施河麗，譚 軍，譚紹安，彭五星，尹忠春，祁高富，向必坤*

1.湖北省煙草公司恩施州公司，湖北省恩施市施州大道119 號 445000

2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，武漢市獅子山街1 號 430070

依據(jù)土壤酸堿度分級，pH 6.5～7.5的土壤為中性土壤，pH 5.5～6.5 為酸性土壤，pH 4.5～5.5 為強酸性土壤，pH＜4.5 為極強酸性土壤。土壤酸化主要是由自然因素和人為因素引起的土壤中鹽基離子淋失而氫離子增加、酸度增高的過程［1-2］。據(jù)統(tǒng)計，截至2015年，我國酸化土壤面積達2億公頃，約占我國陸地面積的21%，主要分布在長江以南的廣大地區(qū)。一般煙草生長的最適宜土壤pH范圍為5.5～6.5，我國有很大一部分植煙土壤的pH 低于該范圍［3］，土壤酸化不僅對煙草的生長發(fā)育和品質(zhì)影響較大，還會導(dǎo)致土傳病害如青枯病的發(fā)生和流行，間接影響煙葉產(chǎn)質(zhì)量，不利于煙葉生產(chǎn)的長遠發(fā)展［4-5］。

添加土壤改良劑可有效緩解土壤酸化，目前使用較多的酸性土壤改良劑有石灰、粉煤灰和生物質(zhì)炭等，但這些改良劑在改善土壤環(huán)境酸度的同時還有一定的負面影響［6-8］，因此研究者們開始利用生長繁殖容易、生產(chǎn)成本低、不污染環(huán)境、對人畜安全的微生物對酸化土壤進行治理。假單胞菌因在土壤中分布廣泛、適應(yīng)性強、容易分離，且具有改善植物營養(yǎng)、降解有毒物質(zhì)［9-11］、產(chǎn)生抗生素［12］和植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)［13］、促進植物生長［14］和抑制病害［15-16］等作用，已成為土壤微生物菌劑研究的熱點之一。從酸性土壤中可分離篩選出既適應(yīng)酸性環(huán)境又具有多種活性的有益假單胞菌，如Verma 等［17］在茶樹根際酸性土壤中分離得到一株熒光假單胞菌，具有較好拮抗病原真菌的活性，在酸性（pH 5.2）條件下該菌株能夠良好生長，還能產(chǎn)生嗜鐵素等拮抗病原菌的活性代謝物；Zhang等［18］發(fā)現(xiàn)長期種植生姜的酸性根際土中也有許多假單胞菌類有益微生物，可以有效緩解土壤酸化導(dǎo)致的鋁中毒和生姜青枯病的流行。為進一步挖掘具有緩解土壤酸化能力和生防功效的假單胞菌，通過原位培養(yǎng)從恩施煙區(qū)酸化植煙土壤中篩選得到一株熒光假單胞菌SSW-11（Pseudomonas fluorescens SSW-11），并采用盆栽試驗和大田試驗相結(jié)合的方法，評價該菌株對酸化植煙土壤的改良效果以及對煙草青枯病的影響，旨在為開發(fā)新型酸性土壤改良劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 酸性環(huán)境微生物菌株的篩選與鑒定

1.1.1 菌株的篩選

將采集于恩施煙區(qū)的酸化植煙土壤（pH 4.87～5.20）進行原位培養(yǎng)，具體方法［19］如下：將0.22 μm孔徑的無菌混合纖維素酯膜置于40 μm孔徑無菌細胞過濾器中，稱取3 g 過2 mm 無菌篩的樣品土并覆于膜上，用1.3 mL 的無菌雙蒸水潤濕土壤并混勻成土壤懸液。將制作好的上述裝置倒扣入裝有無菌雙蒸水的培養(yǎng)皿中保濕，22 ℃培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結(jié)束后，用無菌鑷子將纖維素酯膜置于裝有5 mL無菌雙蒸水的50 mL離心管中，渦旋振蕩5 min，于28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)2～3 h。取出纖維素酯膜，將菌液稀釋涂布于LB 平板上，28 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落。將單菌落接入酸性LB 培養(yǎng)基（pH 5.0）中，28 ℃、180 r/min過夜振蕩培養(yǎng)，然后以1%（體積分數(shù)）的接種量將該培養(yǎng)液接入含有1%（體積分數(shù)）甲基紅指示劑的酸性LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后觀察培養(yǎng)液顏色變化并測定pH。

1.1.2 菌株的鑒定

將篩選獲得的菌株28 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察菌落形態(tài)和細胞形狀。挑選單菌落接種于LB培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min 過夜活化振蕩培養(yǎng)。取培養(yǎng)液1 mL，12 000 r/min 離心5 min，棄上清液收集細胞。加入500 μL 無菌雙蒸水重懸細胞，煮沸10 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液作為模板。使用通用引物（16SF：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA；16SR：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）擴增菌株的16S rDNA。PCR 反應(yīng)體系為：ddH2O 6 μL，2 × Easy Taq PCR super Mix 10 μL，正、反向引物各1 μL，模板2 μL。PCR擴增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將擴增產(chǎn)物純化后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對分析，使用MEGA 5.2軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2 微生物菌株的效果評價

1.2.1 盆栽試驗

1.2.1.1 盆栽試驗概況

試驗于2020 年4—7 月在湖北省武漢市華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物農(nóng)藥國家工程研究中心進行。供試土壤采集于湖北省恩施土家族苗族自治州宣恩縣椒園鎮(zhèn)羅圈巖村，土壤類型為山地黃棕壤，土壤質(zhì)地為壤土，pH為5.50～5.90；供試烤煙品種為云煙87；供試煙草專用復(fù)合肥［m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）=8∶12∶24，磷酸一銨和碳酸氫銨等銨態(tài)氮60%，硝酸鉀等硝態(tài)氮40%］購自湖北香青化肥有限公司。將供試土壤裝于高10 cm、直徑12 cm 的圓形塑料花盆，煙苗長至6 片真葉時移栽煙苗，每盆1 株。復(fù)合有機酸溶液為：苯甲酸180 mg/L、3-苯丙酸180 mg/L、延胡索酸180 mg/L 和琥珀酸84 mg/L。發(fā)酵培養(yǎng)基為LB 培養(yǎng)基。將保存的菌株平板劃線培養(yǎng)，挑取單菌落，接入5 mL LB 培養(yǎng)基，于37 ℃過夜振蕩培養(yǎng)，然后以1%（體積分數(shù)）的接種量將培養(yǎng)液接入LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h獲得菌株發(fā)酵液。

1.2.1.2 菌株對復(fù)合有機酸造成的土壤酸化的影響

煙苗移栽成活后，于第0、14和28 d灌施20 mL/株復(fù)合有機酸溶液。試驗設(shè)對照組（CK）和處理組（SSW-11）2 個處理。第1 次灌施復(fù)合有機酸溶液后，處理組灌施20 mL/株菌株SSW-11 發(fā)酵液（稀釋5倍），對照組灌施20 mL/株發(fā)酵培養(yǎng)基（稀釋5倍）。

1.2.1.3 菌株對復(fù)合肥料造成的土壤酸化的影響

煙苗移栽成活后，于第0、14 和28 d 施用9.75 g/株煙草專用復(fù)合肥。試驗設(shè)對照組（CK）和處理組（SSW-11）2 個處理。第1 次施用復(fù)合肥后，處理組灌施20 mL/株菌株SSW-11發(fā)酵液（稀釋5倍），對照組灌施20 mL/株發(fā)酵培養(yǎng)基（稀釋5倍）。

1.2.2 大田試驗

試驗于2021年4—10月在湖北省恩施土家族苗族自治州宣恩縣椒園鎮(zhèn)羅圈巖村四組進行。供試土壤類型和烤煙品種同盆栽試驗。耕層土壤（0～20 cm）基本理化性質(zhì)為：pH 4.47、有機質(zhì)21.9 g/kg、堿解氮136.0 mg/kg、有效磷243.1 mg/kg和速效鉀302.0 mg/kg。

采用隨機區(qū)組設(shè)計，共設(shè)置2 個處理，對照組（CK）：當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)施肥［施氮量為105 kg/hm2，施肥配比 為m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）=1 ∶1.2 ∶3］；處 理 組（SSW-11）：2 250 L/hm2菌株SSW-11發(fā)酵液+當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)施肥］，3次重復(fù)，每小區(qū)5行，每行植煙12株，行距為1.20 m，株距為0.55 m。2021 年5 月1 日移栽，處理組于煙苗移栽后25 和45 d 灌施150 mL/株菌株SSW-11發(fā)酵液（稀釋5倍），對照組灌施清水（150 mL/株）。其他栽培管理措施按當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)方法進行。

1.3 樣品采集

用五點法采集盆栽試驗和大田試驗土樣。盆栽試驗第1次處理后，每隔7 d采集一次0～5 cm土層土樣，共采集8 次。大田試驗第1 次處理后（移栽后25 d），每隔7 d 采集一次0～20 cm 根區(qū)土樣，共采集7次；煙葉采收結(jié)束后采集根區(qū)土樣。將采集的土壤樣品充分混勻，然后自然風(fēng)干、去雜、研磨和過篩，用于測定土壤pH、陽離子交換量、可交換酸度、可交換鋁和可交換氫等指標(biāo)。

1.4 分析方法

1.4.1 田間調(diào)查

參照YC/T 142—2010《煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查測量方法》［20］測定成熟期烤煙株高、葉片數(shù)、莖圍、最大葉面積等農(nóng)藝性狀；參照GB/T 23222—2008《煙草病蟲害分級及調(diào)查方法》［21］調(diào)查旺長期和成熟期煙草青枯病發(fā)生情況，計算發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果；參照GB 2635—1992《烤煙》［22］記錄烤后煙葉各等級產(chǎn)量，計算單位面積均價、產(chǎn)量和產(chǎn)值等指標(biāo)。

1.4.2 土壤化學(xué)性質(zhì)分析

采用電位法測定土壤pH［23］；采用三氯化六氨合鈷浸提-分光光度法測定土壤陽離子交換量［24］；采用氯化鉀提取-滴定法測定土壤可交換酸度、可交換氫和可交換鋁［25］含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)整理與分析采用Excel 2010 和DPS 15.10統(tǒng)計軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 低pH環(huán)境微生物的篩選和鑒定

通過原位培養(yǎng)結(jié)合酸性LB培養(yǎng)基，從恩施煙區(qū)酸化植煙土壤中篩選得到一株能顯著升高發(fā)酵液pH 的菌株SSW-11。從圖1A 可見，含甲基紅指示劑的酸性培養(yǎng)基顯現(xiàn)紅色，接入菌株SSW-11發(fā)酵培養(yǎng)后，培養(yǎng)基的pH 從5.00 上升到8.18，同時顯現(xiàn)的紅色消失。對菌株SSW-11進行形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)其菌落邊緣規(guī)整透明，菌落整體凸起，濕潤易挑起，結(jié)晶紫染色后菌株整體呈橢球狀（圖1B）。由系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果（圖1C）可見，該菌株與熒光假單胞菌TJ3（Pseudomonas fluorescens TJ3）的遺傳距離最近，聚于同一個分支。結(jié)合形態(tài)特征及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果將菌株SSW-11鑒定為熒光假單胞菌。

圖1 菌株SSW-11的篩選和鑒定Fig.1 Screening and identification of strain SSW-11

2.2 菌株SSW-11對酸化土壤pH的影響

2.2.1 盆栽試驗結(jié)果

菌株SSW-11 發(fā)酵液對復(fù)合有機酸造成的土壤酸化的影響見圖2A，對照組土壤pH隨時間的變化曲線較為平緩，而處理組土壤pH隨時間的變化曲線有升高趨勢，并且在第14、28、35和49 d等多個時間點顯著高于對照組，較對照組平均提高了0.18。菌株SSW-11發(fā)酵液對復(fù)合肥料造成的土壤酸化的影響見圖2B，對照組和處理組土壤pH隨時間的變化曲線均有下降趨勢，處理組土壤pH在第14、21和28 d等多個時間點顯著高于對照組，較對照組平均提高了0.18。盆栽試驗的結(jié)果表明，菌株SSW-11發(fā)酵液對復(fù)合有機酸和復(fù)合肥料造成的土壤酸化有一定緩解效果。

圖2 菌株SSW-11發(fā)酵液對盆栽土壤pH的影響Fig.2 Effects of strain SSW-11 fermentation broth on potting soil pH

2.2.2 大田試驗結(jié)果

2.2.2.1 對旺長期酸化植煙土壤pH的影響

由圖3可見，第一次灌施菌株SSW-11發(fā)酵液7 d后，處理組土壤pH隨時間的變化曲線有一次明顯的躍升，此后土壤pH隨時間的變化曲線較為平緩，且處理組土壤pH在各個時間點均顯著高于對照組，較對照組平均提高0.47。表明菌株SSW-11發(fā)酵液可顯著提高煙株旺長期根區(qū)酸化土壤pH，且效果持續(xù)至灌施后42 d，可有效緩解大田植煙土壤酸化。

圖3 菌株SSW-11發(fā)酵液對旺長期酸化植煙土壤pH的影響Fig.3 Effects of strain SSW-11 fermentation broth on pH of acidified tobacco-planting soil during fast growing stage

2.2.2.2 對煙葉采收結(jié)束后酸化植煙土壤pH相關(guān)指標(biāo)的影響

由表1 可見，煙葉采收結(jié)束后，處理組可交換鋁含量顯著高于對照組，而可交換氫含量顯著低于對照組，表明菌株SSW-11發(fā)酵液可顯著減少酸化植煙土壤可交換氫含量。

表1 菌株SSW-11 發(fā)酵液對土壤酸堿度相關(guān)指標(biāo)的影響①Tab.1 Effects of strain SSW-11 fermentation broth on soil pH related indexes

2.3 對煙草青枯病發(fā)生和煙株生長發(fā)育的影響

2.3.1 對煙草青枯病發(fā)生的影響

由表2 可見，在旺長期，處理組和對照組煙草青枯病的發(fā)病程度均較輕，且處理組發(fā)病率和病情指數(shù)均低于對照組，處理組對煙草青枯病的防效為22.21%。在成熟期，處理組和對照組煙草青枯病的發(fā)病程度均加重，但處理組發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著低于對照組，處理組對煙草青枯病的防效達52.01%。說明菌株SSW-11 發(fā)酵液對煙草青枯病防控效果較好。

表2 菌株SSW-11 發(fā)酵液對煙草青枯病的防效Tab.2 Control effects of strain SSW-11 fermentation broth on tobacco bacterial wilt

2.3.2 對成熟期煙株農(nóng)藝性狀的影響

由表3 可見，煙葉成熟期不同處理的株高、葉片數(shù)、莖圍和中部葉葉面積等農(nóng)藝性狀差異不顯著，但對照組上部葉葉面積顯著高于處理組。

表3 成熟期煙株主要農(nóng)藝性狀Tab.3 Main agronomic traits of tobacco plants at mature stage

2.3.3 對煙葉經(jīng)濟性狀的影響

從表4可見，處理組產(chǎn)量和產(chǎn)值均顯著高于對照組，處理組的增產(chǎn)率和增值率分別為55.83%和59.22%，說明菌株SSW-11 發(fā)酵液可通過緩解植煙土壤酸化和對煙草青枯病的有效防控減少煙葉產(chǎn)量損失。

表4 菌株SSW-11 發(fā)酵液對煙葉經(jīng)濟性狀的影響Tab.4 Effects of strain SSW-11 fermentation broth on economic characters of tobacco leaves

3 討論

在盆栽試驗中，菌株SSW-11發(fā)酵液處理組土壤pH在多個時間點顯著高于對照組，較對照組平均提高0.18，且在大田試驗中，菌株SSW-11 發(fā)酵液處理組土壤pH 顯著高于對照組，較對照組平均提高0.47，說明菌株SSW-11可通過生物修復(fù)在一定程度上緩解復(fù)合有機酸和復(fù)合肥料造成的土壤酸化，這與趙倩等［26］報道的韓國假單胞菌CLP-7可提高酸化植煙土壤pH，改善酸化植煙土壤質(zhì)量的結(jié)果相符。Panichikkal 等［27］和Wang 等［28］等研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌具有分解利用植物根系分泌物中有機酸的能力，因此推測菌株SSW-11 緩解土壤酸化的原因可能是添加到土壤中的復(fù)合有機酸和復(fù)合肥料被該菌株分別作為碳源和氮源分解利用，從而減少了有機酸和氮的積累。

在旺長期和成熟期菌株SSW-11 發(fā)酵液對煙草青枯病有一定的防治效果，且在成熟期效果顯著，處理組相對防效達52.01%，說明菌株SSW-11 可作為防控?zé)煵萸嗫莶〉纳谰?，這與Chandrasekaran等［29］報道的熒光假單胞菌對青枯雷爾氏菌引起的青枯病有顯著的抑制效果，以及Suresh 等［30］發(fā)現(xiàn)的熒光假單胞菌對番茄青枯病具有良好防治效果的結(jié)果相符。推測菌株SSW-11 可能從以下4 個方面發(fā)揮生防功能：（1）青枯雷爾氏菌具有嗜酸性［31］，在酸化土壤中青枯病愈發(fā)嚴重，菌株SSW-11可通過緩解土壤酸化創(chuàng)造不利于青枯雷爾氏菌生存的環(huán)境；（2）由于多種有機酸類煙草根系分泌物能夠作為化學(xué)信號物，誘導(dǎo)青枯病原菌的運動趨化活性，刺激生物膜的形成，促進煙草青枯病發(fā)生［26］，故菌株SSW-11 可通過分解利用有機酸類煙草根系分泌物，改善煙株微環(huán)境來抑制青枯病的發(fā)生；（3）菌株SSW-11 可通過較強的氨化作用將有機氮轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮［32］，有助于煙株吸收利用氮素養(yǎng)料，促進煙株生長；（4）菌株SSW-11 還可通過產(chǎn)生抗生素和次生代謝物抑制青枯病病原菌。因此在酸化植煙土壤中灌施菌株SSW-11發(fā)酵液，通過減少有機酸和氮的積累緩解土壤酸化，創(chuàng)造適宜煙株正常生長而不利于青枯病等土傳病害發(fā)生的土壤生態(tài)環(huán)境，可降低煙株發(fā)病率、減輕發(fā)病程度，提高烤后煙葉的產(chǎn)量和產(chǎn)值。

4 結(jié)論

從恩施煙區(qū)酸化植煙土壤中篩選獲得一株熒光假單胞菌SSW-11，灌施該菌株發(fā)酵液可有效緩解有機酸和復(fù)合肥料造成的土壤酸化，提高煙株旺長期根區(qū)酸化土壤pH，顯著降低煙草青枯病的發(fā)病率和病情指數(shù)，減少病害損失，增加煙葉產(chǎn)量和產(chǎn)值。