯 上海國藥集團 10023418 無水乙醇 上海國藥集團 10092680 30%H2O2 上海國藥集團10011218 廣譜二抗 上海長島生物技術(shù)有限公司D-3004 DAB 濃縮型試劑盒 上海長島生物技術(shù)有限公司FL-6001 蘇木素 廠家BASO 714094 中性樹脂wksubio PAB180017 PCR 試 劑 盒 SYBR Green Thermo #K0223 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 Fermentas #K1622氯仿 國藥集團 10023419 異丙醇 國藥集團80109218 Trizol invitrogen 1596-026 水合氯醛 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司 4%多聚甲醛 大連美侖生物技術(shù)有限公司

1.4 藥品

丙硫氧嘧啶片（上海復(fù)星朝暉藥業(yè)有限公司，H31021082，50 μg；規(guī)格：50 mg/片）；左旋甲狀腺素鈉片（德國默克公司， H20140052；規(guī)格：50 μg/片）

1.5 造模

參考劉洲君［13］的造模，除空白組外其余各組均采用10% 丙硫氧嘧啶（PTU）溶液按10 mL/kg 體重的劑量每日灌胃，以制備甲減模型；每周記錄大鼠體重以調(diào)整灌胃劑量。灌胃4 周后尾靜脈取血，檢測各組大鼠血清中TSH、TT4 的值，與空白組相比其余組出現(xiàn)TSH 含量上升，TT4 含量下降，即可判斷為模型建立成功［14］。為維持大鼠甲減狀態(tài)，造模成功后除空白組外的各組依然用PTU 溶液灌胃，頻率改為隔日一次直到實驗結(jié)束。

1.6 干預(yù)措施

空白組：不做處理。

模型組：與西藥加溫和灸組同方式，同頻率固定。

西藥組：左甲狀腺素鈉混懸液60 μg/kg 每日灌胃；與西藥加溫和灸組同方式、同頻率固定。

西藥加溫和灸組：左甲狀腺素鈉混懸液60 μg/kg 每日灌胃。固定大鼠，參照《實驗針灸學(xué)》［15］，取大鼠的大椎、命門、脾俞、腎俞，溫和灸以上各穴，艾條垂直于穴位上2-3 cm 每穴灸10 min，治療每6 日休息1 日，共治療4 周。

1.7 數(shù)據(jù)收集

末次干預(yù)后大鼠禁食不禁水24 h，以10%水合氯醛按3.5 mL/kg 體重腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，靜置1 h，3000 rp/min 離心機中離心10 min，取上層血清封存后，于-80℃冰箱中保存，待測。

大鼠處死后，割開頸部皮膚，剝離頸部肌肉及筋膜組織，暴露甲狀腺，取左側(cè)甲狀腺組織于10%多聚甲醛溶液中，常溫保存；右側(cè)甲狀腺組織，于凍存管中-80℃冰箱保存，待測。

1.8 指標(biāo)檢測

1.8.1 血清中相關(guān)指標(biāo)測定 將大鼠血清按ELISA 試劑盒要求逐步檢測，最終檢測450 nm 波長處的OD 值，檢測各組大鼠血清中TSH、TT4、TGAb、TPOAb、IL-4、IL23 含量。

1.8.2 甲狀腺組織中NIS 免疫組化測定 于10%多聚甲醛中取出甲狀腺組織，經(jīng)固定-洗滌與脫水-透 明-浸 蠟-包 埋-切 片 后，進 行 染 色，脫 蠟-水化-抗原修復(fù)-阻斷-封閉-PBS 清洗-脫水-透明-封片，鏡下圖像采集。

1.8.3 甲狀腺組織中NISmRNA 的基因表達測定具體操作方法如下：取出凍存管中的甲狀腺組織后，勻漿，反轉(zhuǎn)錄，擴增，引物序列見表1，觀察溶解曲線確定其特異性，以GAPDH 為內(nèi)參基因，空白組為對照組，用2-ΔΔCt計算相對表達量。

表1 PCR 引物序列Tab 1 Primer sequence of PCR

1.9 統(tǒng)計分析

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差齊采用單因素ANOVA 進行分析、兩兩比較用LSD 檢驗，方差不齊，用塔姆黑尼檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 西藥加溫和灸對各組大鼠甲狀腺功能的影響

干預(yù)前，與空白組比較，其余各組大鼠血清中TSH 含量上升，TT4 含量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；干預(yù)后，與空白組比較模型組大鼠血清中TSH 含量上升，TT4 含量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較西藥組及西藥加溫和灸組大鼠血清中TSH 含量下降，TT4 含量上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與西藥組比較，西藥加溫和灸組大鼠血清中TSH 含量下降，TT4 含量上升，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清中TSH、TT4 含量變化（n=8）Tab 2 Changes of serum TSH and TT4 contents of rats in each group（n=8）

2.2 西藥加溫和灸對大鼠甲狀腺自身抗體含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清中TPOAb、TGAb 含量上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較西藥組及西藥加溫和灸組大鼠血清中TPOAb、TGAb 含量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與西藥組比較，西藥加溫和灸組大鼠血清中TPOAb、TGAb 含量下降，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠干預(yù)前后血清中甲狀腺自身抗體含量（n=8）Tab 3 Serum thyroid autoantibodies in each group before and after intervention （n=8）

2.3 西藥加溫和灸對各組大鼠甲狀腺細胞因子表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清中IL-4 含量下降，IL-23 含量上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較西藥組及西藥加溫和灸組大鼠血清中IL-4 含量上升，IL-23 含量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與西藥組比較，西藥加溫和灸組大鼠血清中IL-4、IL-23 含量上升，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組大鼠血清中細胞因子含量變化（n=8）Tab 4 Changes in serum cytokine content of rats in each group （n=8）

2.4 西藥加溫和灸對各組大鼠甲狀腺組織中NIS含量的影響

NIS 的陽性染色呈棕黃色，主要分布于甲狀腺濾泡細胞胞膜上。圖片中空白組及西藥加溫和灸組染色較深，分布范圍廣，西藥組染色相對較淺，分布范圍廣；模型組染色淺，分布范圍。見圖1。

與空白組比較，模型組大鼠甲狀腺組織中NIS的含量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較西藥組及西藥加溫和灸組大鼠甲狀腺組織中NIS 的含量上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與西藥組比較，西藥加溫和灸組大鼠甲狀腺組織中NIS 的含量上升，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

表5 各組大鼠NIS 平均灰度值比較（n=4，±s）Tab 5 Comparison of average gray values of NIS in each group （n=4，±s ）

表5 各組大鼠NIS 平均灰度值比較（n=4，±s）Tab 5 Comparison of average gray values of NIS in each group （n=4，±s ）

注：與空白組比較，1）P＜0.01;與模型組比較，2）P＜0.01;與西藥組比較，3）P＞0.05。

IOD 值32.78±0.56 19.67±5.851）35.85±0.802）33.08±1.512）3）22.465 0.000組別空白組模型組西藥組西藥加溫和灸組FP

2.5 西藥加溫和灸對各組大鼠甲狀腺組織中NISmRNA 表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠甲狀腺組織中NISmRNA 的含量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較西藥組及西藥加溫和灸組大鼠甲狀腺組織中NISmRNA 含量上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與西藥組比較，西藥加溫和灸組大鼠甲狀腺組織中NISmRNA 含量上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表6。

表6 各組大鼠甲狀腺組織NISmRNA 相對表達量Tab 6 Relative expression of NISmRNA in thyroid tissue of rats in each group

3 討論

甲減的發(fā)病與多種疾病相關(guān)，其發(fā)病率的逐漸升高，對機體傷害較大。甲減還與妊娠及新生兒生長發(fā)育關(guān)系密切［16，17］。甲減的治療目前多針對其激素缺乏的病因采用激素替代治療。激素替代治療療效好，但依從性差［18］，且治療的藥物用量難以把控［19］，易增加副作用產(chǎn)生率。針灸治療甲減療效好［20］，優(yōu)勢明顯。艾灸對甲減的干預(yù)作用顯著，可有效解決激素替代治療中的問題。為甲減的臨床治療提供新的選擇。艾灸對于甲減的治療遵循中醫(yī)理論指導(dǎo)，從甲減脾腎陽虛的病機［21］角度出發(fā)，選用脾俞、腎俞、大椎、命門補益脾腎之陽。溫和灸操作簡單，易推廣。

免疫系統(tǒng)功能紊亂是甲減發(fā)病的原因之一。甲狀腺自身抗體含量上升是甲減發(fā)病的重要免疫系統(tǒng)表現(xiàn)。TPOAb 和TGAb 是甲狀腺的自身抗體，可抑制甲狀腺功能［22］。調(diào)節(jié)免疫是甲減的干預(yù)機制之一［23］。IL-4、IL-23 分別是Th2、Th23 產(chǎn)生的細胞因子。IL-4 的含量一定程度上可預(yù)測甲減的嚴重程度［24］。甲減發(fā)病與IL-23 含量變化相關(guān)［25］。甲 減 患 者 的IL-23/IL-23R/Th17 細 胞 軸 增 強［26］。研究結(jié)果顯示，西藥組及西藥加溫和灸均可降低大鼠血清中TSH、TPOAb、TGAb、IL-23 的含量（P＜0.01），升高TT4、IL-4 含量（P＜0.01），可見西藥及西藥加溫和灸組對甲減模型大鼠干預(yù)作用確切，可調(diào)節(jié)甲減模型大鼠的免疫因子含量，調(diào)節(jié)免疫平衡。

碘是甲狀腺激素合成的重要原料。甲狀腺細胞對于碘的攝取能力與甲狀腺激素的分泌直接相關(guān)。NIS 是碘向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的一種糖蛋白，甲狀腺細胞上碘的轉(zhuǎn)運依賴于NIS 實現(xiàn)。NIS 在甲狀腺組織中的含量，與甲狀腺激素的產(chǎn)生量正相關(guān)。甲狀腺組織中NIS 的含量與血清TGAb、TPOAb 含量存在相關(guān)性［27］。研究結(jié)果表明：西藥及西藥加溫和灸可促進甲狀腺組織中NISmRNA 的表達；且西藥加溫和灸組效果優(yōu)于西藥組（P＜0.05）。免疫組化結(jié)果進一步驗證了這一結(jié)論。說明西藥加溫和灸具有干預(yù)甲減模型大鼠，其增強甲狀腺組織中NISmRNA 表達的作用優(yōu)于西藥。

4 結(jié)論

西藥聯(lián)合溫和灸可以調(diào)節(jié)甲減大鼠的免疫系統(tǒng)，降低TPOAb、TGAb、及IL-23 的含量，升高IL-4的含量，促進甲減大鼠甲狀腺組織中NIS 的基因表達，增加NIS 的含量。這與炎性因子對NIS 具有調(diào)節(jié)作用的研究結(jié)果一致，IL-4 過表達的小鼠可代償由碘缺乏導(dǎo)致的甲減，IL-4 過表達小鼠的甲減可由補 碘 解 決［16］。這 可 能 說 明IL-4 與NIS 表 達 間 存 在雙向調(diào)節(jié)關(guān)系，有待進一步研究。另外在本實驗中研究發(fā)現(xiàn)西藥加溫和灸對甲減模型大鼠的干預(yù)作用更顯著，但其效果與西藥組相比并不明確，只在對NISmRNA 表達的促進上更加確定（P＜0.05），其原因可能與本實驗樣本量較小，或溫和灸刺激量小相關(guān)，有待進一步探究，以確定溫和灸與西藥是否具有協(xié)同作用。

作者貢獻度說明：

張?zhí)焐簩嶒炦M行設(shè)計；郝重耀：技術(shù)指導(dǎo)，文章審校；王紅陽，孫佳姿，劉清清，閆婧：負責(zé)藥物干預(yù)，指標(biāo)檢測，數(shù)據(jù)分析；王紅陽：執(zhí)筆撰寫論文。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。