段史江，王 佩，曾 宇，彭玉富，賈世偉，張洪映，宋朝鵬，陳小龍*

1.江西省煙草公司吉安市公司，江西省吉安市青原區(qū)青原大道456 號(hào) 343009

2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市金水區(qū)農(nóng)業(yè)路63 號(hào) 450002

3.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，鄭州市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)第三大街8 號(hào) 450016

淀粉作為煙葉中最主要的碳水化合物，其含量較高［1］。新鮮煙葉淀粉含量為40%左右［2-3］，烤后煙葉中淀粉含量也高達(dá)5.5%～8.5%［4-6］。影響煙葉中淀粉含量的因素很多，以往對(duì)煙葉中淀粉代謝的研究主要集中在煙草類型、生態(tài)環(huán)境、栽培措施、烘烤調(diào)制和貯存陳化等方面［5-7］。通過分析前人的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，調(diào)整煙草栽培措施和調(diào)制工藝雖然能夠有效提高淀粉降解量，但烤后煙葉淀粉含量仍然偏高。

依據(jù)能否被淀粉酶降解，可將淀粉分為抗性淀粉和非抗性淀粉兩類。能被α-胰腺淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶水解為葡萄糖的淀粉稱為非抗性淀粉，而不能被淀粉酶水解的淀粉被稱為抗性淀粉［8-10］。有研究表明，抗性淀粉主要是淀粉與水通過高溫加熱后經(jīng)冷卻形成，主要成分為分子量較小且分支程度低的直鏈淀粉［11-12］。在抗性淀粉形成過程中，直鏈淀粉分子通過氫鍵結(jié)合，形成雙螺旋，再由雙螺旋堆積，形成B 型結(jié)晶［13-14］?？剐缘矸酆颗c其他類型淀粉含量密切相關(guān)，Englyst 等［15］研究表明，抗性淀粉含量受直鏈淀粉與支鏈淀粉比值的影響，與直鏈淀粉含量關(guān)系密切。張文緒等［16］和陳能等［17］研究發(fā)現(xiàn)，直鏈淀粉含量與稻米硬度、黏性和彈性等存在密切關(guān)系。目前，有關(guān)抗性淀粉含量變化及其與其他類型淀粉含量的相關(guān)性研究主要集中在水稻［18］、玉米［19］和香蕉［20］上，在煙草生長(zhǎng)發(fā)育和烘烤過程中抗性淀粉含量高低及其與其他類型淀粉含量的相關(guān)性研究尚鮮見報(bào)道。為此，以云煙87 為試驗(yàn)材料，研究了生長(zhǎng)發(fā)育及烘烤過程中煙葉抗性淀粉含量的變化、淀粉組分與抗性淀粉含量的關(guān)系以及淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)量，旨在為有效降低烤煙淀粉含量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2020—2021年在江西省吉安市永豐縣進(jìn)行，以烤煙品種云煙87 為試驗(yàn)材料，3 月15 日移栽，田間管理均按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行。取上部葉第16～18 葉位（從下往上數(shù)），分別于移栽后20、40、60和80 d時(shí)進(jìn)行取樣（上午9∶00時(shí)），所取樣品立即冷凍于液氮中，-80 ℃保存，用于淀粉含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）和基因表達(dá)量的測(cè)定。采摘煙葉成熟度、部位一致的上部葉，采收煙葉當(dāng)天烘烤。烘烤過程中，每24 h取樣1次，去除葉脈，于105 ℃下殺青5 min，65 ℃烘干，磨碎，過篩（篩孔0.250 mm），用于淀粉含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的測(cè)定。所有樣品均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 抗性淀粉含量的測(cè)定

采用K-RSTAR 試劑盒（愛爾蘭Megazyme 公司），按操作說明書測(cè)定抗性淀粉含量，每份樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

1.2.2 直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的測(cè)定

采用雙波比色法測(cè)定直鏈淀粉和支鏈淀粉含量［21］，其中直鏈淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)為627.5 nm，參比波長(zhǎng)為458.0 nm；支鏈淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)為545.5 nm，參比波長(zhǎng)為734.6 nm。其中每份樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

1.2.3 基因表達(dá)分析

在NCBI的Gene數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBI，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中檢索煙草淀粉合成相關(guān)基因［22-23］，獲得普通煙草AGPS1、AGPS2、AGPS3、ADGPL、GBSS、SS1、SS2、SS3、SBE1、SBE2、SBE3、ISA1、ISA2 和ISA3基因的編碼序列，這些基因在淀粉生物合成途徑中的位置見圖1。利用Primer 5.0軟件在基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)qRT-PCR引物，見表1。

表1 qRT-PCR擴(kuò)增引物Tab.1 Amplification primers for qRT-PCR

圖1 植物淀粉生物合成路徑Fig.1 Biosynthesis pathway of plant starch

采用Trizol 法提取煙葉總RNA，用M-MLV Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）合成單鏈cDNA。以cDNA 作為模板，按照SYBR Green試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）操作說明配制反應(yīng)體系，采用ABI PRISM 7000熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40次循環(huán)；溶解曲線為：95 ℃15 s，60 ℃15 s，20 min內(nèi)升至95 ℃，95 ℃15 s。內(nèi)參基因?yàn)闊煵莺颂求w蛋白基因L25。采用2-ΔΔCt計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量［24］，所有樣品均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的方差分析（單因素ANOVA）和相關(guān)分析，采用LSD 法進(jìn)行數(shù)據(jù)間差異的顯著性檢驗(yàn)；采用Origin 2018軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生育期和烤后煙葉中抗性淀粉含量的比較

對(duì)不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期煙葉和烤后煙葉中的抗性淀粉和總淀粉含量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)，抗性淀粉在煙苗移栽20 d 后開始積累，隨著生育期的推進(jìn)抗性淀粉含量逐漸增加，成熟期淀粉含量達(dá)到最高。移栽后20～40 d煙葉中抗性淀粉積累量較低，僅為0.38%；隨著葉片的生長(zhǎng)發(fā)育，煙葉中抗性淀粉和總淀粉大量積累，移栽后60～80 d是煙葉中抗性淀粉積累的主要時(shí)期，移栽后60 d 和移栽后80 d 煙葉中抗性淀粉含量差異達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），此時(shí)抗性淀粉含量達(dá)到6.89%，總淀粉含量為27.48%。煙葉經(jīng)過烘烤，抗性淀粉大量降解，烤后煙葉抗性淀粉含量為2.48%，總淀粉含量為7.93%，表明烤后煙葉中存在抗性淀粉，且約占總淀粉含量的1/3。

圖2 不同生育期和烤后煙葉中抗性淀粉含量比較Fig.2 Contents of resistant starch in tobacco leaves at different growth stages and cured tobacco leaves

2.2 煙葉直鏈淀粉和抗性淀粉的關(guān)系

不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期煙葉中抗性淀粉、直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的變化見表2。由表2可見，在煙葉發(fā)育過程中煙葉抗性淀粉、直鏈淀粉和支鏈淀粉含量均呈增加趨勢(shì)，其中支鏈淀粉逐漸積累直至煙葉成熟，而抗性淀粉和直鏈淀粉積累時(shí)期主要集中在煙葉生長(zhǎng)發(fā)育的中后期（移栽后60～80 d）。

表2 煙葉生長(zhǎng)發(fā)育過程中抗性淀粉、直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的比較Tab.2 Contents of resistant starch，amylose and amylopectin in tobacco leaves during growth and development

2.3 淀粉合成基因的表達(dá)分析

對(duì)不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期煙葉中淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)量比較（圖3）發(fā)現(xiàn)，AGPS1、SS3和ISA1在煙葉生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)時(shí)期表達(dá)量無明顯變化；AGPS2、AGPS3、AGPL、SS2、SBE1 和ISA3 的表達(dá)量在煙葉生長(zhǎng)發(fā)育過程中持續(xù)增加，在移栽后80 d 達(dá)到峰值；SS1 和ISA2 的表達(dá)量在煙葉生長(zhǎng)發(fā)育過程中持續(xù)增加，在移栽后60 d 煙葉中基因表達(dá)量最高，隨后SS1和ISA2的表達(dá)量下降；GBSS和SBE2的表達(dá)量在煙葉生長(zhǎng)發(fā)育前期基本穩(wěn)定在較低水平，在移栽后60 d煙葉中這兩個(gè)基因的表達(dá)量突然增加，GBSS和SBE2的表達(dá)量在成熟期達(dá)到峰值。可見，煙葉生長(zhǎng)發(fā)育過程中GBSS和SBE2兩個(gè)基因的表達(dá)量變化趨勢(shì)與直鏈淀粉和抗性淀粉的變化趨勢(shì)一致（表2），GBSS1和SBE2可能是調(diào)控直鏈淀粉和抗性淀粉含量的關(guān)鍵基因。

圖3 不同生育期煙葉中淀粉合成基因的表達(dá)量Fig.3 Expression levels of starch synthesis-related genes in tobacco leaves at different growth stages

2.4 烘烤過程中抗性淀粉和非抗性淀粉的降解規(guī)律

隨著烘烤時(shí)間的推進(jìn)，煙葉中抗性淀粉和非抗性淀粉含量均持續(xù)下降，不同烘烤階段淀粉降解速率依次為變黃期＞定色期＞干筋期（圖4）。在變黃期（0 ～72 h），抗性淀粉和非抗性淀粉快速降解，其中，變黃前期（0 ～24 h）淀粉降解最快。從定色中期（96 h）開始，抗性淀粉和非抗性淀粉含量無顯著變化。烘烤前煙葉中總淀粉、抗性淀粉和非抗性淀粉含量分別為23.68%、6.30%和17.38%，烘烤結(jié)束后煙葉中總淀粉、抗性淀粉以及非抗性淀粉含量分別為7.93%、2.48%和5.45%。經(jīng)過烘烤的煙葉總淀粉、抗性淀粉以及非抗性淀粉降解率分別為66.51%、60.63%和68.64%?？梢姡婵具^程中變黃期是抗性淀粉和非抗性淀粉降解的主要時(shí)期，其中非抗性淀粉的降解量較高，抗性淀粉的降解量相對(duì)較低，說明抗性淀粉在烘烤過程中不容易降解。

圖4 烘烤過程中抗性淀粉和非抗性淀粉的含量變化Fig.4 Variations of resistant starch and non-resistant starch contents during curing

2.5 抗性淀粉與直鏈淀粉的相關(guān)性

煙葉生長(zhǎng)發(fā)育及烘烤過程中的抗性淀粉含量和直鏈淀粉含量的相關(guān)性分析結(jié)果見表3。表3顯示，在生長(zhǎng)發(fā)育過程中煙葉抗性淀粉含量與直鏈淀粉含量呈極顯著正相關(guān)（r=0.992**，P＜0.01），抗性淀粉含量和直鏈淀粉與支鏈淀粉的比值間相關(guān)性不顯著；烘烤過程中煙葉抗性淀粉含量與直鏈淀粉含量呈顯著正相關(guān)（r=0.918*，P＜0.05），抗性淀粉含量和直鏈淀粉與支鏈淀粉的比值間相關(guān)性不顯著。

表3 煙葉抗性淀粉與直鏈淀粉含量間的相關(guān)性①Tab.3 Correlation between resistant starch and amylose contents in tobacco leaves

3 討論

本研究中發(fā)現(xiàn)，隨煙葉生長(zhǎng)發(fā)育過程的推進(jìn)淀粉含量持續(xù)積累，在煙葉成熟期達(dá)到峰值?？剐缘矸酆椭辨湹矸鄣姆e累時(shí)期主要集中在煙葉生長(zhǎng)發(fā)育的中后期，這與水稻在發(fā)育后期抗性淀粉含量達(dá)到峰值的研究結(jié)果基本一致［25-26］，可能原因是隨著作物的生長(zhǎng)發(fā)育，光合能力增強(qiáng)，碳代謝也隨之增強(qiáng)，從而在作物生育后期合成大量的淀粉類物質(zhì)，這與孫建國(guó)［27］的研究結(jié)果一致。

本研究中還發(fā)現(xiàn)，煙葉在生長(zhǎng)發(fā)育過程中可產(chǎn)生并不斷積累抗性淀粉，煙苗移栽后60 d 內(nèi)是抗性淀粉積累的主要時(shí)期，該時(shí)期煙葉中的直鏈淀粉含量也迅速增加。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，煙葉生長(zhǎng)發(fā)育期間抗性淀粉含量與直鏈淀粉含量呈極顯著正相關(guān)，這與劉素君等［28］的研究結(jié)果一致。

作物中淀粉合成涉及一系列酶的催化作用。參與淀粉合成的主要酶類有ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）、淀粉合成酶（SS）、顆粒結(jié)合型淀粉合酶（GBSS）、溶性淀粉合酶（SSS）和淀粉分支酶（SBE）等。其中GBSS 酶通常參與直鏈淀粉合成，SS 酶催化支鏈淀粉合成。同時(shí)支鏈淀粉的形成還需要SBE和異淀粉酶（ISA）等酶類對(duì)分支結(jié)構(gòu)進(jìn)一步修飾［29］。本研究中對(duì)不同發(fā)育時(shí)期煙葉淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，GBSS 和SBE2 兩個(gè)基因在煙葉生長(zhǎng)發(fā)育過程中表達(dá)量變化趨勢(shì)與直鏈淀粉和抗性淀粉含量的變化趨勢(shì)相同。因此，可以通過生物技術(shù)手段調(diào)控直鏈淀粉合成關(guān)鍵基因GBSS 和支鏈淀粉合成關(guān)鍵基因SBE2的表達(dá)量，從而降低煙葉中直鏈淀粉和抗性淀粉含量。

4 結(jié)論

煙葉生長(zhǎng)發(fā)育的中后期是抗性淀粉積累的主要時(shí)期?？竞鬅熑~中抗性淀粉含量占總淀粉含量的1/3左右。在烘烤過程中，煙葉變黃期是抗性淀粉和非抗性淀粉降解的主要時(shí)期，其中非抗性淀粉的降解量較高，抗性淀粉的降解量較低，說明抗性淀粉在烘烤過程中不易降解。煙葉中抗性淀粉含量與直鏈淀粉含量呈極顯著正相關(guān)。GBSS1 和SBE2 可能是調(diào)控直鏈淀粉和抗性淀粉含量的關(guān)鍵基因。