胡婉蓉，蔡 文，鄭召君，劉元法，羅 誠(chéng)，李東亮*

1.四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司雪茄煙技術(shù)創(chuàng)新中心，成都市龍泉驛區(qū)成龍大道2 段 610101

2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇省無(wú)錫市濱湖區(qū)蠡湖大道1800 號(hào) 214122

雪茄煙是完全由雪茄煙葉卷制而成的煙草制品，相比于傳統(tǒng)卷煙，具有勁頭大、香氣濃的特點(diǎn)。雪茄的生產(chǎn)包括栽培、晾制、發(fā)酵和養(yǎng)護(hù)等多個(gè)工段，其中，發(fā)酵是改善雪茄煙葉理化性質(zhì)和吸食品質(zhì)的重要工序。經(jīng)發(fā)酵處理后的雪茄煙葉顏色變深，成熟度提高，青雜氣和刺激性減輕，香吃味趨于和諧［1］。郭文龍等［2］證明了在雪茄煙葉發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行翻堆處理可以有效提高雪茄煙葉中性致香物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，降低雪茄煙葉的雜氣和刺激性。劉仡［3］發(fā)現(xiàn)橡木桶發(fā)酵可以提高雪茄煙葉的香氣質(zhì)和香氣量，改善余味。鄭霖霖等［4］發(fā)現(xiàn)添加外源酶制劑總體上可提高雪茄煙葉總糖、還原糖、鉀和氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，降低蛋白質(zhì)和總氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，改善煙葉化學(xué)成分協(xié)調(diào)性及感官品質(zhì)。李晶晶等［5］發(fā)現(xiàn)雪茄煙葉發(fā)酵條件為45 ℃和相對(duì)濕度85%時(shí)對(duì)于減少煙草特有亞硝胺的累積效果最佳。

目前，關(guān)于雪茄煙葉發(fā)酵的研究多集中于發(fā)酵工藝的優(yōu)化，且大部分研究?jī)?nèi)容較為單一［6-7］。事實(shí)上，雪茄煙葉在發(fā)酵過(guò)程中除了化學(xué)組分的變化，微生物的生理活動(dòng)對(duì)雪茄煙葉質(zhì)量同樣具有顯著影響。研究人員發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地、發(fā)酵節(jié)點(diǎn)的雪茄煙葉細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異，這可能是不同來(lái)源雪茄煙葉品質(zhì)存在差距的原因之一［8-10］。此外，在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，發(fā)酵介質(zhì)是促進(jìn)雪茄煙葉發(fā)酵的重要添加物，可以有效提高雪茄煙葉質(zhì)量。然而，由于行業(yè)技術(shù)保密，介質(zhì)的組成和作用機(jī)理尚不清晰。因此，本研究中將系統(tǒng)分析雪茄煙葉在發(fā)酵過(guò)程中化學(xué)組成及微生物群落的變化，對(duì)比傳統(tǒng)加水發(fā)酵和介質(zhì)輔助發(fā)酵過(guò)程中雪茄煙葉的主要化學(xué)組成及微生物群落結(jié)構(gòu)的變化趨勢(shì)，旨在解析發(fā)酵介質(zhì)和發(fā)酵過(guò)程對(duì)雪茄煙葉品質(zhì)提升的作用機(jī)制，為新型發(fā)酵介質(zhì)的開發(fā)和發(fā)酵工藝的優(yōu)化提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

雪茄煙葉材料為2020 年產(chǎn)德雪7 號(hào)上部2 級(jí)煙葉（未進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵），介質(zhì)是一種以枇杷提取物為主要成分的植物提取物，均由四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司長(zhǎng)城雪茄廠提供。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵

稱取5 kg 雪茄煙葉，按雪茄煙葉質(zhì)量的4.35%稱取介質(zhì)并加水稀釋，再將其均勻噴灑在雪茄煙葉表面，使雪茄煙葉的含水率為30%±2%；隨后將雪茄煙葉裝入麻布袋中，再轉(zhuǎn)移至恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)，參照實(shí)際生產(chǎn)中的發(fā)酵條件在35 ℃、相對(duì)濕度75%的條件下發(fā)酵35 d，在發(fā)酵的第0、7、14、21、28和35天時(shí)分別取雪茄煙葉樣品，并分別命名為L(zhǎng)2-x（隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)應(yīng)的x 分別為1、2、3、4、5 和6）。另將介質(zhì)替換成等質(zhì)量的去離子水，按照上述相同步驟完成空白對(duì)照組實(shí)驗(yàn)，所得樣品對(duì)應(yīng)命名為L(zhǎng)1-x。所有樣品均存放于-20 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.2 感官品質(zhì)評(píng)價(jià)

將發(fā)酵結(jié)束后的雪茄煙葉按照長(zhǎng)110 mm、周長(zhǎng)47 mm 的規(guī)格卷制成單料煙，由國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心頒發(fā)證書的5 名評(píng)吸專家組成評(píng)吸小組，參照長(zhǎng)城雪茄廠雪茄煙葉感官品質(zhì)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［11］采用9分制進(jìn)行感官品質(zhì)打分。

1.2.3 化學(xué)成分分析

采用連續(xù)流動(dòng)分析法測(cè)定雪茄煙葉樣品的總糖、生物堿、總氮、還原糖、鉀和氯等常規(guī)化學(xué)成分指標(biāo)［12］。采用GC 法測(cè)定雪茄煙葉中非揮發(fā)性有機(jī)酸的組成和質(zhì)量分?jǐn)?shù)［13］。采用GC-MS 法測(cè)定雪茄煙葉的致香成分組成，采用內(nèi)標(biāo)法定量［14］。

1.2.4 微生物高通量測(cè)序及分析

雪茄煙葉樣品的微生物擴(kuò)增子測(cè)序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成，使用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'） 和806R（5'-GACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對(duì)16S rRNA基因V3-V4 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；使用ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）對(duì)基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。利用Illumina 公司的Miseq PE300 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序；使用Fastp 軟件對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用Flash 軟件進(jìn)行拼接；使用Usearch 軟件（version 7.0 http：//drive5.com/uparse/）根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU（Operational taxonomic units，運(yùn)算分類單元）聚類并剔除嵌合體；利用RDPclassifier（http：//rdp.cme.msu.edu/）對(duì)每條序列與Silva 數(shù)據(jù)庫(kù)（SSU132）進(jìn)行比對(duì)，設(shè)置比對(duì)閾值為70%，得到物種分類注釋結(jié)果，并進(jìn)行Alpha 多樣性、物種組成和物種差異等分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 感官品質(zhì)評(píng)價(jià)

從表1可以看出，本實(shí)驗(yàn)中使用的雪茄煙葉原料煙氣濃度和勁頭中等，香氣質(zhì)和香氣量較低，燃燒性有待提高，且有明顯的雜氣和刺激性。添加發(fā)酵介質(zhì)可以提高雪茄煙葉的感官品質(zhì)，介質(zhì)發(fā)酵組雪茄煙葉的感官評(píng)吸得分總體高于空白對(duì)照組。其中，介質(zhì)發(fā)酵組雪茄煙葉的香氣質(zhì)、刺激性和余味特征改善明顯，香氣量和濃度有所提升，燃燒特性變化不明顯，表明本介質(zhì)是一種增加醇和度及圓潤(rùn)感的雪茄提質(zhì)介質(zhì)模塊。此外，隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，雪茄煙葉的感官評(píng)價(jià)得分呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，于21 d 達(dá)到最高水平，表明過(guò)度發(fā)酵不利于雪茄煙葉感官品質(zhì)的提升。

表1 雪茄煙葉樣品的感官評(píng)價(jià)得分Tab.1 Scores of sensory evaluation for cigar tobacco samples

2.2 常規(guī)化學(xué)成分分析

雪茄煙葉在發(fā)酵過(guò)程中的總氮、生物堿、總糖及還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化情況見圖1。雪茄煙葉的總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%～4%，生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%～5%，與文獻(xiàn)［15］的報(bào)道一致。在空白對(duì)照組中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，雪茄煙葉的總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒有顯著性變化，L1-1 和L1-6 的總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.57%和3.69%。添加介質(zhì)對(duì)雪茄煙葉總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒有顯著性影響，介質(zhì)發(fā)酵組與空白對(duì)照組雪茄煙葉的總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在發(fā)酵過(guò)程中的變化趨勢(shì)相似。如圖1-2 所示，介質(zhì)發(fā)酵組的雪茄煙葉生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)在發(fā)酵第14 天下降了7.89%，在其他時(shí)段變化平緩。研究表明，雪茄煙葉的生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)在發(fā)酵過(guò)程中降低可能是由于在高溫高濕的發(fā)酵條件下，微生物活動(dòng)和硝酸鹽的氧化分解進(jìn)一步加強(qiáng)，可促進(jìn)生物堿轉(zhuǎn)化為煙草特有亞硝胺［16］。此外，添加介質(zhì)對(duì)雪茄煙葉的生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒有明顯影響。如圖1-3 和圖1-4 所示，雪茄煙葉原料的總糖和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.53%和0.21%。相比于烤煙，雪茄煙的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低［17］。空白對(duì)照組和介質(zhì)發(fā)酵組的雪茄煙葉在發(fā)酵第7 天時(shí)總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別為0.56%和0.60%，此后隨發(fā)酵的進(jìn)行總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈下降趨勢(shì)。雪茄煙葉的還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在發(fā)酵起始時(shí)為最高水平，至第28天時(shí)開始低于檢測(cè)限。該結(jié)果與文獻(xiàn)［18］的報(bào)道一致，總糖和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的降低可能是由于發(fā)酵過(guò)程中糖類化合物與氨基酸通過(guò)美拉德反應(yīng)及與酚類和醇類化合物反應(yīng)生成香氣物質(zhì)，或被氧化降解為水和二氧化碳。此外，添加介質(zhì)對(duì)雪茄煙葉總糖及還原糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒有顯著性影響（P＞0.05）。

圖1 雪茄煙葉樣品總氮、生物堿、總糖和還原糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.1 Mass fractions of total nitrogen，alkaloids，total sugars and reducing sugars in cigar tobacco samples

煙葉中鉀、氯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及鉀氯比通常與煙葉的燃燒性相關(guān)［19］。從表2可知，雪茄煙葉中鉀的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%～4%，氯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為2%，鉀氯比約為1.5。在持續(xù)35 d的發(fā)酵過(guò)程中，雪茄煙葉中鉀的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在第14天達(dá)到最高水平，在第21天表現(xiàn)出最低水平。至于氯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，空白對(duì)照組和介質(zhì)發(fā)酵組的雪茄煙葉均在第7天達(dá)到最高水平，分別為2.36%和2.18%。兩組雪茄煙葉的鉀氯比均在第14天達(dá)到最高值，且發(fā)酵終點(diǎn)的鉀氯比顯著低于發(fā)酵起點(diǎn)。相比之下，添加介質(zhì)對(duì)煙葉鉀氯比的整體影響不顯著。一般情況下，鉀氯比與煙葉燃燒性正相關(guān)，鉀氯比大于4時(shí)煙葉可呈現(xiàn)較好的燃燒性［19］。雖然本研究中發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程對(duì)雪茄煙葉鉀氯比影響顯著，但本研究中所涉及的雪茄煙葉樣品的鉀氯比整體呈現(xiàn)較低水平（不高于2）。結(jié)合2.1節(jié)中的感官評(píng)價(jià)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，盡管發(fā)酵過(guò)程可以提高煙葉鉀氯比，但其提高幅度較小，對(duì)雪茄煙葉燃燒性能的影響仍不顯著。因此，后續(xù)應(yīng)研究采用其他方法提高雪茄煙葉的燃燒性。

表2 雪茄煙葉樣品中鉀和氯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及鉀氯比Tab.2 Mass fractions of K and Cl and K/Cl ratios in cigar tobacco samples

2.3 非揮發(fā)性有機(jī)酸分析

非揮發(fā)性有機(jī)酸的組成和質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)調(diào)控雪茄煙葉的內(nèi)在質(zhì)量及感官品質(zhì)具有重要意義，可以平衡煙氣的酸堿度、減輕刺激性、提高雪茄煙葉的醇和度［20］。如圖2-1所示，相比于發(fā)酵起點(diǎn)，在發(fā)酵后期雪茄煙葉非揮發(fā)性有機(jī)酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降；在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，空白對(duì)照組和介質(zhì)發(fā)酵組雪茄煙葉非揮發(fā)性有機(jī)酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別下降了16.86%和20.28%。此外，在發(fā)酵中后期（14～35 d），空白對(duì)照組非揮發(fā)性有機(jī)酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈下降趨勢(shì)；相比之下，介質(zhì)發(fā)酵組雪茄煙葉非揮發(fā)性有機(jī)酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)總體變化不顯著，說(shuō)明添加介質(zhì)有助于維持發(fā)酵過(guò)程中雪茄煙葉的酸堿環(huán)境，起到平衡雪茄煙氣酸堿性的作用。

在所檢測(cè)到的非揮發(fā)性有機(jī)酸中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的有草酸、蘋果酸和檸檬酸，三者的質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和約為非揮發(fā)性有機(jī)酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的90%，是反映雪茄煙葉成熟度和品質(zhì)的重要標(biāo)志。如圖2-2 所示，空白對(duì)照組的草酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨發(fā)酵的進(jìn)行沒有顯著性變化，在發(fā)酵第7 天達(dá)到最高值（0.23%），相比發(fā)酵起點(diǎn)提高了10.74%；類似地，介質(zhì)發(fā)酵組的草酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)也在發(fā)酵第7天達(dá)到最高水平（0.30%），相比發(fā)酵起點(diǎn)提高了40.93%，而在發(fā)酵中期（14～21 d）呈現(xiàn)較低水平。從第14天到發(fā)酵結(jié)束，雪茄煙葉的蘋果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈下降趨勢(shì)，介質(zhì)發(fā)酵組在第14天達(dá)到最高值（0.29%）。檸檬酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與蘋果酸的變化趨勢(shì)較為相似，空白對(duì)照組和介質(zhì)發(fā)酵組均在發(fā)酵第28天呈現(xiàn)最低水平，相比于發(fā)酵起點(diǎn)分別降低了34.50%和51.98%。以上結(jié)果表明，相比于空白對(duì)照組，介質(zhì)發(fā)酵組的草酸和檸檬酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化幅度更大，且這兩種酸是三羧酸循環(huán)的重要代謝物，這說(shuō)明添加介質(zhì)促進(jìn)了雪茄煙葉細(xì)胞及表面微生物的呼吸作用，加速了底物代謝和產(chǎn)物生成。據(jù)文獻(xiàn)［21］報(bào)道，雪茄煙葉中蘋果酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與煙葉品質(zhì)正相關(guān)，而過(guò)多的草酸和檸檬酸則會(huì)影響雪茄煙葉的口感。因此，從揮發(fā)性小分子有機(jī)酸的組成來(lái)看，介質(zhì)發(fā)酵14～21 d對(duì)改善雪茄煙葉的香吃味較為適宜。

圖2 雪茄煙葉樣品非揮發(fā)性有機(jī)酸的總量以及草酸、蘋果酸、檸檬酸和高級(jí)脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.2 Mass fractions of total nonvolatile organic acids，oxalic acid，malic acid，citric acid and higher fatty acids in cigar tobacco samples

除非揮發(fā)性小分子有機(jī)酸外，高級(jí)脂肪酸也對(duì)雪茄煙葉感官質(zhì)量有重要影響。由圖2-5 可知，相較于非揮發(fā)性小分子有機(jī)酸，雪茄煙葉的高級(jí)脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，約為0.03%～0.04%。本研究中的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明，添加介質(zhì)對(duì)雪茄煙葉的高級(jí)脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒有顯著性影響（P＞0.05）。無(wú)論是空白對(duì)照組還是介質(zhì)發(fā)酵組，均在發(fā)酵第28天達(dá)到最高水平（～0.04%）。此外，在持續(xù)35 d 的發(fā)酵過(guò)程中，高級(jí)不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化趨勢(shì)與高級(jí)飽和脂肪酸相似；在發(fā)酵21～28 d 時(shí)，空白對(duì)照組的高級(jí)不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于介質(zhì)發(fā)酵組，而高級(jí)飽和脂肪酸則相反。雪茄煙葉中較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的高級(jí)不飽和脂肪酸會(huì)增加煙氣的刺激性和粗糙感，降低煙氣平滑度［22］。本研究中添加介質(zhì)有利于減弱雪茄煙葉的澀口感和刺激感，使煙氣醇和，進(jìn)而改善雪茄煙葉的吸食品質(zhì)。因此，從有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化看，介質(zhì)發(fā)酵21 d 對(duì)提高雪茄煙葉的感官質(zhì)量有利，這與2.1節(jié)中的感官評(píng)價(jià)結(jié)果吻合。

2.4 致香成分分析

雪茄煙葉在發(fā)酵過(guò)程中的致香成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢(shì)如圖3 所示，空白對(duì)照組與介質(zhì)發(fā)酵組的致香成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢(shì)相似。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，雪茄煙葉的致香成分總量呈先增加后降低的趨勢(shì)，空白對(duì)照組的致香成分總量在第14天達(dá)到最高水平（0.37%），而介質(zhì)發(fā)酵組的致香成分總量在第21 天達(dá)到最高值（0.38%）。這說(shuō)明：①過(guò)度發(fā)酵不利于雪茄煙葉致香成分的累積，發(fā)酵14～21 d可能是較適宜的發(fā)酵周期；②添加介質(zhì)有利于致香成分的累積。該介質(zhì)中含有糖類、蛋白質(zhì)、酸類及醇類化合物，除了其自身可以直接提高致香成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)外，還可以通過(guò)提供美拉德反應(yīng)底物等途徑促進(jìn)致香成分的產(chǎn)生。

圖3 雪茄煙葉樣品中各類致香成分及新植二烯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.3 Mass fractions of various aroma components and neophytadiene in cigar tobacco samples

除了致香成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化，本研究中還分析了不同種類及代表性致香物質(zhì)的變化趨勢(shì)。如圖3 所示，雪茄煙葉的致香成分以醇類、烯類、酮類和雜環(huán)類化合物為主。可以看出，醇類、烯類和酮類致香成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增加后降低的趨勢(shì)，而雜環(huán)類化合物的變化趨勢(shì)則相反。醇類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的最高值出現(xiàn)在發(fā)酵28～35 d，約為0.08%～0.09%，比發(fā)酵初始增加了20～30 百分點(diǎn)；烯類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的最高值出現(xiàn)在第21 天，分別為0.12%（空白對(duì)照組）和0.13%（介質(zhì)發(fā)酵組）；而酮類化合物的最高水平出現(xiàn)在第14天，達(dá)0.08%～0.10%。此外，介質(zhì)發(fā)酵組的醇類、烯類、酮類和酯類化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于空白對(duì)照組，說(shuō)明添加介質(zhì)發(fā)酵有利于上述致香化合物的累積。

根據(jù)分析檢測(cè)結(jié)果，新植二烯是雪茄煙葉最主要的致香成分，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)約占致香成分總量的20%～25%。新植二烯是葉綠素的降解產(chǎn)物，具有醇和煙氣、降低刺激性的作用；且可以分解產(chǎn)生呋喃類化合物，進(jìn)一步改善雪茄煙葉的香吃味［23］。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，新植二烯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈先增加后降低的趨勢(shì)，于第21 天達(dá)到最高值（空白對(duì)照組：0.10%；介質(zhì)發(fā)酵組：0.12%）。從致香成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及不同種類致香成分和新植二烯這一代表性致香物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化來(lái)看，14～21 d的發(fā)酵周期對(duì)致香成分的累積較為適宜。

2.5 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.5.1 Alpha多樣性分析

采用16S rRNA 和ITS 高通量測(cè)序法對(duì)雪茄煙葉樣品進(jìn)行微生物測(cè)序的結(jié)果見表3?？芍?，所有雪茄煙葉樣品的細(xì)菌覆蓋率為99.88%～99.95%，真菌覆蓋率為99.90%～99.98%，覆蓋率較高，取樣合理，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果能較真實(shí)地反映雪茄煙葉表面微生物群落的分布情況。稀釋曲線主要用于表征樣品的測(cè)序深度，可反映測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性。如圖4 所示，雪茄煙葉真菌和細(xì)菌群落的稀釋曲線隨樣本序列數(shù)的增加而上升并逐漸達(dá)到平臺(tái)期，說(shuō)明測(cè)序深度基本能夠反映雪茄煙葉的真菌和細(xì)菌群落組成。真菌和細(xì)菌的alpha 多樣性分析結(jié)果如表3所示，Shannon 指數(shù)和Chao 指數(shù)的大小分別表征群落多樣性和豐富度的高低?？梢钥闯?，介質(zhì)發(fā)酵組在第7、21 和28 天的細(xì)菌群落多樣性均高于同時(shí)段的空白對(duì)照組。根據(jù)Chao 指數(shù)計(jì)算結(jié)果，介質(zhì)發(fā)酵組在發(fā)酵后期（21～35 d）的細(xì)菌群落豐富度高于同時(shí)段的空白對(duì)照組，說(shuō)明添加介質(zhì)能提高發(fā)酵21～28 d 的雪茄煙葉細(xì)菌群落的多樣性和豐富度。此外，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在21 d 內(nèi)時(shí)，介質(zhì)發(fā)酵組比空白對(duì)照組的真菌多樣性更高，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，空白對(duì)照組的真菌多樣性超過(guò)介質(zhì)組，同時(shí)總體微生物多樣性隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。這說(shuō)明添加介質(zhì)可能會(huì)加速發(fā)酵進(jìn)程，有助于提高雪茄煙葉表面真菌的多樣性；且過(guò)度發(fā)酵不利于雪茄煙葉表面真菌的生長(zhǎng)。

表3 雪茄煙葉樣品微生物群落的豐富度和多樣性Tab.3 Richness and diversity of microbial communities in cigar tobacco samples

圖4 雪茄煙葉樣品細(xì)菌和真菌的稀釋曲線Fig.4 Dilution curves of bacteria and fungi in cigar tobacco samples

本研究中基于OTU水平繪制了雪茄煙葉表面微生物群落的韋恩圖（圖5），以描述群落結(jié)構(gòu)在OTU水平的分布情況。如圖5-1所示，對(duì)于雪茄煙葉表面細(xì)菌而言，其OTU總數(shù)目維持在63～178個(gè)。雪茄煙葉表面細(xì)菌OTU共有數(shù)為18個(gè)，L2-2（介質(zhì)發(fā)酵7 d）、L2-4（介質(zhì)發(fā)酵21 d）和L2-5（介質(zhì)發(fā)酵28 d）的獨(dú)有OTU數(shù)目相對(duì)較多，分別為28、34和35個(gè)，表明介質(zhì)在發(fā)酵中期有利于提高雪茄煙葉的細(xì)菌群落多樣性，并使其形成特有的細(xì)菌組成。對(duì)于真菌而言，OTU共有數(shù)為22 個(gè)，樣品的特有OTU 數(shù)相對(duì)較少，只有L2-4（介質(zhì)發(fā)酵21 d）和L1-5（加水發(fā)酵28 d）組的OTU 數(shù)量相對(duì)較多，分別為43 和49 個(gè)。由此可知，介質(zhì)發(fā)酵21 d 時(shí)，雪茄煙葉中細(xì)菌和真菌的多樣性均明顯提升。

2.5.2 群落結(jié)構(gòu)分析

從圖6-1 可以看出，雪茄煙葉的細(xì)菌組成主要為4 個(gè)門，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteriota），并以厚壁菌門和藍(lán)細(xì)菌為主要優(yōu)勢(shì)菌門。在空白對(duì)照組中，發(fā)酵7～28 d 的雪茄煙葉厚壁菌門的相對(duì)豐度較高，均高于70%；在發(fā)酵末期，藍(lán)細(xì)菌取代厚壁菌門成為優(yōu)勢(shì)菌。在介質(zhì)發(fā)酵組中，厚壁菌門在發(fā)酵末期占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其相對(duì)豐度為90%以上，高于同期的空白對(duì)照組。雪茄煙葉的細(xì)菌結(jié)構(gòu)主要有4個(gè)屬（圖6-2），分別為葡萄球菌屬（Staphylococcus）、norank_f_norank_o_Choroplast（未命名菌）、假單胞菌屬（Pseudomonas）以及甲基桿菌屬（Mehtylobacterium）。在空白對(duì)照組中，發(fā)酵初期相對(duì)豐度最高的菌是norank_f_norank_o_Choroplast；但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，葡萄球菌屬逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，在7～28 d的發(fā)酵期內(nèi)其相對(duì)豐度在70%以上；而在發(fā)酵末期，葡萄球菌屬所占比例下降，norank_f_norank_o_Choroplast 重新占據(jù)優(yōu)勢(shì)菌群的主導(dǎo)地位。在介質(zhì)發(fā)酵組中，發(fā)酵初期仍是以norank_f_norank_o_Choroplast 為主要優(yōu)勢(shì)菌群，隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，葡萄球菌屬大量繁殖，在發(fā)酵末期成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，相對(duì)豐度高于90%。以上變化說(shuō)明，添加介質(zhì)改變了細(xì)菌生長(zhǎng)的環(huán)境，在發(fā)酵前期延緩了細(xì)菌群落的演替進(jìn)程。

圖6 雪茄煙葉樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.6 Compositions of bacterial communities in cigar tobacco samples

從圖7-1 可以看出，雪茄煙葉的真菌群落主要有子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）兩類真菌。對(duì)于空白對(duì)照組而言，除發(fā)酵第7 天（L1-2）外，雪茄煙葉的優(yōu)勢(shì)菌門均是子囊菌門，其相對(duì)豐度占50%以上；在發(fā)酵第7 天時(shí)，擔(dān)子菌門所占比例約為90%，成為優(yōu)勢(shì)菌門。添加介質(zhì)發(fā)酵后，雪茄煙葉的子囊菌門相對(duì)豐度隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而整體呈下降趨勢(shì)，在發(fā)酵末期降至最低水平；而擔(dān)子菌門正好相反，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌門。由此可見，添加介質(zhì)可以顯著改變雪茄煙葉在門水平上的真菌群落結(jié)構(gòu)。真菌在屬水平上群落結(jié)構(gòu)豐富、種類較多（圖7-2），其群落結(jié)構(gòu)主要可總結(jié)為7 個(gè)屬，分別為節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia）、曲霉屬（Aspergillus）、枝孢菌（Cladosporium）、Sampaiozyma、鏈格孢菌（Alternaria）、匍柄霉屬（Stemphylium）和德巴利酵母屬（Debaryomyces）。在發(fā)酵起始時(shí)，空白對(duì)照組及介質(zhì)發(fā)酵組雪茄煙葉均以曲霉屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，節(jié)擔(dān)菌屬的相對(duì)豐度提高。加入介質(zhì)后，雪茄煙葉中的曲霉屬仍存在較高的比例，直至發(fā)酵末期顯著降低，而節(jié)擔(dān)菌屬的相對(duì)豐度隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在發(fā)酵末期（35 d）的相對(duì)豐度達(dá)80%，為最主要的優(yōu)勢(shì)菌屬。

圖7 雪茄煙葉樣品的真菌群落結(jié)構(gòu)Fig.7 Compositions of fungal communities in cigar tobacco samples

在本研究中，雪茄煙葉中的葡萄球菌屬、節(jié)擔(dān)菌屬及曲霉屬優(yōu)勢(shì)性明顯。根據(jù)文獻(xiàn)［8］的報(bào)道，國(guó)外（古巴和多米尼加）雪茄煙的葡萄球菌屬的相對(duì)豐度一般高于國(guó)產(chǎn)雪茄煙葉，海南雪茄煙葉則以芽孢菌屬為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。此外，在雪茄煙葉發(fā)酵過(guò)程中，葡萄球菌屬的優(yōu)勢(shì)性逐漸突顯［7］。盡管近年來(lái)不斷證實(shí)葡萄球菌屬存在于雪茄煙葉中，但其在雪茄煙葉發(fā)酵過(guò)程中的貢獻(xiàn)和功能尚不清晰。在食品領(lǐng)域，葡萄球菌屬在臘肉和香腸的發(fā)酵過(guò)程中可以代謝產(chǎn)生支鏈氨基酸促進(jìn)食品風(fēng)味形成；而氨基酸與糖類的美拉德反應(yīng)是煙草香味成分的重要形成途徑。由此可見，在發(fā)酵中期（14～21 d），葡萄球菌屬的富集有利于致香成分的累積。假單胞菌屬是烤煙煙葉中比較常見的一種細(xì)菌，在本研究中，只有L2-2組（介質(zhì)發(fā)酵第7 天）的雪茄煙葉中發(fā)現(xiàn)了一定豐度的假單胞菌屬。由于假單胞菌屬具有降解煙堿的性能［8］，因此介質(zhì)發(fā)酵組雪茄煙葉的生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)在第14天顯著下降（圖1-2）可能是該時(shí)段雪茄煙葉中假單胞菌屬的相對(duì)豐度提高導(dǎo)致的。節(jié)擔(dān)菌屬與黃酮類化合物的生成有關(guān)［24］；而曲霉屬作為潛在致病真菌或條件致病真菌，不僅可能對(duì)吸煙者或煙草從業(yè)人員健康造成影響，同時(shí)也是雪茄煙葉霉變的主要原因［25-26］。因此，相比于空白對(duì)照組，介質(zhì)發(fā)酵組中節(jié)擔(dān)菌屬的優(yōu)勢(shì)性有利于黃酮類化合物的累積，進(jìn)而促進(jìn)致香成分的產(chǎn)生?？紤]到雪茄煙葉是混菌發(fā)酵體系，單一菌群的作用對(duì)雪茄煙葉品質(zhì)的影響有限，后期應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)混菌體系的研究，以便更好地為雪茄煙葉發(fā)酵工藝控制提供指導(dǎo)。

3 結(jié)論

①德雪7 號(hào)雪茄煙葉中總氮和生物堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在發(fā)酵過(guò)程中整體變化不明顯，而總糖和還原糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著發(fā)酵的進(jìn)行呈下降趨勢(shì)，糖類的消耗可能是通過(guò)美拉德反應(yīng)等過(guò)程轉(zhuǎn)化為致香物質(zhì)導(dǎo)致的。②雪茄煙葉中非揮發(fā)性有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化表明添加發(fā)酵介質(zhì)有利于減弱雪茄煙葉的澀口感和刺激感，且發(fā)酵14～21 d 對(duì)改善雪茄煙葉的香吃味較為適宜。致香成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的分析結(jié)果進(jìn)一步證明了介質(zhì)發(fā)酵14～21 d 有利于致香物質(zhì)的累積。③介質(zhì)發(fā)酵21 d 時(shí)，雪茄煙葉的細(xì)菌和真菌多樣性均明顯提升。添加介質(zhì)在發(fā)酵前期延緩了細(xì)菌群落的演替進(jìn)程，提高了雪茄煙葉表面真菌的多樣性，葡萄球菌屬和節(jié)擔(dān)菌屬的富集是雪茄煙葉致香成分累積的原因之一。