文 鳳 李 清 李 萃 谷瑤紅 馬玉萌 郝靜超

（昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，昆明 650500）

干燥綜合征（Sj?gren syndrome，SS）也稱舍格倫綜合征，是累及外分泌腺體慢性炎癥的自身免疫結(jié)締組織疾?。?］。其病理表現(xiàn)為大量淋巴細(xì)胞浸潤外分泌腺體間質(zhì)，并伴有外分泌腺體上皮細(xì)胞破壞和萎縮［2］。臨床局部表現(xiàn)為唾液黏蛋白缺失引起的口干燥、口腔黏膜潰瘍或繼發(fā)感染、淚腺分泌黏蛋白減少引起眼干燥性角結(jié)膜炎等；系統(tǒng)性表現(xiàn)為全身乏力、低熱，約有2/3 患者出現(xiàn)全身系統(tǒng)性損害［3］?；颊哐逯写嬖诙喾N自身抗體。SS 分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩類，僅有外分泌腺受累則稱為原發(fā)性干燥綜合征（pSS）；若同時伴有其他結(jié)締組織損害或繼發(fā)其他自身免疫性疾病則稱為繼發(fā)性干燥綜合征（sSS）。SS 主要患者為中年婦女，全世界患病率為0.3‰～3‰，我國患病率為0.3%～0.7%，40 歲以上人群患病率高達3%～4%［4-5］。

SS 發(fā)病機制尚不明確，目前認(rèn)為其與遺傳、感染及環(huán)境等多種因素密切相關(guān)［6-7］。經(jīng)自體蛋白激活免疫反應(yīng)途徑產(chǎn)生IFN，從而促進單核細(xì)胞、 T細(xì)胞、B 細(xì)胞和靶器官（如唾液腺上皮細(xì)胞）產(chǎn)生 B細(xì)胞活化因子BAFF，BAFF 與免疫細(xì)胞受體BAFFR 結(jié)合后繼續(xù)促進B 細(xì)胞的增殖活化，進而分泌自身抗體SSA、SSB 和抗核抗體ANA［8］。活化的T 細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10 等細(xì)胞因子聯(lián)合自身抗體共同作用促進疾病進程［6，9］。

動物模型是研究SS發(fā)病機制的重要輔助手段，但由于目前缺乏SS 特異性高的生物標(biāo)志物和能夠完全模擬臨床SS 病理的動物模型，故抗SS 藥物篩選研究僅能以動物干眼模型作為主要研究對象。因此選擇便利的造模方法和穩(wěn)定的動物模型顯得非常關(guān)鍵。

東莨菪堿是茄科植物中的一種莨菪烷型生物堿，其主要通過阻斷副交感神經(jīng)傳導(dǎo)作用于中樞和外周，競爭性拮抗毒蕈堿乙酰膽堿受體，從而發(fā)揮其鎮(zhèn)靜和抑制腺體分泌等作用。本文旨在利用東莨菪堿和高滲鹽水分別誘導(dǎo)復(fù)制SS小鼠模型，通過觀察比較小鼠體質(zhì)量變化百分比、飲水量消耗情況、淚液結(jié)晶變化、外周血自身抗體SSA、SSB 和抗核抗體ANA表達量、TNF-α和BAFFR炎癥因子表達量、脾臟濕重和脾臟系數(shù)、分泌腺組織中淋巴細(xì)胞浸潤評分等指標(biāo)比較兩種方法的便利性和穩(wěn)定性。本研究有利于SS 動物模型的研究，并為抗SS 藥物臨床前藥理學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性BALB/c 小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量（18±2） g，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物合格證號：SCXK（滇）2019-0008，使用許可證號：SYXK（滇）K2015-0002。飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)SPF環(huán)境，小鼠自由進食、飲水。實驗開展前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。實驗過程符合減少、替代和優(yōu)化的3R原則。

1.1.2 主要試劑與儀器 氫溴酸東莨菪堿（愛必信上海生物科技有限公司，規(guī)格500 mg，批號：abs47000419）；固體氯化鈉（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，規(guī)格500 g，批號：210422）；氯化鈉注射液（石家莊鵬海制藥股份有限公司，規(guī)格250 ml，批號：2012062101）；SSA、SSB、ANA、BAFFR 和TNF-α ELISA 試劑盒（上海朗頓生物科技有限公司，規(guī)格：96T）；倒置顯微鏡（上海維翰光電科技有限公司，型號：50I）；多功能酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技公司，型號：1510）。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑的配制 稱取氫溴酸東莨菪堿 0.100 8 g 于燒杯，加入100 ml 生理鹽水玻棒攪拌溶解成1 mg/ml 的氫溴酸東莨菪堿溶液。置于4 ℃下保存待用。稱取固體氯化鈉1.401 3 g于燒杯，加入500 ml生理鹽水玻璃棒攪拌溶解，配制成2.8 mg/ml的高滲鹽水。置于4 ℃保存待用。

1.2.2 小鼠SS模型建立 SPF級BALB/c小鼠隨機分為3組：正常組、氫溴酸東莨菪堿組和高滲鹽水組（n=10）。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，除正常組外，氫溴酸東莨菪堿組小鼠經(jīng)皮下注射氫溴酸東莨菪堿溶液，0.2 mg/次/20 g 體重（qid）。高滲鹽水組小鼠經(jīng)眼內(nèi)緩滴氯化鈉溶液，100 μl/（眼·次）（qid）。連續(xù)造模10 d。具體造模方案見表1。

表1 小鼠模型復(fù)制方案（n=10）Tab.1 Replicative regimen of mice models （n=10）

1.2.3 體質(zhì)量變化檢測 用小鼠秤測量每組小鼠體質(zhì)量，1次/2 d。計算每組體質(zhì)量變化百分比（%）。

1.2.4 飲水消耗量檢測 在d1 時，以加滿水的鼠水瓶重量作為起始重量M1（g），隨后每2 d 稱量鼠水瓶重量，再次記錄作為Mn（g）。利用作差法ΔM飲水量=M1-Mn計算每組小鼠飲水消耗量（1 g≈1 ml）。結(jié)果保留1位小數(shù)。

1.2.5 淚液結(jié)晶形態(tài)檢測 實驗期間，采集淚液（1 次/5 d）。采用毛細(xì)玻璃管在小鼠眼內(nèi)呲處收集淚液后轉(zhuǎn)至載玻片，待其干后，置于倒置顯微鏡×200視野下觀察淚液結(jié)晶形態(tài)。隨機拍5～8 個視野，每個視野拍3～5張。

1.2.6 脾臟系數(shù)檢測 實驗結(jié)束后，剖取小鼠脾臟，去除其周圍結(jié)締組織，生理鹽水清洗后濾紙吸干表面水分，稱量其濕重。按公式：脾臟系數(shù)（mg/g）=脾臟重量（mg）/小鼠體質(zhì)量（g），計算脾臟系數(shù)。

1.2.7 脾臟HE 染色 脾臟置于4%甲醛溶液中固定48 h，石蠟包埋，經(jīng)切片、貼片、脫蠟和蘇木素-伊紅染色，乙醇脫水，中性樹脂進行封片。將其置于倒置顯微鏡×100、×200 視野下觀察，每片隨機拍攝5～8 個視野。依據(jù)脾臟形態(tài)進行評價：0 級，脾臟結(jié)構(gòu)完整，白髓、紅髓結(jié)構(gòu)清晰，脾小體結(jié)構(gòu)完整、清晰、排列整齊；1 級，脾臟病理改變程度較小，脾小體結(jié)構(gòu)較為整齊，體積較小，淋巴細(xì)胞較少，白髓增生程度有所緩解；2 級，脾臟紅髓、白髓分布不規(guī)則，排列不均勻，白髓區(qū)域淋巴細(xì)胞輕度增生，白髓區(qū)輕度增寬；3 級，病理改變程度較大，脾臟白髓呈重度增生，生發(fā)中心突出，淋巴細(xì)胞減少，脾小體萎縮，數(shù)量減少，紅髓髓索壓迫變窄，脾小梁密集。

1.2.8 腺體組織淋巴細(xì)胞浸潤評分 剖取頜下腺、腮腺于4%中性甲醛溶液固定48 h。經(jīng)切片、貼片、脫蠟和蘇木素-伊紅染色，乙醇脫水，中性樹脂進行封片。將其置于倒置顯微鏡×200 視野下觀察，每片隨機拍攝5～8 個視野。采用Chisholm-Mason 組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)評價腺體組織中淋巴細(xì)胞浸潤程度。評分標(biāo)準(zhǔn)為：0 分，偶見淋巴細(xì)胞浸潤；1 分，少量散在淋巴細(xì)胞浸潤；2 分，淋巴細(xì)胞中度浸潤（未成灶），伴有輕度實質(zhì)損傷；3 分，偶見0～1 個淋巴細(xì)胞浸潤灶，5 個低倍視野，伴有中度實質(zhì)損傷；4 分，易見2～3 個淋巴細(xì)胞浸潤灶，5 個低倍視野，伴有重度實質(zhì)損傷。＞2分為發(fā)病。

1.2.9 血清中抗體和炎癥因子表達量檢測 參照ELISA 試劑盒說明書檢測血清中自身抗體SSA 和SSB、抗核抗體ANA、炎癥因子BAFFR 和TNF-α 表達量。利用多功能酶標(biāo)在450 nm 波長下依序測定吸光值。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品曲線方程計算血清中抗體和炎癥因子的表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 利用 SPSS26.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理；計量資料以±s表示，進行獨立樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。利用GraphPad Prism 5軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量變化 實驗期間正常組小鼠體質(zhì)量呈增長趨勢。與正常組相比，高滲鹽水組與東莨菪堿組小鼠體質(zhì)量變化百分比均下降（P＜0.05，P＜0.01）；與高滲鹽水組相比，東莨菪堿組小鼠體質(zhì)量變化百分比下降幅度有顯著差異（P＜0.01）。見圖1A。

2.2 小鼠飲水量消耗 實驗期間正常組小鼠飲水量相對穩(wěn)定。與正常組相比，東莨菪堿組與高滲組的飲水量顯著增加（P＜0.05）；與高滲組相比，從d6開始，東莨菪堿組小鼠飲水量消耗顯著增加（P＜0.05）。見圖1B。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化百分率和飲水量消耗變化（n=10）Fig.1 Percentage of weight changes and water consumption of mice in each group （n=10）

2.3 淚液結(jié)晶形態(tài)變化 圖2顯示，正常組小鼠淚液分泌量多，淚液結(jié)晶呈形態(tài)良好的蕨類物形狀 （Ⅰ型）。高滲鹽水組和東莨菪堿組小鼠淚液分泌均減少，其中東莨菪堿組最少。高滲組淚液結(jié)晶呈蕨類物形狀，邊界不清且形狀不規(guī)則（Ⅲ型），東莨 菪堿組淚液結(jié)晶中蕨類物形狀減少，分布散亂 （Ⅳ型）。

圖2 小鼠淚液結(jié)晶形態(tài)變化（×200）Fig.2 Morphological changes of tear crystal form of mice （×200）

2.4 脾臟系數(shù) 圖3A、3B 顯示，與正常組相比，高滲鹽水組脾臟濕重和脾臟系數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而東莨菪堿組脾臟濕重和脾臟系數(shù)顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與高滲鹽水組相比，東莨菪堿組脾臟濕重顯著增加，脾臟系數(shù)顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.5 脾臟HE 染色 圖4 顯示，正常組脾臟結(jié)構(gòu)完整，白髓、紅髓結(jié)構(gòu)清晰，脾小體結(jié)構(gòu)完整、清晰、排列整齊（0 級），而東莨菪堿組小鼠脾臟白髓呈重度增生，生發(fā)中心突出，病理改變程度較大，淋巴細(xì)胞減少，脾小體萎縮，數(shù)量減少，紅髓髓索壓迫變窄，脾小梁密集（3 級）；高滲鹽水組白髓增生程度有所緩解，脾臟病理改變程度較小，脾小體結(jié)構(gòu)較為整齊，體積較小，淋巴細(xì)胞較少（1級）。

圖4 各組脾臟HE染色（HE，n=10）Fig.4 HE staining of spleens in each group （HE， n=10）

2.6 頜下腺、腮腺HE 染色及其淋巴細(xì)胞浸潤評分 圖5 顯示，正常組小鼠頜下腺分泌黏液和漿液性的腺泡結(jié)構(gòu)完整，導(dǎo)管無阻塞、狹窄。與正常組（0 級）相比，東莨菪堿組小鼠頜下腺中腺泡結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)管阻塞、狹窄而導(dǎo)致頜下腺發(fā)生逆行性炎癥的程度較高，有膿性分泌物自導(dǎo)管口溢出（3 級）；而高滲鹽水組中分泌黏液和漿液性腺泡結(jié)構(gòu)較為完整，少有導(dǎo)管阻塞、狹窄和膿性分泌物溢出（1級）。圖5 顯示，正常組小鼠腮腺漿液性腺泡明顯可見，閏管長，在腺小葉內(nèi)可見，無皮脂腺（0 級）。與正常組相比，東莨菪堿組腮腺漿液性腺泡較少，閏管不一，染色淺，在腺小葉內(nèi)少見，可見皮脂腺和淋巴（3 級）；而高滲鹽水組腮腺漿液性腺泡明顯可見，閏管長，染色淺，在腺小葉內(nèi)可見，無皮脂腺（1級）。圖3C顯示，與正常組相比，高滲組小鼠頜下腺、腮腺組織中淋巴細(xì)胞浸潤程度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而東莨菪堿組中淋巴細(xì)胞浸潤程度均顯著升高（P＜0.01）。

圖3 小鼠脾臟重量、脾臟系數(shù)和分泌腺組織淋巴細(xì)胞浸潤評分（n=5）Fig.3 Weight and indexes of spleens and lymphocyte infiltration scores of endocrine glands of mice （n=5）

圖5 各組頜下腺和腮腺HE染色（HE，n=10）Fig.5 HE staining of submandibular gland and parotid gland in each group （HE， n=10）

2.7 血清中自身抗體表達量 圖6A、6B 顯示，與正常組相比，東莨菪堿組血清中自身抗體SSA、SSB和抗核抗體ANA表達量均顯著升高（P＜0.01），但高滲鹽水組僅SSA 表達量顯著升高（P＜0.05），而SSB、ANA 表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與高滲鹽水組相比，東莨菪堿組表達量均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。表明東莨菪堿可顯著促進小鼠體內(nèi)自身抗體和抗核抗體表達。

2.8 血清中BAFFR 和TNF-α 表達量 圖6C、6D 顯示，與正常組相比，東莨菪堿組血清中BAFFR、TNF-α表達量均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）；但高滲鹽水組僅TNF-α 表達量升高（P＜0.05），BAFFR表達量變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義。東莨菪堿組血清中BAFFR 表達量顯著高于高滲鹽水組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；但兩組TNF-α 表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表明東莨菪堿均能促進BAFFR蛋白和TNF-α 表達，但高滲鹽水僅能促進TNF-α表達。

圖6 各組小鼠外周血清中自身抗體和炎癥因子表達（n=10）Fig.6 Expression levels of auto-antibodies and inflammatory factors in peripheral blood of mice in each group （n=10）

3 討論

SS 發(fā)病機制復(fù)雜不清，現(xiàn)階段仍缺乏一個能真實、客觀、全面地模擬SS 臨床發(fā)病機制和表現(xiàn)的動物模型。目前已有多種復(fù)制SS動物模型的方法，如自發(fā)動物模型、基因工程動物模型、實驗誘導(dǎo)型模型等。其中，實驗誘導(dǎo)模型方法因其周期短和經(jīng)濟便利性仍是藥理學(xué)研究中體內(nèi)篩選的重要方法之一。本研究通過實驗誘導(dǎo)方法，表明氫溴酸東莨菪堿法比高滲鹽水滴眼法在復(fù)制SS模型上更有優(yōu)勢。東莨菪堿是具有抗膽堿活性的生物堿，其通過阻斷毒蕈堿型乙酰膽堿受體（M受體）阻斷淚腺膽堿能受體，并通過抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控抑制腺體分泌，其抑制作用強于阿托品［10-12］。這種抑制作用在一定程度上模擬了臨床SS 患者的發(fā)病癥狀，如口干、眼干、分泌腺體功能降低、腺體結(jié)構(gòu)萎縮和免疫炎癥等。研究發(fā)現(xiàn)，氫溴酸東莨菪堿引起的干眼以淚液分泌減少為主，伴有免疫性炎癥和細(xì)胞凋亡等多因素共同參與［12-14］。與高滲鹽水滴眼局部誘導(dǎo)干眼相比，東莨菪堿對分泌腺的抑制作用更強［13，15］。皮下注射途徑操作簡單，既能避免全身用藥的毒副作用，又能克服眼表用藥的局部限制，使誘導(dǎo)造模作用持久［16］。因此，本研究為選擇合理、經(jīng)濟快捷的造模方法提供依據(jù)，有利于提高抗SS 藥物篩選效率，也為探索新的更接近臨床SS發(fā)病機制的動物建模方法提供參考。原發(fā)性和繼發(fā)性的SS 患者早期癥狀不典型，大部分以口干、眼干為首發(fā)癥狀。眼干可導(dǎo)致眼癢、干澀、眼紅、異物感等一系列不適癥狀，嚴(yán)重者可引起失明。早期口干的跡象包括齲齒數(shù)量增加、反復(fù)感染或口腔潰瘍及嚴(yán)重的牙齦疾?。?7］。我國以眼干、口干癥狀就診的主訴者較少，故臨床常常忽視SS 的首發(fā)癥狀?，F(xiàn)臨床確診主要依靠臨床癥狀、組織病理學(xué)檢查及對自身抗體、相關(guān)炎癥因子表達水平檢測的綜合判斷。自身抗體SSA、SSB 對SS 的診斷敏感度較高，具有重要的診斷價值［17-18］?？购丝贵wANA 能識別各種細(xì)胞核組分，特征性地出現(xiàn)于許多自身免疫性疾病的活動性及預(yù)后指標(biāo)。TNF-α 雖然不作為SS 的特異性指標(biāo)， 但其是判斷感染程度和免疫功能的重要炎癥因子之一［19-20］。B 淋巴細(xì)胞活化在SS 病程中具有關(guān)鍵作用，BAFF 是維持B 細(xì)胞功能的重要細(xì)胞因子，BAFF/BAFFR 能夠激活PI3K-Akt-mTOR 信號通路，調(diào)節(jié)B 淋巴細(xì)胞的增殖、存活和活化。近年也結(jié)合了抗著絲點抗體、抗-α 胞襯蛋白、抗線粒體抗體M2亞型（AMA-2）、抗毒蕈堿3 受體（M3R）抗體等指標(biāo)［21］。隨著SS發(fā)病機制的深入研究，新的特異性生物標(biāo)志物將被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于SS治療。