李蘋芳，姚協(xié)豐，徐錦華，朱凌麗，羊杏平

(1.浙江開放大學 教學中心農學教研部， 浙江 杭州 310012； 2.江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇省農業(yè)科學院 蔬菜研究所， 江蘇 南京 210014)

碳水化合物是植物光合作用的主要產物，也是植物生命活動包括果實生長發(fā)育的基礎物質，其運輸關系到光合產物在植物不同器官之間的分配與轉運。在果實發(fā)育過程中，蔗糖等同化物在源葉中合成，經韌皮部運輸，以共質體或質外體途徑轉運到果實中。與共質體途徑不同的是，在糖的質外體裝載及卸載過程中，需要依靠特定糖轉運蛋白，通過膜的主動運輸進出細胞，如單糖轉運蛋白(monosaccharide transporters， MST)、蔗糖轉運蛋白(sucrose transporters， SUT)，以及最新發(fā)現的糖外排轉運蛋白(sugars will eventually be exported transporters，SWEET)等[1-3]。已有對番茄、葡萄、棗、蘋果、黃瓜和西瓜等作物的研究表明，果實發(fā)育時期部分或全程采用質外體途徑進行糖分卸載[4-8]，即糖轉運蛋白在果實內糖分卸載與積累中發(fā)揮重要作用，然而目前對于果實發(fā)育過程中糖轉運蛋白基因的鑒定及如何參與其中發(fā)揮轉運作用還知之甚少。

SWEET糖轉運蛋白是2010年Chen等[1]運用熒光共振能量轉移傳器技術(fluorescence resonance energy transfer， FRET sensor)從擬南芥(Arabidopsisthaliana)中鑒定出的一類新的運輸葡萄糖和其他寡糖的蛋白。不同于蔗糖轉運子這類蛋白，SWEET糖轉運蛋白利用細胞內外糖濃度梯度進行跨膜轉運，它不依賴于細胞膜上的質子梯度，其糖轉運活性也不依賴于環(huán)境pH值； 且具有雙向轉運糖類功能，即順濃度梯度從胞內向胞外運輸糖分或將糖分從胞外運輸到胞內[1]。在結構上，SWEET糖轉運蛋白屬于MtN3/saliva蛋白家族，大多數預測MtN3/saliva蛋白由7個跨膜螺旋組成，包含2個MtN3/saliva結構域[1，9]。自Chen等[1]報道擬南芥AtSWEET11、AtSWEET12 蛋白的蔗糖輸出作用以來， 已從水稻、番茄和葡萄等多種植物中鑒定發(fā)現眾多SWEET蛋白具有糖轉運功能[4，10-11]。雖然SWEET發(fā)現并不久，但已發(fā)現其參與了配子體育性、植株發(fā)育、衰老、耐性脅迫、植物-病原菌互作、果實發(fā)育等多個植物生理過程[12-20]。

甜瓜是一種重要的夏令水果，目前甜瓜中SWEET的研究鮮有報道。為探究甜瓜果實發(fā)育過程中SWEET糖轉運蛋白的作用，本研究從甜瓜基因組中鑒定獲得18個SWEETs糖轉運蛋白基因，進一步篩選在果實發(fā)育全程或某個時期表達量較高的基因。然后通過構建攜帶GFP載體的融合基因，運用激光共聚焦觀察，獲得這些基因的定位。并通過酵母表達研究這些基因在體外是否具有轉運葡萄糖和果糖的功能，以期為揭示SWEET糖轉運蛋白在甜瓜果實發(fā)育過程的調控作用奠定基礎，從分子水平上探明果實糖分、風味等甜瓜品質形成的內在機理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料選用甜瓜Vedrantais品種。甜瓜生長條件為白天25～28 ℃，晚上18～20 ℃。先在穴盤內播種，10 d后移栽到體積為65 L，直徑為55 cm，高度為34 cm的盆內，每3株種在一個盆內?；|為草炭∶沙∶火山巖=6∶3∶1(體積比)。

1.2 試驗方法

1.2.1 甜瓜SWEETs基因家族生物信息學分析

以擬南芥SWEETs氨基酸序列作為種子序列在甜瓜基因組數據庫中搜索得到同源序列21條，根據擬南芥名字進行命名。利用軟件TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對甜瓜21條SWEETs序列進行跨膜結構預測，并在DNASTAR中進行氨基酸、分子量、等電點的預測。利用Mega6.0對甜瓜、擬南芥、水稻SWEET氨基酸序列采用鄰接法(NJ， Neighbor-Jointing)構建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap設置為1 000次。

1.2.2 RNA提取和RT-PCR

選取甜瓜根、莖、葉、花、不同發(fā)育階段(0、5、10、20、30、40 d)果實進行RNA提取，RNA的提取使用TRIZOL試劑(Invitrogen公司，Carlsbad， CA， USA)。提取后，總RNA溶解在經焦碳酸二乙酯處理的水中。采用相同量的RNA進行反轉錄，反轉錄使用RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒(Fermentas， USA)進行PCR，所用引物見表1。

1.2.3 實時熒光定量(quantitative real-time PCR，qPCR)

選取授粉0、5、10、20、30、40 d的果實維管束部位進行總RNA提取，并進行反轉錄合成cDNA，采用qPCR對CmSWEET3，CmSWEET7a和CmSWEET17c進行擴增，以3個不同果實樣品作為3次生物學重復。每個反應(總容積20 μL)由10 μL iQ SYBR Green Supermix、1 μL稀釋cDNA、0.1 μmol·L-1正向和反向引物組成。PCR循環(huán)條件如下：95 ℃循環(huán)3 min，40個循環(huán)，95 ℃循環(huán)10 s，58 ℃循環(huán)45 s。甜瓜Actin7(XM_008442791)作為內參基因?；虮磉_的計算采用2-ΔΔCT[21]。

1.2.4CmSWEET3，CmSWEET7a，CmSWEET17c開放閱讀框的克隆

根據甜瓜基因組數據庫或EST庫查找CmSWEET3、CmSWEET7a、CmSWEET17c的序列，分別使用引物TOPO-SWEET3-F/R、TOPO-SWEET7a-F/R、TOPO-SWEET17c-F/R進行克隆入pENTRTM/D-TOPO載體(Invitrogen)(引物序列見表1)。獲得序列正確的pENTRTM/D-TOPO克隆后用Gateway?LR ClonaseTMⅡ enzyme mix(Invitrogen)克隆入終載體pMDC83和pMDC43，分別獲得GFP在C末端和N末端的蛋白。LR反應體系為：150 ng入門克隆(entry clone)，150 ng目的載體(destination vector)，LR酶混合液0.5 μL，總體積2.5 μL。

1.2.5 本氏煙浸潤法表達重組蛋白

用無菌牙簽挑取含目的基因的農桿菌克隆和沉默抑制子P19分別置入2 mL的含有抗生素的YEP液體培養(yǎng)基(25 μg·mL-1Rif，50 μg·mL-1Amp，50 μg·mL-1Strep，50 μg·mL-1Km)中，30 ℃，振蕩培養(yǎng)過夜；將過夜培養(yǎng)物加入50 mL 含有抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中(Rif 25 μg·mL-1，Amp 50 μg·mL-1，Strep50 μg·mL-1，Km 50 μg·mL-1)，30 ℃，過夜振蕩培養(yǎng)；20 ℃，4 000 r·min-1，離心15 min，收集菌體；將菌體用轉化緩沖液(10 mmol·L-1MES，10 mmol·L-1MgCl2，200 μmol·L-1乙酰丁香酮)混勻，調整D600，含目的基因的農桿菌調至0.3～0.5，P19調至0.8～1.0，室溫靜置3 h，然后將兩種菌液按1∶1混合，用1 mL注射器注射入一個月大小的本氏煙葉片背面。72 h后采用激光共聚焦觀察GFP。

1.2.6 酵母表達實驗

將CmSWEET3和CmSWEET7aCDS 分別利用引物NEV-SWEET7a-F/R、NEV-SWEET3-F/R(引物序列見表1)克隆到酵母表達載體NEV-N載體中，再轉化入己糖與轉化酶缺失突變酵母CSY4000菌株中。挑取包含目的基因的酵母菌落，于CAA培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)至D值為2.0，并按照8倍的濃度依次稀釋，各濃度取2 μL，點于以葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)、麥芽糖(maltose)、蔗糖(sucrose)為糖原的CAA培養(yǎng)基上于29 ℃進行培養(yǎng)，3 d后拍照。

2 結果與分析

2.1 甜瓜SWEETs家族基因的生物信息學分析

進入http：//pfam.xfam.org/網站搜索SWEETs家族基因的hmmer文件，對甜瓜基因組數據庫(CucumismeloL. cv. DHL92 v3.6.1)進行搜索，本試驗共得到21條蛋白序列。經過SMART和NCBI-CD 人工篩選刪除了3條過短的蛋白序列，得到18條符合條件的序列。以擬南芥同源序列名字進行命名為CmSWEET1～CmSWEET17(表2)，并用ExPASy (http：//web.expasy.org/protparam/) 進行蛋白分子量分析，以及用SMART(http：//smart.embl.de/)進行蛋白結構預測和跨膜區(qū)域預測。如表2所示，18條基因所表達的蛋白序列長度在151～297個氨基酸，分子量在19.5～33.3 ku，等電點在6.44～9.66。經軟件預測，絕大部分甜瓜SWEET家族成員N端包含5～7個跨膜結構域，個別可能由于拼接問題，序列不完整，含有2個或4個跨膜結構域，如CmSWEET17d。

2.2 甜瓜SWEETs家族基因的進化樹分析

為研究甜瓜SWEETs家族基因與水稻、黃瓜、番茄之間的進化關系，用ClustalW對甜瓜、水稻、黃瓜、番茄5個作物的SWEETs家族基因蛋白質序列進行多序列比對，并使用Neighbor-Joining方法建樹(圖1)。根據Anjali等[22]最新綜述，將SWEETs分為3個類型，甜瓜SWEETs序列中屬于類型Ⅰ有2個，包括CmSWEET1、CmSWEET3；類型Ⅱ有6個，包括CmSWEET5a、CmSWEET5b、CmSWEET5c、CmSWEET7a、CmSWEET7b、CmSWEET17d；類型Ⅲ有10個，包括CmSWEET9a、CmSWEET9b、CmSWEET10、CmSWEET12a、CmSWEET12b、CmSWEET12c、CmSWEET15、CmSWEET17a、CmSWEET17b、CmSWEET17c。

表2 甜瓜SWEETs家族基因的生物信息學分析

圖1 甜瓜SWEETs家族基因氨基酸序列與其他物種的進化樹分析Fig.1 Phylogenetic analysis of melon SWEETs family amino acid sequences with other plant species

2.3 甜瓜SWEETs家族基因的染色體定位分析

根據甜瓜DHL92基因組的注釋信息將甜瓜18個SWEETs家族基因進行染色體定位(圖2)，其中16條成功定位于1～12號染色體，而CmSWEET17a、CmSWEET17c定位于chr00， 該版本基因組未能將正確拼接的碎片一并歸為chr00。16個甜瓜SWEETs基因在12條染色體的分布不均勻，1、8、10號染色體上無SWEETs基因，3、6、7、11號染色體上分別有1個SWEETs基因，2、4、9號染色體有2個SWEETs基因，5、10號染色體分布有3個SWEETs基因。

圖2 甜瓜SWEETs家族基因染色體定位Fig.2 Chromosome mapping of melon SWEETs family genes

2.4 半定量RT-PCR檢測甜瓜SWEETs家族基因的表達模式

為明確甜瓜SWEETs基因的表達模式，分別以根、莖、成熟葉、幼葉、雄花、雌花，以及開花當天未授粉子房及不同發(fā)育階段果實為模板，進行RT-PCR檢測12條SWEETs基因的表達(另6條基因引物特異性不佳，未檢測)，以甜瓜Actin7作為內參。如圖3-A所示，在不同營養(yǎng)器官內，CmSWEETs呈現不同表達模式，如CmSWEET1、CmSWEET2和CmSWEET17c在各器官內均有表達，CmSWEET3和CmSWEET7a則未出現在幼葉中，CmSWEET5a、CmSWEET7c、CmSWEET10、CmSWEET12a、CmSWEET12c則主要在根和花器官中有表達。為明確甜瓜SWEETs基因與果實發(fā)育的關系，以不同發(fā)育階段的果實作為模板，進行RT-PCR。如圖3-B所示，在不同發(fā)育階段的果實中，CmSWEET3、CmSWEET7a和CmSWEET17c在授粉后5～30 d表達量都很高。結果表明CmSWEET3、CmSWEET7a和CmSWEET17c可能與果實發(fā)育相關。

圖3 甜瓜SWEETs家族基因在不同營養(yǎng)器官(A)與不同果實發(fā)育階段(B)的表達Fig.3 Expression pattern of SWEETs family genes in different vegetative organs (A) and fruits in different developmental stages(B) of melon

2.5 CmSWEET3、CmSWEET7a，CmSWEET17c在果實發(fā)育各個階段的表達量分析

為進一步明確CmSWEET3、CmSWEET7a和CmSWEET17c與甜瓜果實發(fā)育的關系，我們進行了qPCR檢測。如圖4所示，CmSWEET3在果實發(fā)育中期，即20 d時表達最高。CmSWEET7a隨著果實發(fā)育逐漸上升，表達量在40 d時最高。而CmSWEET17c在前期各個時期的表達量差異不大，在成熟時40 d的表達量最低。實時熒光定量PCR的結果進一步驗證了普通RT-PCR結果，CmSWEET3、CmSWEET7a作為候選基因進行后續(xù)研究。

每個果實作為一個重復，數據來自3個獨立的重復，圖中的每個值表示均值±SD。qPCR產生的表達量與對照的比值為1.0。Each fruit was set as one replicate， the data were obtained from three separate replicates， each value in the graph showed means ± SD. Expression levels produced by qPCR were expressed as a ratio to the control. which was set at 1.0.圖4 三個CmSWEETs基因在不同果實發(fā)育期的qPCR表達分析Fig.4 qPCR analysis of 3 CmSWEETs genes during different fruit developmental stages in melon plants

2.6 CmSWEET3、CmSWEET7a的亞細胞定位

為進一步明確CmSWEET3、CmSWEET7a是否為膜蛋白，我們采用本氏煙進行瞬時表達CmSWEET3、CmSWEET7a以此明確其亞細胞定位。如圖5所示，激光共聚焦定位觀察發(fā)現，CmSWEET3、CmSWEET7a定位于細胞膜上。因此，通過亞細胞定位我們初步判斷CmSWEET3、CmSWEET7a為膜蛋白。

圖5 CmSWEET3 和CmSWEET7a 基因在煙草表皮細胞的亞細胞定位Fig.5 Subcellular localization of CmSWEET3 and CmSWEET7a genes expressed in Nicotiana tabacum

2.7 CmSWEET3、CmSWEET7a酵母表達試驗

為進一步明確甜瓜SWEETs基因轉運糖的功能，將CmSWEET3、CmSWEET7a正義鏈與反義鏈分別克隆入酵母表達載體NEV-N，并轉入己糖與轉化酶缺失突變酵母CSY4000菌株中。在以葡萄糖、果糖(麥芽糖為陽性對照，蔗糖為陰性對照)分別作為碳源的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)發(fā)現，轉化CmSWEET7a正義鏈的酵母可以在以葡萄糖和果糖的培養(yǎng)基上生長，如圖6所示，表明CmSWEET7a具有轉化葡萄糖和果糖這兩類己糖的功能，CmSWEET3轉化效果不佳(數據未呈現)。

圖6 CmSWEET7a在酵母中的表達Fig.6 The expression of CmSWEET7a in yeast

3 結論與討論

SWEET糖轉運蛋白是近年發(fā)現的一類具有運輸葡萄糖和其他寡糖的蛋白。SWEET介導了很多重要的生理或生化過程，最近研究表明，SWEET糖轉運蛋白在果實發(fā)育中起調控作用。在蘋果中3個SWEETs在幼果中表達量較高，而一個在大果中表達量較為豐富[23]。Zhen等[24]在蘋果果實發(fā)育中鑒定得到多個在果實發(fā)育期高表達的SWEETs基因，通過開發(fā)標記基因，鑒定其在群體中與果實可溶性糖含量的關系，最后發(fā)現MdSWEET15a和MdSWEET9b作為候選基因可能與蘋果中糖積累關聯(lián)。栽培番茄中SWEET1b、SWEET1c、SWEET2a、SWEET7a、SWEET14在1～3 cm的幼果中具有較高的表達量，隨著果實成熟其表達量逐漸降低，SlSWEET12c在1～3 cm的幼果中表達量較低，在果實綠熟期表達量急劇增加達到最大值[25]。最近，Ko等[10]通過構建SlSWEET15的CRISPR功能突變體揭示番茄中SlSWEET15參與果實中糖分卸載。Zhang等[26]在葡萄中用轉基因手段證實SWEET10在其果實成熟時負責糖分積累。這些研究提供了SWEETs調控參與果實糖分積累的證據，然而目前關于SWEETs基因在甜瓜果實發(fā)育過程中的研究還未被報道。

本研究從甜瓜基因組系統(tǒng)鑒定得到18個SWEETs基因(表2)。根據甜瓜DHL92基因組的注釋信息，16個SWEETs基因定位于甜瓜1-12號染色體上，有兩條被定位于chr00(未能拼接的片段被歸為0號染色體)(圖2)。2017年Hu等[27]對黃瓜基因組SWEETs家族基因進行了系統(tǒng)鑒定，獲得了17個黃瓜SWEETs基因，該17條基因的表達有70%在繁殖器官中。比較甜瓜與黃瓜中鑒定到的SWEETs基因，發(fā)現具有非常高的同源性，本研究中也將18個SWEETs基因，與水稻、黃瓜、番茄作物的SWEETs家族基因氨基酸序列進行多序列比對，同源性最高的是黃瓜。黃瓜與甜瓜同屬葫蘆科甜瓜屬，甜瓜有12條染色體，但黃瓜只有7條染色體，Huang等[28]對黃瓜、甜瓜染色體相關性的研究已揭示葫蘆科作物在進化過程中存在著復雜的進化與重排。2021年申長衛(wèi)等[29]系統(tǒng)鑒定了南瓜中SWEETs基因，共得到21個南瓜SWEETs基因，其研究也證實葫蘆科作物中SWEETs存在高度同源性。本研究篩選到3個SWEETs基因在果實發(fā)育全程或某個時期表達量較高，預示其可能在果實發(fā)育中發(fā)揮重要作用(圖4)。

糖轉運蛋白的亞細胞定位與其代表的功能密切相關，目前研究結果表明，其主要定位于液泡膜和質膜。通常情況下液泡膜定位的糖轉運蛋白與胞內糖類儲存或者抗逆境脅迫有關，質膜定位的糖轉運蛋白和細胞內糖類的外排或輸入有關。如蔗糖轉運蛋白 SUT1、SUT2 亞族的成員均定位在細胞質膜上，酵母蔗糖吸收功能互補試驗也證明其定位于細胞質膜[30]。對SWEET 蛋白的研究顯示，其主要定位于韌皮部薄壁組織的細胞膜上，行使將胞內蔗糖轉運至質外體中的功能。如擬南芥中 AtSWEET1、AtSWEET8、AtSWEET11、AtSWEET12 和 AtSWEET15 定位于質膜上，負責細胞內糖類的進出[1，31]；AtSWEET16 和 AtSWEET17 定位于液泡膜上，介導液泡中糖類的儲存[32-33]。研究發(fā)現，蘋果MdSWEET17定位于液泡膜上，參與細胞內果糖運輸[34]。梨 PbSWEET4 定位于質膜，且在成熟葉中高表達，過表達 PbSWEET4 可以顯著降低葉片中的蔗糖與葉綠素的含量，推測其參與了葉片光合產物輸出，能量物質的過度流失導致 PbSWEET4 轉基因植株葉片早衰[35]。在黃瓜中，CsSWEET7a被發(fā)現定位于韌皮部伴胞細胞的細胞膜上，通過RNAi干擾實驗進一步證實其與黃瓜果實中糖分卸載有關[36]。本研究中為明確甜瓜果實發(fā)育相關候選基因CmSWEET3、CmSWEET7a的亞細胞定位，采用本氏煙對其進行瞬時表達，激光共聚焦定位觀察發(fā)現，CmSWEET3、CmSWEET7a定位在細胞膜上(圖5)，這為后期揭示其功能奠定了基礎。

如前所述，SWEET 轉運蛋白的特點是除了可以作為低親和力的葡萄糖轉運蛋白調節(jié)葡萄糖跨膜吸收外，還能夠運輸蔗糖、果糖和半乳糖，因此，知道其底物對于揭示其功能具有重要意義。擬南芥 SWEET 可分為 4 個不同的亞類，屬于不同亞類的各種糖轉運蛋白優(yōu)先轉運不同的糖組分，如屬于分支1的成員AtSWEET1優(yōu)先運輸葡萄糖[37]，屬于分支2的AtSWEET5 編碼半乳糖轉運蛋白主要運輸 2-脫氧葡萄糖，屬于分支3 的AtSWEET11 和 AtSWEET12 主要負責韌皮薄壁組織細胞中蔗糖的運出[38]；而分支 4(SWEET16～17)成員既可轉運單糖又可轉運多糖。最近Anjali等[22]將多個單子葉植物與雙子葉植物放在一起聚類分析將SWEETs家族基因分為3個不同的類型(type)，類型Ⅰ包含擬南芥中的分支1，優(yōu)先運輸葡萄糖；類型Ⅱ包括擬南芥的分支2和分支4，運輸 2-脫氧葡萄糖，既可轉運單糖又可轉運多糖；類型Ⅲ即對應擬南芥的分支3，運輸二元糖，如蔗糖作為底物。本研究通過基因組系統(tǒng)鑒定從甜瓜中獲得18個SWEETs基因，通過甜瓜、水稻、黃瓜、番茄4個作物的SWEETs氨基酸序列進行多序列比對，參考Anjali等[22]的分類，甜瓜SWEETs序列中屬于類型Ⅰ有2個，類型Ⅱ有6個，類型Ⅲ有10個，其中候選基因CmSWEET7a屬于第Ⅱ類，酵母功能缺失實驗也證實SWEET7a具有轉運葡萄糖或果糖能力。體外酵母功能缺失實驗為更深入揭示CmSWEET7a是否參與了甜瓜果實發(fā)育過程中糖分從篩管卸載到達薄壁細胞這一重要過程奠定了基礎。今后的研究方向將在甜瓜植株內進行過表達或敲除表達從而進行功能驗證。