肖丹丹 喻雙雪 梁玉靈 羅 丹 王文軍 （西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，瀘州 646000）

肺癌是全球最多的惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占80%以上，根據(jù)組織學(xué)主要分為兩類：肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）和肺鱗狀細(xì)胞癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC），其中LUAD 為最常見(jiàn)的組織學(xué)亞型［1］。關(guān)于LUAD的新型治療方式越來(lái)越多，療效隨之提高，但肺癌的五年生存率為4%～17%［2］。因此，有必要通過(guò)多數(shù)據(jù)庫(kù)基因網(wǎng)絡(luò)探索治療LUAD 的新型靶點(diǎn)及尋找可以用于診斷及治療的新型標(biāo)志物。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，鐵代謝紊亂與肺癌的發(fā)生、發(fā)展、免疫逃避和耐藥性有關(guān)［3-5］。鐵是人體必需的微量元素，參與多種生理和細(xì)胞過(guò)程。此外，多種形式的細(xì)胞死亡（包括凋亡、壞死、鐵死亡等）也被證實(shí)與鐵水平有關(guān)［4-5］。

BOLA2 是BOLA 蛋白家族成員之一，作為鐵伴侶胞質(zhì)蛋白參與細(xì)胞內(nèi)鐵調(diào)控途徑及含鐵/硫簇蛋白（Fe/S 簇）的成熟，維持鐵穩(wěn)態(tài)［6-7］。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)BOLA2 在肝癌、卵巢癌中表達(dá)失調(diào)，并與患者預(yù)后密切相關(guān)［8-9］。BOLA2可能參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過(guò)程。然而，BOLA2在LUAD中的表達(dá)模式和作用尚未闡明。本研究采用多種數(shù)據(jù)庫(kù)初步分析BOLA2 在LUAD 中的表達(dá)及臨床意義，并探討 BOLA2 可能參與的通路及在免疫微環(huán)境中的作用，以期尋找新的治療靶點(diǎn)和新型診斷及預(yù)后標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 BOLA2 mRNA 差異表達(dá)分析 Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)用于分析BOLA2 在多種癌癥中的差異表達(dá)。本研究分析BOLA2 在LUAD 與相鄰正常組織中的表達(dá)差異。篩選條件如下：①Gene：BOLA2；②Analysis type： cancervsnormal analysis；③Cancer type：lung cancer；④P＜0.05；Fold change：＞1.5；Gene ranking：top 10%；data type：mRNA。

1.2 探討B(tài)OLA2 表達(dá)量與臨床特征的關(guān)系 本研究通過(guò)UALCAN 分析BOLA2 在LUAD 中的表達(dá)量及其與臨床特征（如年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期、TP53 突變等）的關(guān)系。同時(shí)，探討B(tài)OLA2 在LUAD中的蛋白表達(dá)和甲基化水平。

1.3 BOLA2 表達(dá)對(duì)LUAD 患者預(yù)后的影響 采用Kaplan-Meier 數(shù)據(jù)庫(kù)分析BOLA2 與LUAD 總生存期（OS）、無(wú)進(jìn)展生存期（FP）、進(jìn)展后生存期（PPS）的關(guān)系。將BOLA2表達(dá)情況以中位數(shù)為臨界值分為高、低表達(dá)兩組。同時(shí)多因素Cox 回歸分析再次認(rèn)證評(píng)估危險(xiǎn)比（HR）、95%可信區(qū)間（CI）和log-rankP值。

1.4 相關(guān)基因篩選及KEEG 通路分析 通過(guò)LinkedOmics 中的LinkFinder 模 塊，在TCGA LUAD隊(duì)列（LUAD，n=515）中，篩選與BOLA2 相關(guān)的正負(fù)表達(dá)基因，并進(jìn)一步利用LinkInterpreter 模塊分析KEEG 通路，選擇參數(shù)包括富集分析：KEEG pathway；錯(cuò)誤率 （FDR）＜0.05；模擬500次。

1.5 BOLA2 與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系 利用TISIDB數(shù)據(jù)庫(kù)中的Lymphocyte 模塊分析BOLA2 表達(dá)水平與各種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的關(guān)系，并展示與BOLA2表達(dá)顯著相關(guān)的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

2 結(jié)果

2.1 BOLA2 在LUAD 中的mRNA 表達(dá) Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明，共有314 個(gè)研究比較了BOLA2 在癌癥組織與正常組織中的表達(dá)差異，其中有83項(xiàng)研究表明BOLA2 在腫瘤組織中過(guò)表達(dá)，僅在7 項(xiàng)研究中低表達(dá)。16 項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織比較，肺癌組織中BOLA2 mRNA 均表達(dá)升高。進(jìn)一步分析BOLA2 在LUAD 的表達(dá)情況表明，共有8 項(xiàng)研究分析LUAD 與癌旁組織的BOLA2 mRNA 表達(dá)，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)BOLA2 在LUAD 中呈高表達(dá)（P=0.002）。如圖1、表1 所示，在多項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，LUAD 組織中BOLA2表達(dá)量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 BOLA2 mRNA在不同癌癥中的表達(dá)水平Fig.1 mRNA expression levels of BOLA2 in different types of cancers

表1 LUAD中BOLA2 mRNA的表達(dá)水平（Oncomine）Tab.1 mRNA expressions of BOLA2 in LUAD （Oncomine）

2.2 BOLA2 表達(dá)量與LUAD 患者臨床特征之間的關(guān)系 利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)研究BOLA2 與515 例LUAD 患者年齡、吸煙狀態(tài)、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及TP53 突變之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，BOLA2 較正常對(duì)照組而言，在LUAD 中呈高表達(dá)，與Oncomine 結(jié)果一致（圖2A、2B）。如圖2C，在年齡亞組分析中發(fā)現(xiàn)，中青年（21～40歲、41～60歲）的LUAD患者BOLA2 mRNA 表達(dá)量高于老年患者（61～80 歲、81～100 歲），說(shuō)明BOLA2 表達(dá)水平可能在中青年患者中更高（BOLA2 在年齡亞組中有232 例患者年齡資料未獲得）。BOLA2 與患者吸煙狀態(tài)之間也相關(guān)（圖2D），吸煙的LUAD 患者中BOLA2 表達(dá)量高于未吸煙及既往吸煙的肺癌患者（BOLA2在吸煙亞組中有19例患者吸煙狀態(tài)未獲得）。對(duì)于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，N0、N1、N2 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的BOLA2 表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組，在N3 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LUAD 患者中表達(dá)量最高（圖2E），提示BOLA2 可能與較差的臨床特征相關(guān)（BOLA2 在淋巴轉(zhuǎn)移亞組中有1 例患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移資料未獲得，另外11例患者無(wú)法評(píng)估有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）。無(wú)論TP53 是否突變，在LUAD 中，BOLA2 表達(dá)升高（圖2F），并在TP53 突變患者中表達(dá)更為顯著（BOLA2在TP53 亞組其中有3 例患者樣本沒(méi)有完整的外顯子組測(cè)序數(shù)據(jù)）。但在分期亞型中，各分期中BOLA2 表達(dá)量高于正常對(duì)照組，但各分期間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 BOLA2表達(dá)與LUAD患者臨床特征的相關(guān)性Fig.2 Relationship between BOLA2 expression and clinic characteristics in patient with LUAD

2.3 BOLA2蛋白表達(dá)及甲基化水平 通過(guò)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步分析，與正常肺組織相比，BOLA2蛋白表達(dá)水平在LUAD 仍呈高表達(dá)，見(jiàn)圖3A。與BOLA2 mRNA 過(guò)表達(dá)結(jié)果一致，說(shuō)明過(guò)表達(dá)的BOLA2 可能成為L(zhǎng)UAD 診斷的新型標(biāo)志物。在LUAD 患者中，BOLA2 基因甲基化水平較正常肺組織中升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖3B），BOLA2 在LUAD中高表達(dá)可能是異常甲基化所致。

圖3 BOLA2在LUAD患者中的蛋白表達(dá)和甲基化水平Fig.3 Protein expression and methylation level of BOLA2 in patients with LUAD

2.4 BOLA2表達(dá)量與LUAD患者生存期的關(guān)系 綜合上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LUAD 患者中，BOLA2 的mRNA和蛋白表達(dá)均高于正常對(duì)照組，進(jìn)而研究BOLA2表達(dá)量與719 例LUAD 患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示，高表達(dá)的BOLA2 可預(yù)測(cè)LUAD 患者較差的OS、FP 以及PPS（圖4）。本研究利用多因素Cox 回歸模型評(píng)估BOLA2 表達(dá)水平與LUAD 患者總預(yù)后的關(guān)系，納入腫瘤分期、性別、吸煙狀態(tài)等因素，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)的BOLA2 是LUAD 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P=0.000 5，HR=2.32，表2）。

圖4 BOLA2與LUAD患者生存期的關(guān)系Fig.4 Relationship between BOLA2 and survival of patients with LUAD

表2 肺腺癌患者預(yù)后的多因素分析Tab.2 Multivariate analysis of prognosis in patients with LUAD

2.5 相關(guān)基因篩選 如圖5 所示，在TCGA_LUAD數(shù)據(jù)集中，與BOLA2 共表達(dá)的顯著正相關(guān)基因共 6 004 個(gè)，負(fù)相關(guān)基因共7 153 個(gè)。據(jù)熱圖顯示，PPP4C、POP7、ROMO1、MRPS12、MRPL12 與BOLA2呈顯著正相關(guān)，KIAA1109 與BOLA2 呈顯著負(fù)相關(guān)。對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行KEEG 通路分析，結(jié)果表明，相關(guān)基因主要富集于核糖體、蛋白酶體、嘌呤嘧啶代謝、剪接體、DNA 復(fù)制、真核生物中的核糖體生物發(fā)生、碳代謝、谷胱甘肽代謝等通路過(guò)程，表明BOLA2 可能通過(guò)影響代謝通路、生物合成等過(guò)程，促進(jìn)LUAD 的發(fā)生、發(fā)展。

圖5 LUAD患者中BOLA2的共表達(dá)基因Fig.5 Co-expressed genes of BOLA2 in patients with LUAD

2.6 在LUAD 中BOLA2 表達(dá)量與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系 多種癌癥中發(fā)現(xiàn)鐵代謝與腫瘤免疫微環(huán)境密切相關(guān)，進(jìn)一步分析BOLA2表達(dá)與免疫細(xì)胞之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)BOLA2表達(dá)與多種癌癥微環(huán)境中的免疫浸潤(rùn)水平存在聯(lián)系。LUAD 患者中，BOLA2 表達(dá)水平與多種免疫細(xì)胞相關(guān)。如圖6 所示，BOLA2 表達(dá)與自然殺傷細(xì)胞（NK，RHO=-0.359，P=2.79e-17）、肥大細(xì)胞（Mast，RHO=-0.341，P=2.17e-15）、未成熟B 細(xì)胞（Imm_B，RHO=-0.289，P=2.72e-11）、效應(yīng) 記 憶CD4T 細(xì) 胞（Tem_CD4，RHO=-0.263，P=1.4e-9）呈顯著負(fù)相關(guān)。

圖6 BOLA2表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系Fig.6 Relationship between BOLA2 expression and immune cell infiltration

3 討論

在許多國(guó)家中LUAD 的發(fā)病率及病死率位于惡性腫瘤的前列，嚴(yán)重影響人類生活質(zhì)量及生命［1］。然而，LUAD 的傳統(tǒng)治療方式、靶向治療以及免疫治療尚未達(dá)到理想的療效，有必要探索新型的標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，多種癌癥（包括肺癌）中存在鐵代謝紊亂［3，10］。鐵是合成鐵硫簇（Fe/S 簇）的重要元素，而Fe/S 簇參與多種重要生物酶合成，這些酶在細(xì)胞呼吸、氧化代謝、核苷酸代謝、DNA 復(fù)制及修復(fù)等過(guò)程中起到重要的作用［11］。高濃度的鐵和含F(xiàn)e/S 簇的酶能顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［10］。鐵水平與Wnt、Myc 以及缺氧誘導(dǎo)因子等致癌及促癌信號(hào)通路相關(guān)［12］。研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC細(xì)胞中，高濃度鐵可通過(guò)干擾細(xì)胞氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)癌癥干細(xì)胞亞群形成，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移［13］。因此，癌細(xì)胞比正常細(xì)胞對(duì)鐵的依賴性更強(qiáng)。

鐵伴侶蛋白BOLA2 可與GLRX3 形成［2Fe-2S］橋接的異二聚體復(fù)合物，連接細(xì)胞中的亞鐵和鐵硫分配系統(tǒng)，是細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［5-6］。近年來(lái)，多項(xiàng)研究表明，BOLA2 表達(dá)與肺部疾病有關(guān)。在高空氣污染地區(qū)，BOLA2 表達(dá)與兒童哮喘之間存在關(guān)聯(lián)，并對(duì)比哮喘與非哮喘患者，氣道上皮細(xì)胞中BOLA2 有顯著差異性表達(dá)［14］。呼吸道合胞病毒感染人支氣管和小氣道上皮細(xì)胞后會(huì)上調(diào)BOLA2表達(dá)［15］。此外，BOLA2 在癌癥中也發(fā)揮著重要作用。BOLA2 可通過(guò)干擾P62-Keap1-Nrf2 通路，參與肝癌細(xì)胞自噬和氧化應(yīng)激過(guò)程，維持肝癌細(xì)胞增殖、侵襲［7］。BOLA2 也能促進(jìn)肝癌致癌基因Myc 的表達(dá)［16］。高表達(dá)的BOLA2 可預(yù)測(cè)肝癌伴腫瘤出血患者的不良預(yù)后。在卵巢癌中，BOLA2 呈過(guò)表達(dá)，與癌癥患者的較差臨床特征及預(yù)后顯著相關(guān)［7-8］。然而B(niǎo)OLA2 在NSCLC 中的作用機(jī)制及預(yù)后價(jià)值尚未闡明。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)BOLA2 在NSCLC 中的轉(zhuǎn)錄水平、預(yù)后價(jià)值和潛在作用進(jìn)行全面研究?；贠ncomine 和UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，BOLA2 在乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、前列腺癌等多種癌癥中均呈過(guò)表達(dá)，兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)相互驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，LUAD患者中的BOLA2 表達(dá)量均高于正常對(duì)照組，并與LUAD 患者的臨床特征相關(guān)。BOLA2 在吸煙、TP53突變、N3 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的LUAD 患者中表達(dá)升高。既往研究表明，上述因素已被證明是LUAD 不良預(yù)后的因素，說(shuō)明BOLA2 可能為L(zhǎng)UAD 的促癌基因［17-18］。從蛋白水平研究發(fā)現(xiàn)，111 例LUAD 患者的BOLA2蛋白表達(dá)水平高于正常對(duì)照組。另外，從基因甲基化水平發(fā)現(xiàn)，BOLA2 的甲基化水平較正常對(duì)照組明顯升高。既往研究發(fā)現(xiàn)，異常甲基化表達(dá)發(fā)生于腫瘤早期，并隨著腫瘤進(jìn)展而增加［19］。一項(xiàng)研究也表明，BOLA2 基因高甲基化水平與哮喘患者對(duì)激素的反應(yīng)性相關(guān)［14］。因此，BOLA2 甲基化修飾改變可能與LUAD 的起始、進(jìn)展相關(guān)。生存分析顯示，過(guò)表達(dá)的BOLA2 與LUAD 患者短的生存期顯著相關(guān)。綜上所述，在LUAD患者中，BOLA2在轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平均呈高表達(dá)，可能參與LUAD 的發(fā)生發(fā)展，是LUAD預(yù)后的一個(gè)不利因素。

進(jìn)一步探究BOLA2 在LUAD 中潛在的作用機(jī)制，使用LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫(kù)分析得到與BOLA2 呈顯著正相關(guān)的基因（如PPP4C、POP7、ROMO1、MRPS12、MRPL12 等），這些基因認(rèn)為與癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及侵襲相關(guān)［20-22］。此外，利用相關(guān)基因進(jìn)行KEEG 通路分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BOLA2 相關(guān)基因參與的通路可能包括核糖體、真核生物中的核糖體生物發(fā)生、蛋白酶體、嘌呤嘧啶代謝等，這些通路均被報(bào)道參與了腫瘤的發(fā)生。如核糖體數(shù)量的增加和修飾的改變均驅(qū)動(dòng)腫瘤發(fā)生。核糖體生物發(fā)生能維持腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖［23］。蛋白酶參與受損蛋白質(zhì)降解，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及轉(zhuǎn)錄蛋白，干擾凋亡、Wnt 通路等過(guò)程，在多種癌癥中發(fā)揮作用［24］。在癌癥進(jìn)展過(guò)程中，鐵代謝紊亂可干擾免疫應(yīng)答，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。在LUAD 中，高表達(dá)BOLA2 與多種免疫淋巴細(xì)胞減少相關(guān)。既往研究表明，免疫微環(huán)境中免疫淋巴細(xì)胞減少與LUAD 患者不良預(yù)后相關(guān)［25］，說(shuō)明過(guò)表達(dá)BOLA2 的LUAD 患者預(yù)后不良可能是免疫細(xì)胞被抑制所致。BOLA2 在免疫微環(huán)境中的作用如何，以及能否聯(lián)合免疫治療作為新型治療靶點(diǎn)需要進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)BOLA2 可能介導(dǎo)LUAD 的發(fā)生和進(jìn)展，影響免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平，并與不良預(yù)后相關(guān)，可能是新的預(yù)后指標(biāo)和潛在的治療靶點(diǎn)。這些發(fā)現(xiàn)利于理解BOLA2 在LUAD 中的作用，但對(duì)其致癌機(jī)制的分析和新型藥物研究需進(jìn)一步探討。