熊志勇，王 磊，魏永春，馬文英

（北京理工大學(xué)珠海學(xué)院材料與環(huán)境學(xué)院，廣東珠海 519088）

0 引言

近年來，全球食品安全惡性事件頻發(fā)，成為影響公共健康的重要因素，食品安全問題越來越成為社會關(guān)注的熱點，其中，食源性致病菌是危害食品安全和人類健康的主要因素[1-3]。因食用水產(chǎn)品引起爆發(fā)性食物中毒也頻繁發(fā)生，水產(chǎn)品中常見病原菌檢測品種有副溶血弧菌、單增李斯特氏菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、沙門氏菌、大腸桿菌等。這些致病菌可引起劇烈嘔吐、腹瀉、頭痛、發(fā)熱，嚴重者常有脫水、全身痙攣、神志不清、血壓下降等休克癥狀而危及生命。因此，建立針對水產(chǎn)品中致病微生物的有效檢測體系，快速并且準確地完成對食品中致病菌的檢測已成為保障食品安全和防止疾病傳染的關(guān)鍵。

這些致病微生物常規(guī)檢測方法需要分離培養(yǎng)、生化試驗和血清學(xué)試驗等多個步驟，檢測周期長、操作繁瑣、靈敏度低，而且每次只能檢測出一種致病菌。其靈敏度也受雜菌干擾的一定影響，存在一定的假陰性，且無法對人工難以培養(yǎng)的病原微生物進行檢測，已遠遠不能滿足現(xiàn)代檢測要求。

隨著分子生物學(xué)發(fā)展，在分子生物學(xué)水平基礎(chǔ)上建立的檢測技術(shù)逐步成為食品中致病菌的檢測方法。如DNA 指紋圖譜、免疫捕獲、分型技術(shù)、菌落雜交、PCR、實時定量PCR、基因芯片等，也已經(jīng)顯示出它在食源性致病菌檢測方面的獨特優(yōu)勢。其中PCR 方法該技術(shù)具有高效、高產(chǎn)、低成本、速度快等優(yōu)點，有較好的可操作性，目前已在多種致病性微生物的檢測中得到應(yīng)用[4-8]。

針對水產(chǎn)品常見致病性微生物副溶血性弧菌耐熱溶血毒素tlh 基因及其毒力基因trh 和tdh 基因、單增李斯特菌溶血素hly 基因、沙門氏菌invA 基因和大腸桿菌O157 rfbe、stx 1 和stx 2 基因為靶基因設(shè)計引物，建立能快速同時一體化檢測該常見4 種致病性微生物的PCR 反應(yīng)體系。從特異性和靈敏度方面對該方法進行評價，并將其直接應(yīng)用于水產(chǎn)品樣品中進行的實際檢測。同時，也為PCR 技術(shù)應(yīng)用到其他致病菌的高效檢測奠定了一定的基礎(chǔ)，為開展病原菌的早期預(yù)警、監(jiān)測、分析和調(diào)查發(fā)揮積極作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

58 株標準菌株，武漢工程大學(xué)提供。包括金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、單增李斯特菌、沙門氏菌、大腸桿菌、小腸結(jié)膜炎耶爾森菌亞種和銅綠假單胞菌。

1.1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-75SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；ZHWY-2102 型雙層大容量全溫度恒溫搖床，上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品；HC-2518R 型高速冷凍離心機，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；DYY-6C 型電泳儀，北京六一儀器廠產(chǎn)品；Tocan240 型凝膠成像系統(tǒng)；TC-96HBPCR 型擴增儀，杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；UV-7504 型單光束紫外- 可見分光光度計，上海欣茂儀器有限公司產(chǎn)品；DS-1 型高速組織搗碎機，上海精科實業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 試劑與培養(yǎng)基

細菌基因組DNA 快速提取試劑盒（硅膠膜離心柱法）、Bst DNA 聚合酶、10×ThermoPol Reaction buffer、10 mmol/L dNTPs，廣州東盛生物科技有限公司提供；新鮮海帶，購于當?shù)爻小?/p>

副溶血性弧菌選擇性培養(yǎng)基，青島海博生物公司提供；大腸桿菌O157 選擇性培養(yǎng)基，CHROmagar公司提供；沙門氏菌選擇性培養(yǎng)基（SS），上?？婆d商貿(mào)有限公司提供。

單增李斯特菌選擇性培養(yǎng)基：蛋白胨15.0 g，酵母膏粉5.0 g，瓊脂15.0 g，氯化鈉5.0 g，色素2.3 g，抑制劑5.0 g，去離子水（平板） 1 L。

3%氯化鈉堿性蛋白胨水：氯化鈉5 g，硝酸鉀0.1 g，蛋白胨20 g，蒸餾水1 L，加熱溶解。

LB 肉湯液體培養(yǎng)基：LB 肉湯21 g，蒸餾水1 L，加熱溶解。

LB 肉湯固體培養(yǎng)基：1 L LB 肉湯液體培養(yǎng)基加15 g 技術(shù)瓊脂粉。

單增李斯特菌選擇性培養(yǎng)基、LB 肉湯、技術(shù)瓊脂粉，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)

稱取LB 肉湯21 g 溶于1 L 蒸餾水中，加熱溶解，分裝，于121 ℃下滅菌，得到基礎(chǔ)培養(yǎng)基備用。在超凈工作臺內(nèi)，按5%的接種量向已滅菌的培養(yǎng)基中加菌種母液，于37 ℃下以轉(zhuǎn)速150 r/min搖床培養(yǎng)12 h。

1.2.2 試驗菌株的篩選

將58 株標準菌株分別接種到副溶血性弧菌選擇性培養(yǎng)基、沙門氏菌選擇性培養(yǎng)基、單增李斯特菌選擇性培養(yǎng)基和大腸桿菌O157 選擇性培養(yǎng)基中，于37 ℃下靜置培養(yǎng)48 h，篩選出試驗所需4 種菌株。

1.2.3 DNA 模板的提取

（1） 試劑盒法。根據(jù)細菌基因組DNA 快速提取試劑盒說明書提取細菌基因組DNA。

（2） 水煮法。取過夜培養(yǎng)的菌懸液1 mL 加到1.5 mL 無菌離心管中，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離心2 min，盡量吸棄上清，加入50 μL 洗脫液TE，混勻后沸水浴5 min，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離心5 min，取上清-20 ℃下保存。

1.2.4 引物設(shè)計與合成

通過查閱相關(guān)文獻，檢索GenBank 數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/472320310） 中已公布的副溶血性弧菌tlh 基因、單增李斯特菌溶血素hly 基因、沙門氏菌invA 基因和大腸桿菌O157 rfbe、stx 1 和stx 2 基因序列，利用PrimerExplorer V4 引物設(shè)計軟件設(shè)計LAMP 引物，將2 條外引物F3、B3 用于試驗PCR 體系，并將設(shè)計好的引物與Genbank 數(shù)據(jù)庫中的核酸序列進行BLAST 比對，保證4 種食源性致病微生物引物的高度特異性。

3 種致病性微生物靶基因及其引物序列見表1。

表1 3 種致病性微生物靶基因及其引物序列

1.2.5 PCR 反應(yīng)體系建立

PCR 擴增體系選取50 μL，2×TaqPCRMasterMix（含染料） 25 μL，引物F 2 μL，引物B 2 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 19 μL。

由于選擇擴增目的片段小，擴增所需時間短，因此設(shè)定反應(yīng)程序：94 ℃，5 min；94 ℃～30 s，55 ℃～30 s，72 ℃～30 s，30 個循環(huán)；72 ℃，10 min。反應(yīng)結(jié)束后，用2%瓊脂糖凝膠電泳進行結(jié)果分析。

1.2.6 PCR 反應(yīng)特異性與靈敏度試驗

將1.2.2 篩選出的全部試驗菌株進行擴增反應(yīng)，添加相應(yīng)的引物。反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行分析，對該方法的特異性進行評價。同時，以水為模板作陰性對照。其中，溶血弧菌引物的測試菌株包括副溶血弧菌、大腸桿菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌共20 株；單核細胞增生李斯特菌引物的測試包括單核細胞增生李斯特菌、大腸桿菌、副溶血性弧菌、銅綠假單胞菌共20 株；沙門菌引物的測試菌株包括沙門菌、蠟樣芽胞桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌亞種共20 株；大腸桿菌引物的測試菌株包括大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌共20 株。

以副溶血性弧菌作為試驗菌株測定反應(yīng)體系的靈敏度，使用單束光紫外- 可見分光光度計測定其濃度，之后，以10 倍倍比稀釋DNA 原液至1×10-1～1×10-9，取各稀釋梯度DNA 溶液2 μL 作為擴增模板，進行LAMP 檢測。同時，以水為模板，作為陰性對照。

1.2.7 多檢測靶點同步PCR 試驗

在優(yōu)化PCR 反應(yīng)體系后，進一步開發(fā)針對8 個靶點同步檢測的一體化系統(tǒng)。通過將58 株標準菌株分別針對其8 個靶點在同一PCR 程序中進行擴增，PCR 儀為96 孔，一次可同時檢測12 株菌，以考查菌株一體化檢測特異性。

1.2.8 人工污染海產(chǎn)品樣品靈敏度試驗

以4 種菌株作為試驗菌株測定模擬樣品的靈敏度。海帶25 g 加入到3%氯化鈉堿性蛋白胨225 mL中，于DS-1 型高速組織搗碎機中勻漿約60 s，制成海帶勻漿。將待接種的菌液等梯度稀釋，無菌操作取1×10-1～1×10-9每個梯度稀釋純菌培養(yǎng)液1 mL 分別加入到9 mL 的海帶勻漿中混勻。人工污染的各稀釋梯度勻漿分別取1.0～1.5 mL 無菌離心管中，以轉(zhuǎn)速3 000 r/m 離心5 min，吸取上清液到另一支1.5 mL無菌離心管中，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離心5 min，盡量吸棄上清液，沉淀用0.9%無菌生理鹽水1 mL 重新懸浮，按1.2.2（2） 水煮法提取DNA，進行LAMP擴增。同時，以未染菌的海帶勻漿為模板進行擴增，作為陰性對照，并做平行試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗菌株篩選

經(jīng)過4 種選擇培養(yǎng)基的篩選，從58 株標準菌株中篩選出的目的菌株，副溶血經(jīng)弧菌8 株、李斯特菌10 株、沙門氏菌9 株及大腸桿菌6 株。挑選出供后續(xù)試驗。

2.2 特異性與靈敏度檢測

結(jié)果顯示，以tlh、tdh、trh 基因設(shè)計的副溶血性弧菌引物，對8 株副溶血性弧菌結(jié)果呈陽性，而對其他12 株對比菌株擴增結(jié)果呈陰性（見圖1）；以hly 基因設(shè)計的單增李斯特菌引物，對10 株單增李斯特菌擴增結(jié)果呈陽性，對其他大腸桿菌、沙門氏菌等對照菌株結(jié)果呈陰性（見圖2）；以invA 基因設(shè)計的沙門氏菌引物，對9 株沙門氏菌擴增結(jié)果呈陽性，對其他11 株對比菌株擴增結(jié)果呈陰性（見圖3）；對6 株大腸桿菌O157 擴增結(jié)果呈陽性，對其他14 株對比菌株擴增結(jié)果呈陰性（見圖4，圖中顯示為rfbe 基因擴增結(jié)果，stx 1、stx 2 擴增結(jié)果圖略）。針對4 種菌株的6 對引物對目的菌株檢出率為100%，對非目標菌株擴增結(jié)果均為陰性，研究結(jié)果表明，檢測方法特異性為100%。

副溶血弧菌特異性檢測結(jié)果見圖1，單增李斯特菌特異性檢測結(jié)果見圖2，沙門氏菌特異性檢測結(jié)果見圖3，大腸桿菌O157 特異性檢測結(jié)果見圖4。

圖1 副溶血弧菌特異性檢測結(jié)果

圖2 單增李斯特菌特異性檢測結(jié)果

圖3 沙門氏菌特異性檢測結(jié)果

圖4 大腸桿菌O157 特異性檢測結(jié)果

于37 ℃下過夜培養(yǎng)的副溶血性弧菌懸浮菌液，經(jīng)平板細胞計數(shù)得出，細胞起始菌落總數(shù)為2.07×108CFU/mL，以10 倍梯度進行菌液稀釋，用試劑盒DNA 提取法，對菌液進行DNA 提取，進行PCR 靈敏度檢測試驗。

PCR 靈敏度檢測結(jié)果見圖5。

由圖5 可知，當菌液菌落總數(shù)為2.07×102～2.07×108CFU/mL 時，都進行了PCR 擴增，菌落總數(shù)少于2.07×102CFU/mL 沒有PCR 擴增條帶產(chǎn)生，由于DNA 提取的體系是50 μL，其中只用2 μL作為PCR 反應(yīng)的模板，所以試驗方法建立的PCR 反應(yīng)體系的檢測靈敏度為8.28×101CFU/mL。

圖5 PCR 靈敏度檢測結(jié)果

2.3 多靶點同步PCR 檢測

利用PCR 儀，針對8 個靶點可一次同時檢測12 株菌。結(jié)果顯示該試驗選用的58 株標準菌株利用本試驗建立的PCR 程序同步檢出率為100%，表明建立的簡易PCR 體系，可用于多位點多菌株的同步檢測。在將來新一代324 孔PCR 儀中，將可能對40 個水產(chǎn)品的8 個靶點進行同步檢測，極大地提高檢測效率。

2.4 人工污染海產(chǎn)品樣品的靈敏度檢測

待接種的副溶血弧菌標準菌株ATCC 17802，經(jīng)平板計數(shù)，其菌落總數(shù)為4×107CFU/mL。取10 倍倍比稀釋1×10-1～1×10-91 mL 菌液接入9 mL 海帶勻漿中，混勻作為人工污染海產(chǎn)品樣品原樣，使得人工污染海產(chǎn)品樣品原樣中副溶血弧菌菌落總數(shù)為4×107CFU/mL（9 mL 海帶勻漿相當于1 g 海帶）。人工污染后，各取1 mL 海帶勻漿提取DNA，進行PCR 擴增。

人工污染副溶血弧菌水產(chǎn)品樣品PCR 靈敏度檢測見圖6。

圖6 人工污染副溶血弧菌水產(chǎn)品樣品PCR 靈敏度檢測

由圖6 可知，人工污染海產(chǎn)品樣品中菌含量為4×106～4×103CFU/mL 時，均發(fā)生擴增反應(yīng)，產(chǎn)生擴增片段，當菌落總數(shù)為4×102CFU/mL 時，不產(chǎn)生片段，擴增反應(yīng)不發(fā)生。因此，判定該法直接檢測 食品樣品中的副溶血性弧菌的檢測限為4×103CFU/mL。

待接種的單增李斯特菌標準菌株ATCC 19118，經(jīng)平板計數(shù)，其菌落總數(shù)為2.14×109CFU/mL。取10 倍倍比稀釋1×10-1～1×10-91 mL 菌液接入9 mL海帶勻漿中，混勻作為人工污染海產(chǎn)品樣品原樣，使得人工污染海產(chǎn)品樣品原樣中單增李斯特菌為2.14×109CFU/mL（9 mL 海帶勻漿相當于1 g 海帶）。人工污染后，各取1 mL 海帶勻漿提取DNA，進行PCR 擴增。

人工污染單增李斯特菌水產(chǎn)品樣品PCR 靈敏度檢測見圖7。

圖7 人工污染單增李斯特菌水產(chǎn)品樣品PCR 靈敏度檢測

由圖7 可知，人工污染海產(chǎn)品樣品中菌落總數(shù)為2.14×109～2.14×103CFU/mL 時，均發(fā)生擴增反應(yīng)，產(chǎn)生擴增片段，當菌落總數(shù)為2.14×102CFU/mL時，不產(chǎn)生片段，擴增反應(yīng)不發(fā)生。因此，判定該法直接檢測食品樣品中的副溶血性弧菌的檢測限為2.14×103CFU/mL。

待接種的沙門氏菌標準菌株ATCC 29269，經(jīng)平板計數(shù)，其菌落總數(shù)為8×107CFU/mL。取10 倍倍比稀釋1×10-1～1×10-91 mL 菌液接入9 mL 海帶勻漿中，混勻作為人工污染海產(chǎn)品樣品原樣，使得人工污染海產(chǎn)品樣品原樣中單增李斯特菌為8×107CFU/mL（9 mL 海帶勻漿相當于1 g 海帶）。人工污染后，各取1 mL 海帶勻漿提取DNA，進行PCR 擴增。

人工污染沙門氏菌水產(chǎn)品樣品PCR 靈敏度檢測見圖8。

圖8 人工污染沙門氏菌水產(chǎn)品樣品PCR 靈敏度檢測

由圖8 可知，人工污染海產(chǎn)品樣品中菌落總數(shù)為8×107～8×104CFU/mL 時，均發(fā)生擴增反應(yīng)，產(chǎn)生擴增片段，當菌落總數(shù)為8×103CFU/mL 時，不產(chǎn)生片段，擴增反應(yīng)不發(fā)生。因此，判定該法直接檢測食品樣品中的副溶血性弧菌的檢測限為8×104CFU/mL。

待接種的大腸桿菌標準菌株ATCC 43895，經(jīng)平板計數(shù)，其菌落總數(shù)為1.07×109CFU/mL。取10 倍倍比稀釋1×10-1～1×10-91 mL 菌液接入9 mL 海帶勻漿中，混勻作為人工污染海產(chǎn)品樣品原樣，使得人工污染海產(chǎn)品樣品原樣中單增李斯特菌為1.07×109CFU/mL（9 mL 海帶勻漿相當于1 g 海帶）。人工污染后，各取1 mL 海帶勻漿提取DNA，進行PCR 擴增。

人工污染大腸桿菌水產(chǎn)品樣品PCR 靈敏度檢測見圖9。

圖9 人工污染大腸桿菌水產(chǎn)品樣品PCR 靈敏度檢測

由圖9 可知，人工污染海產(chǎn)品樣品中菌落總數(shù)為1.07×109～1.07×103CFU/mL 時，均發(fā)生擴增反應(yīng)，產(chǎn)生擴增片段，當菌落總數(shù)為1.07×102CFU/mL時，不產(chǎn)生片段，擴增反應(yīng)不發(fā)生。因此，判定該法直接檢測食品樣品中的副溶血性弧菌的檢測限為1.07×103CFU/mL。

3 結(jié)論

常規(guī)的分離培養(yǎng)和生化鑒定耗時長，且靈敏度偏低，容易發(fā)生錯檢和漏檢，不利于食源性突發(fā)疫情的快速診斷處置。PCR 技術(shù)相比于傳統(tǒng)培養(yǎng)法和免疫學(xué)方法，如酶聯(lián)免疫吸附法、免疫熒光法等，其特異性更強、靈敏度更高、操作更為簡便快捷，已在食源性疾病病原檢測中得到廣泛應(yīng)用[9-10]。

針對水產(chǎn)品中常見的4 種致病性微生物副溶血性弧菌、單增李斯特菌和沙門氏菌和大腸桿菌O157進行研究，對其特異性高度保守基因設(shè)計引物，并進行多靶點同步PCR 檢測，結(jié)果表明，目標菌株擴增結(jié)果均為陽性，特異性為100%，且具有較高的靈敏度，基因組DNA 的檢測限約為8.28×101CFU/mL，直接對水產(chǎn)品樣品的靈敏度檢測分別為4×103CFU/mL、2.14×103CFU/mL、8×104CFU/mL 和1.07×103CFU/mL，同前人所用PCR 方法只對一種菌株進行檢測的靈敏度相近[11-12]，表明該方法具有較強的實用價值。

系統(tǒng)全面地分析了水產(chǎn)品中常見的4 種致病性微生物的PCR 檢測分析方法，對其特異性和靈敏度進行評價，并針對每種菌分別模擬真實食品體系，對該方法的實用性進行檢測；研究選取的擴增片段小，每個循環(huán)所需時間較短，每個PCR 擴增程序僅為30 s，且設(shè)計的8 對引物長度相近，因此可設(shè)定相同的PCR 退火溫度，所有目的菌株同時在相同PCR 程序下進行擴增，實現(xiàn)多種菌株一體化同步檢測；試驗結(jié)果表明，建立的該檢測方法具有很強的特異性和較高的靈敏度，且在食品體系檢測中也具有較高靈敏度，表明該方法具有一定實用價值；設(shè)計的8 對引物具有高度特異性和靶向性，可用于其他檢測方法對上述幾種菌檢測的參考引物；研究采用的靶點具有高度特異性，該靶點可推廣至其他檢測方法中應(yīng)用，如實時熒光定量PCR 檢測法、多重PCR 及環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP） 等方法[13-15]。

建立的快速檢測方法更加有利于實現(xiàn)一體化同步檢測，為快速檢測多種食源性致病性微生物提供了平臺，具有較強的實用意義和推廣價值，對于提高食品衛(wèi)生水平、保證食品安全和推動食品國際貿(mào)易發(fā)展具有重要的意義。