李靜， 黃輝， 武鵬， 孫維峰

（中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，廣東廣州 510010）

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是由于尿酸鹽沉積在軟骨、骨質(zhì)、滑囊、關(guān)節(jié)囊和其他組織中引起的炎性反應(yīng)[1]。目前，臨床上治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性期的藥物主要有秋水仙堿、非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素等[2]，然而，長期服用極易引起肝腎功能受損、胃腸道反應(yīng)，且癥狀反復(fù)發(fā)作[3]。而中醫(yī)藥因其價廉、效專、副作用少等優(yōu)點受到廣泛青睞[4]。復(fù)方土茯苓顆粒為本研究組孫維峰教授經(jīng)驗方研制而成的軍隊醫(yī)院非標準制劑，已獲得國家發(fā)明專利（專利號：ZL2007100323.3），該藥以利濕泄?jié)?、化痰祛瘀為治則，在臨床上使用10 余年治療高尿酸血癥及痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎間歇期具有較好的療效[5-6]。為進一步觀察復(fù)方土茯苓顆粒對痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的治療效果，為其臨床合理應(yīng)用提供參考，本研究以急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎兔模型為研究對象，觀察復(fù)方土茯苓顆粒的干預(yù)作用及機制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 56 只普通級雄性新西蘭兔，4 ～5 周齡，體質(zhì)量1.83～2.3 kg，動物質(zhì)量合格證號：0023116，購自青島康大生物科技有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）2012-0005。飼養(yǎng)在廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司實驗動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境為23 ℃、60%相對濕度、12 h 循環(huán)照明，自由進食和飲水。實驗方案經(jīng)廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司IACUC的同意和認可。

1.2 藥物與試劑 復(fù)方土茯苓顆粒（中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院生產(chǎn)，批號：140601）；秋水仙堿片（西雙版納藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號：150431）；痛風(fēng)舒膠囊（青海綠色藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：150101）。羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，江蘇永華精細化學(xué)品有限公司，批號：20120220）；尿酸鈉（美國Sigma公司）；硫酸多黏菌素B[格雷西亞（成都）化學(xué)技術(shù)有限公司]；兔抗白細胞介素（IL）-1β、IL-8 酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（大連泛邦化工技術(shù)開發(fā)有限公司）。

1.3 儀器 XT-2000iv型血液分析儀（日本希森美康株式會社）；ASP300S 全自動組織脫水機、EG1150H石蠟包埋機、RM2016切片機、HI1210攤片機、HI1220 烘片機、DM3000（ebp100-04-L 熒光）型生物顯微鏡、病理圖像分析系統(tǒng)DFC450+圖像采集軟件Leica Application Suite V4（德國Leica公司）；Elx808型酶標儀（美國BioTek公司）。

1.4 藥物制備 尿酸鈉，用生理鹽水配制成2.5%尿酸鈉溶液。硫酸多黏菌素B，用生理鹽水配制成10 U/mL工作液。參考《藥理實驗方法學(xué)》[7]，復(fù)方土茯苓顆粒成人臨床擬用量為每次1.5 g，每天2次口服，即3 g·d-1·人-1，按體表面積折算兔的等效劑量為0.14 g 藥粉（2.45 g 生藥）/kg。根據(jù)上述依據(jù)設(shè)定復(fù)方土茯苓顆粒低、中、高組劑量分別為0.14、0.28、0.56 g/kg，按體表面積等效劑量折算法折算，約相當(dāng)于成人臨床日擬用量（3 g）的1、2、4倍。設(shè)陽性對照藥物秋水仙堿劑量為0.093 mg/kg，按體表面積等效劑量折算法折算，約相當(dāng)于成人臨床預(yù)防日擬用量（1 mg·d-1·人-1）的2 倍。設(shè)陽性對照藥物痛風(fēng)舒膠囊劑量為0.336 g/kg，按體表面積等效劑量折算法折算，約相當(dāng)于成人臨床日擬用量（3.6 g·d-1·人-1）的2倍。復(fù)方土茯苓低、中、高劑量組，秋水仙堿組，痛風(fēng)舒組，分別用0.5%CMC-Na溶液適配制成濃度分別為0.028、0.056、0.112 g/mL，0.018 6 mg/mL，0.067 2 g/mL的混懸液。

1.5 動物分組、給藥與造模 將新西蘭兔隨機分為7組，分別為正常組、模型組、秋水仙堿組、痛風(fēng)舒組及復(fù)方土茯苓低、中、高劑量組，每組8 只。動物劑量根據(jù)成人劑量以體表面積換算法換算，給藥容積為5 mL/kg。各給藥組按設(shè)定要求灌胃給藥，正常組、模型組給予灌胃等體積的0.5%CMC-Na溶液，每日1次，連續(xù)9 d。第9天給藥后1 h，除正常組外，其余各組進行急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎造模，方法參考MeCarty 研究[8]：造模前用3%戊巴比妥鈉溶液麻醉兔，將兔左膝關(guān)節(jié)周圍脫毛并消毒皮膚，輕彎左膝關(guān)節(jié)后向關(guān)節(jié)側(cè)方進針，將2.5%尿酸鈉溶液0.4 mL（10 mg）和多黏菌素B 溶液0.1 mL（10 U/mL）注入關(guān)節(jié)腔，以對側(cè)關(guān)節(jié)囊鼓起為注入成功標準。每組分別在造模前（0 h）和造模后2、4、5 h，測量左膝關(guān)節(jié)同一部位的周長，測量3次，取平均值。

1.6 觀察指標與方法

1.6.1 關(guān)節(jié)液白細胞計數(shù)及IL-1β、IL-8 含量測定 以3%戊巴比妥鈉溶液麻醉放血處死動物，切取膝關(guān)節(jié)（脛腓骨上1/3段至股骨下1/3骨段，去除關(guān)節(jié)周圍的肌肉等硬組織，保留完整的關(guān)節(jié)囊），用0.9%氯化鈉注射液1 mL 灌洗關(guān)節(jié)腔，收集關(guān)節(jié)液，離心取上清液分裝于EP 管中，部分用于進行白細胞計數(shù)，其余上清液于-80 ℃保存。應(yīng)用血液分析儀測定白細胞數(shù)目。按ELISA 試劑盒說明書測定IL-1β 和IL-8 水平，使用酶標儀于450 nm 波長處測定吸光度值，繪制標準曲線，計算IL-1β、IL-8含量。

1.6.2 HE 染色法觀察滑膜組織病理學(xué)變化 將滑膜組織以多聚甲醛溶液固定后，3%硝酸脫鈣8 d，用0.1%氨水中和1 h，梯度乙醇脫水；二甲苯透明，石蠟包埋；切片后，用蘇木素和伊紅對切片進行染色；最后在顯微鏡下觀察并采圖。

1.7 統(tǒng)計方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。各組采用Student-T檢驗（配對T檢驗）與給藥前進行比較統(tǒng)計；各實驗組進行組間比較之前先進行組間方差分析（F檢驗）。當(dāng)組間方差齊同時，組間比較采用Student-T檢驗（非配對的T檢驗）進行統(tǒng)計；組間方差不齊時，采用校正的Student-T檢驗進行統(tǒng)計分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方土茯苓顆粒對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎兔左膝關(guān)節(jié)腫脹度的影響 表1 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組兔左膝關(guān)節(jié)腫脹度增加，造模后2 h腫脹度達到高峰（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組的左膝關(guān)節(jié)腫脹度得到不同程度減小，其中秋水仙堿組、痛風(fēng)舒組和復(fù)方土茯苓中、高劑量組造模后4 h膝關(guān)節(jié)腫脹程度明顯降低（P＜0.05）。表明復(fù)方土茯苓顆?？擅黠@緩解急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎兔膝關(guān)節(jié)腫脹。

表1 各組兔左膝關(guān)節(jié)腫脹度比較Table 1 Comparison of joint swelling in left knee among various groups of rabbits （，cm）

表1 各組兔左膝關(guān)節(jié)腫脹度比較Table 1 Comparison of joint swelling in left knee among various groups of rabbits （，cm）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組秋水仙堿組痛風(fēng)舒組復(fù)方土茯苓低劑量組復(fù)方土茯苓中劑量組復(fù)方土茯苓高劑量組造模后5 h 9.48±0.08 9.96±0.13①9.80±0.11 9.81±0.08 9.82±0.13 9.82±0.08 9.78±0.08兔數(shù)/只8888888造模前（0 h）9.52±0.13 9.44±0.05 9.48±0.04 9.48±0.08 9.50±0.09 9.46±0.08 9.50±0.08造模后2 h 9.46±0.05 10.19±0.15①9.86±0.11②9.98±0.19 10.03±0.20 10.00±0.17 9.90±0.16②造模后4 h 9.48±0.04 10.07±0.11①9.80±0.17②9.82±0.11②9.90±0.12 9.84±0.09②9.80±0.09②

2.2 復(fù)方土茯苓顆粒對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎兔關(guān)節(jié)炎癥的影響

2.2.1 各組兔關(guān)節(jié)液白細胞計數(shù)比較 圖1 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組關(guān)節(jié)液白細胞計數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組關(guān)節(jié)液白細胞計數(shù)未見顯著性差異（P＞0.05），但各給藥組白細胞計數(shù)均有降低的趨勢，以復(fù)方土茯苓高劑量組降低效果最明顯。

圖1 各組兔關(guān)節(jié)液白細胞計數(shù)比較Figure 1 Comparison of white blood cell count in joint fluid among various groups of rabbits（）

2.2.2 各組兔關(guān)節(jié)液炎癥因子IL-1β、IL-8 水平比較 圖2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組兔關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-8 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組兔關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-8水平明顯降低，其中，復(fù)方土茯苓高劑量組、秋水仙堿組、痛風(fēng)舒組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示復(fù)方土茯苓顆?？娠@著抑制急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎兔膝關(guān)節(jié)液中炎癥細胞因子的產(chǎn)生。

圖2 各組兔關(guān)節(jié)液炎癥因子IL-1β、IL-8水平比較（）Figure 2 Comparison of the levels of inflammatory cytokines IL-1β and IL-8 in the joint fluid among various groups of rabbits（）

2.3 復(fù)方土茯苓顆粒對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎兔滑膜組織病理學(xué)形態(tài)的影響 圖3結(jié)果顯示：正常組滑膜細胞呈扁平上皮樣，滑膜細胞層下未見炎細胞浸潤，深層纖維組織未見明顯異常；模型組可見大量炎細胞浸潤，并向深層組織蔓延，主要為淋巴細胞和嗜酸性粒細胞；秋水仙堿組及復(fù)方土茯苓中劑量組可見局部有一些炎細胞浸潤，少量向深層組織蔓延；痛風(fēng)舒組可見大量炎細胞浸潤，少量向深層組織蔓延；復(fù)方土茯苓低劑量組可見大量炎細胞浸潤，并向深層組織蔓延；復(fù)方土茯苓高劑量組可見少量炎細胞浸潤，未向深層組織蔓延。可見，秋水仙堿組、痛風(fēng)舒組及復(fù)方土茯苓高劑量組滑膜組織炎性細胞浸潤和增生較模型組均有不同程度的減輕，其中，復(fù)方土茯苓高劑量組改善效果最明顯。

圖3 各組兔滑膜組織病理學(xué)形態(tài)比較（HE染色，×100）Figure 3 Comparison of synovial histopathological morphology among various groups of rabbits（HE staining，×100）

3 討論

尿酸鈉致兔急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是經(jīng)典的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型。兔是解熱、抗炎試驗首選動物，白色兔的炎癥反應(yīng)較為劇烈，因此，本研究選用新西蘭兔。因藥理劑量的雌激素有抗炎與免疫的抑制作用，故選擇雄性動物進行試驗[9]。有研究[10]顯示，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是中性粒細胞介導(dǎo)的炎癥，中性粒細胞與內(nèi)皮細胞粘連是急性痛風(fēng)產(chǎn)生的本質(zhì)。體內(nèi)尿酸鈉晶體作用于血小板、中性粒細胞、滑膜細胞、單核細胞，刺激細胞釋放多種炎癥介質(zhì)引起痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，其中IL-1β、IL-8 作為炎癥趨化因子和激活因子在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[11]。本研究通過建立兔痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型主要是考察炎癥反應(yīng)情況，取兔關(guān)節(jié)腔灌洗液檢測白細胞和炎癥因子IL-1β、IL-8等炎癥因子指標，并觀察滑膜組織病理情況。因有必要排除由于內(nèi)毒素等因素引起的炎癥所造成的炎癥因子升高，而多粘菌素B是針對革蘭陰性菌的窄譜抗生素，主要用于局部給藥，如燒傷創(chuàng)面等，其全身吸收性差，口服不吸收，局部用藥對動物影響較小，因此，本研究選用多粘菌素B作為輔助抗生素添加[9]。

復(fù)方土茯苓顆粒是本院孫維峰教授根據(jù)嶺南地區(qū)高尿酸血癥患者的病機特點及臨床治療經(jīng)驗研制出的中藥制劑。方中土茯苓為君藥，健脾除濕，泄?jié)峤舛?，通利關(guān)節(jié)；萆薢助君藥分清泄?jié)?、祛風(fēng)濕，為方中臣藥；佐使藥王不留行活血通絡(luò)利水，山慈菇能清熱解毒、消癰散結(jié)，牛膝活血通經(jīng)、利尿通淋，引萆薢、土茯苓等藥到達下焦，從而瀉體內(nèi)痰濕瘀血等濁邪于體外。全方共奏利濕泄?jié)?、化痰祛瘀之功。該方降尿酸的療效已得到臨床及動物實驗的證實[12-15]。本課題組前期現(xiàn)究在細胞水平發(fā)現(xiàn)，復(fù)方土茯苓顆粒含藥血清可通過上調(diào)大鼠滑膜細胞miR-146a 的表達，抑制IL-1β/IL-6，從而緩解炎癥反應(yīng)[16]。為進一步探討復(fù)方土茯苓顆粒的抗炎作用，本課題組構(gòu)建了尿酸鈉誘導(dǎo)的急性兔痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，觀察其對炎癥反應(yīng)的影響。

本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組兔左膝關(guān)節(jié)明顯腫脹，關(guān)節(jié)液白細胞計數(shù)顯著升高，關(guān)節(jié)液IL-1β、IL-8水平顯著升高，滑膜組織病理學(xué)結(jié)果可見，膝關(guān)節(jié)囊內(nèi)滑膜表面及滑膜細胞下層炎細胞分布密集，主要為淋巴細胞和嗜酸性粒細胞，并向深層纖維組織蔓延的趨勢，表明痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎兔模型構(gòu)建成功。經(jīng)過預(yù)防性給藥后，秋水仙堿組和復(fù)方土茯苓高劑量組膝關(guān)節(jié)腫脹程度較模型組明顯降低（P＜0.05），復(fù)方土茯苓中、高劑量組關(guān)節(jié)液白細胞計數(shù)與模型組比較有降低趨勢，復(fù)方土茯苓高劑量組、秋水仙堿組、痛風(fēng)舒組兔關(guān)節(jié)液中IL-1β、IL-8水平較模型組明顯降低（P＜0.05），秋水仙堿組、痛風(fēng)舒組及復(fù)方土茯苓中、高劑量組滑膜組織炎性細胞浸潤和增生較模型組均有不同程度的減輕，其中，復(fù)方土茯苓高劑量組改善效果最明顯。表明復(fù)方土茯苓可一定程度地抑制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎兔的炎癥反應(yīng)，以高劑量效果最佳。在減低膝關(guān)節(jié)腫脹度方面，復(fù)方土茯苓顆粒的療效與秋水仙堿相當(dāng)，在抑制炎癥因子、減輕滑膜炎癥方面，復(fù)方土茯苓顆粒的療效與秋水仙堿和痛風(fēng)舒膠囊均相當(dāng)，而在減少關(guān)節(jié)液白細胞聚集方面，復(fù)方土茯苓顆粒的療效優(yōu)于秋水仙堿和痛風(fēng)舒膠囊。

綜上所述，復(fù)方土茯苓顆粒有一定的抗急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎作用，可明顯減輕急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎兔關(guān)節(jié)腫脹，降低關(guān)節(jié)液白細胞數(shù)量及IL-1β、IL-8水平，改善滑膜炎癥，以高劑量效果為最佳。