李澤鋒，張佩佩，翟 妞，徐國云，鄭慶霞，劉萍萍，周會(huì)娜，張 慧

中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號 450001

核苷二磷酸激酶（Nucleoside diphosphate kinase，NDPK）是一類廣泛存在于各種生物體內(nèi)的高度保守的核苷酸代謝重要蛋白［1］。主要通過催化介導(dǎo)磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移，維持三磷酸核苷（Nucleoside triphosphate，NTP）和 三 磷 酸 腺 苷（Adenosine triphosphate，ATP）濃度平衡，因而與生物合成代謝、非生物脅迫、感病應(yīng)激、光合作用和生物體能量代謝等息息相關(guān)［2］。長期以來，NDPK 蛋白的研究主要集中在哺乳動(dòng)物，植物NDPK 蛋白的研究起步較晚。最早人們從豌豆中分離獲得第一個(gè)植物NDPK蛋白［3］，隨后又陸續(xù)從擬南芥、水稻、菠菜、番茄和白菜等植物中分離鑒定出多個(gè)NDPK蛋白［4-8］。目前植物NDPK 共有4 種類型，即為NDPKⅠ、NDPKⅡ、NDPKⅢ和NDPKⅣ。除NDPKⅣ功能尚不明確外，其余3類NDPK蛋白都具有多種生物學(xué)功能［2］。

NDPKⅡ主要參與活性氧清除、生長素調(diào)節(jié)和植物光合作用。擬南芥中AtNDPK2 能夠與MAPK 相互作用清除活性氧，同時(shí)在葉綠體功能和生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中都發(fā)揮重要作用［9］。擬南芥Atndpk2突變體在紅光和遠(yuǎn)紅光下都表現(xiàn)出子葉不能張開和變綠的缺陷，即該基因參與了葉片的光形態(tài)建成［10］。在水稻中發(fā)現(xiàn)NDPK2可以調(diào)控其他相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)而影響葉綠體發(fā)育和葉綠素的生物合成［11-12］。將擬南芥AtNDPK2 在毛果楊中過量表達(dá)后植株的抗鹽、抗旱能力顯著增強(qiáng)，且轉(zhuǎn)基因植株中生長素相關(guān)的吲哚乙酸基因表達(dá)量顯著升高［13-14］。同樣苜蓿中過表達(dá)AtNDPK2基因后在不同非生物脅迫條件下均可提高苜蓿的生物量和產(chǎn)量［15］。近年來，植物核苷二磷酸激酶受到廣泛關(guān)注［16-18］。煙草是我國一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，研究表明非生物脅迫對其生長發(fā)育及品質(zhì)影響較大［19-20］。本研究中在普通煙草K326中克隆、鑒定了NtNDPK4基因，利用生物信息學(xué)的方法對NtNDPK4 蛋白的理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、磷酸化位點(diǎn)、進(jìn)化關(guān)系及順式作用元件等進(jìn)行了系統(tǒng)分析，同時(shí)利用qPCR方法檢測了NtNDPK4基因的組織表達(dá)特異性及激素和光照處理響應(yīng)中的表達(dá)模式，旨在為進(jìn)一步探明煙草NtNDPK4基因的功能及作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

普通煙草K326 于2021 年種植在國家煙草基因研究中心的人工氣候室，采集盛花期煙株的根、莖、葉（中部葉）和花（花瓣、花萼、雄蕊和雌蕊）等組織器官，經(jīng)液氮速凍后，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

激素處理和光照處理的K326 煙苗種植于光照培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件：溫度（26±1）℃，相對濕度60%±2%，16 h光照培養(yǎng)，8 h黑暗培養(yǎng)。

激素處理方法：K326 種子經(jīng)75%酒精消毒1～2 min 后用10% NaClO 消毒10 min，用滅菌水反復(fù)沖洗3～5次，在1/2 MS固體培養(yǎng)基上播種。幼苗長出4 片真葉后移栽至1/2 Hoagland 營養(yǎng)液中，待6 片真葉長出后選取長勢均勻的幼苗進(jìn)行外源激素處理，即在Hoagland營養(yǎng)液中分別加入各種激素。處理激素有茉莉酸甲酯（MeJA）、脫落酸（ABA）、獨(dú)角金內(nèi)酯類似物（GR-24）、生長素（IAA）、水楊酸（SA）、赤霉素（GA）和細(xì)胞分裂素（6-BA）。其中，MeJA的濃度是100 μmol/L，其余激素濃度是10 μmol/L。處理6 h后取樣，每個(gè)處理設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)選取3株幼苗，液氮速凍后-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

光照處理方法：種子消毒和播種方法同上。播種后，留下對照平板正常光照下培養(yǎng)（簡稱光照），其余平板用錫箔紙包裹避光后在同樣環(huán)境下培養(yǎng)。5 d后，將避光培養(yǎng)的平板去除錫箔紙放于光照下正常培養(yǎng)（留取一直避光的樣品作為黑暗對照，簡稱黑暗），于恢復(fù)光照后2、6、12、24和48 h分別取樣，48 h時(shí)對光照和黑暗樣品也進(jìn)行取樣，每個(gè)處理取3個(gè)平板，每個(gè)平板取大小一致的煙草幼苗10株，液氮速凍后-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 煙草總RNA提取及cDNA合成

采集幼苗期的煙草葉片，使用RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取煙草總RNA，測定濃度后，根據(jù)羅氏第一鏈cDNA 合成試劑盒（Transcriptor first strand cDNA synthesis Kit）說明書對其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。

1.2.2 煙草NtNDPK4基因克隆

從中國煙草基因組數(shù)據(jù)庫4.0 網(wǎng)站上獲取NtNDPK4基因的CDS序列，用Primer Premier 5設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物（上游引物NtNDPK4_F：5'- TGGGCAT CGATACGGGATCCATGGAGGGTCTTACCAT -3'，下游引物NtNDPK4_R：5'- TTCATCTGCAGCTCGA GCTCTTATTCCATCAACCAAGG -3'）。以煙草葉片的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)總體系50 μL：

5×PrimeSTAR GXL buffer 10 μL，dNTP Mixture 6 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1 μL，ddH2O 補(bǔ)至50 μL。PCR 反應(yīng)程序：98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA 純化試劑盒［寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司］對目的片段進(jìn)行回收，回收得到的產(chǎn)物用In-Fusion試劑盒［寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司］連接至pGAD載體并轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)（北京全式金生物有限公司），37 ℃培養(yǎng)過夜。陽性克隆經(jīng)測序正確后提取陽性克隆質(zhì)粒。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

使 用NCBI ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）對序列ORF 進(jìn)行查找，之后使用EMBOSS Transeq（http：//embossgui.sourceforge.net/demo/transeq.html）將其翻譯為氨基酸序列；使用ProtParam（ExPASy-ProtParam tool）對蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測；分別采用TMHMM 2.0［21］（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和SignalP 6.0［22］（SignalP-6.0-Services-DTU Health Tech）對蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域、信號肽進(jìn)行預(yù)測；運(yùn)用DeepLoc-1.0［23］（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php?DeepLoc-1.0）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測；使用NetPhos［24］（NetPhos-3.1-Services-DTU Health Tech）對蛋白磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測；通過SOPMA［25］（NPS@ ：SOPMA secondary structure prediction（ibcp.fr））進(jìn)行蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；基于在線工具PlantCARE［26］（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對啟動(dòng)子區(qū)域（上游2 Kb）順式作用元件進(jìn)行搜索；同源序列使用MUSCLE［27］（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/）進(jìn)行聯(lián)配，利用MEGA 7.0［28］構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 煙草NtNDPK4基因表達(dá)定量分析

以煙草不同組織、不同激素處理及黑暗處理后恢復(fù)光照的樣品cDNA 為模板，用qPCR 的方法檢測煙草NtNDPK4 基因的表達(dá)量。設(shè)計(jì)NtNDPK4基因的qPCR 引物（上游引物RT-NtNDPK4_F：5'-CACCATAGACCTCCTATT-3'，下 游 引 物 RTNtNDPK4_R：5'-TCCATCAGGCTTAATCAT-3'），使用Roche LightCycler 96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行qPCR 實(shí)驗(yàn)。內(nèi)參基因選擇煙草的26S rRNA基 因［29］，該基因的qPCR 引物上游序列26S_F：5'- GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3'，下 游 序 列26S_R：TCTCCCTTTAACACCAACGG-3'。反應(yīng)總體系20 μL（10 μL 2 × SYBR I Master，上下游引物各0.5 μL，50 ng 的cDNA，加ddH2O 補(bǔ)至20 μL），反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，45 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3 次重復(fù)。根據(jù)循環(huán)閾值（Ct值），用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草NtNDPK4基因的克隆

以煙草K326 的幼苗葉片cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測如圖1所示。測序表明該片段長678 bp，編碼225 個(gè)氨基酸，將其命名為NtNDPK4。

圖1 NtNDPK4基因的電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of NtNDPK4 gene

2.2 煙草NtNDPK4蛋白生物信息分析

基于植物中已發(fā)表的NDPK 蛋白質(zhì)序列，利用MEGA 7.0 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果如圖2 所示，NtNDPK4屬于NDPKⅡ類型，與煙草NtNDPK2關(guān)系最近。進(jìn)一步將NDPKⅡ類型蛋白序列進(jìn)行聯(lián)配發(fā)現(xiàn)，NtNDPK4與其他NDPKⅡ相似性較高，在序列上較為保守（圖3）。

圖2 植物NDPK蛋白的進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of NDPK proteins in selected plants

圖3 不同植物NDPKⅡ蛋白序列比對Fig.3 Alignment of NDPKⅡprotein sequences in different plants

分析發(fā)現(xiàn)NtNDPK4 蛋白分子量大小24.95 kDa，等電點(diǎn)8.34，正電荷氨基酸殘基數(shù)（Arg+Lys）24個(gè)，負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)（Asp+Glu）22 個(gè)。該蛋白不存在跨膜區(qū)且無信號肽，屬于胞內(nèi)蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測NtNDPK4 定位于葉綠體基質(zhì)的可能性最大。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測發(fā)現(xiàn)：11個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，分別是S15、S21、S22、S25、S30、S54、S73、S99、S130、S193 和S195；4 個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，分別是T19、T109、T176 和T185；3 個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，分別是Y81、Y125 和Y140。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，NtNDPK4包含4 種結(jié)構(gòu)形式，其中隨機(jī)卷曲88 個(gè)（占比39.11 %）、α螺旋79 個(gè)（占比35.11 %）、延伸鏈44 個(gè)（占比19.56 %）、β折疊14個(gè)（占比6.22 %）。

為進(jìn)一步了解NtNDPK4 基因的功能，對NtNDPK4 基因順式作用元件進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)果如表1 所示，該基因啟動(dòng)子區(qū)域含有激素響應(yīng)相關(guān)元件，如 ABRE、TGACG-motif、P-box、CGTCA-motif、TCA-element和AuxRR-core等。同時(shí)也包含光響應(yīng)相關(guān)元件，如G-box、Box 4、chs-CMA1a和AT1-motif等。另外還有一些其他元件，如生長發(fā)育相關(guān)元件circadian，逆境脅迫相關(guān)元件ARE、MBS、LTR 和GC-motif等。

表1 NtNDPK4啟動(dòng)子順式作用元件統(tǒng)計(jì)Tab.1 Statistics for cis-acting elements of promoter of NtNDPK4

2.3 煙草NtNDPK4基因表達(dá)分析

為了檢測煙草NtNDPK4基因在不同組織中的表達(dá)情況，分別以根、莖、葉和花等組織的cDNA為模板，qPCR結(jié)果（圖4）表明，NtNDPK4基因在這些器官中都有表達(dá)，且根中的表達(dá)量顯著高于莖、葉和花等組織。在花的各個(gè)器官中，花瓣中NtNDPK4基因的表達(dá)量最高。

圖4 NtNDPK4基因在煙草不同組織中的表達(dá)量Fig.4 Expression levels of NtNDPK4 in different tissues of tobacco

為了檢測煙草NtNDPK4基因在不同激素處理下的表達(dá)情況，分別用MeJA、ABA、GR-24、IAA、SA、GA 和6-BA 等7 種激素對K326 幼苗進(jìn)行處理采樣，qPCR 結(jié)果（圖5）表明，除SA 和GR-24 外，NtNDPK4基因在其他激素處理樣品中的表達(dá)量都顯著提高（P＜0.05），尤其是受到GA的顯著誘導(dǎo)（P＜0.01）。這表明NtNDPK4參與了激素應(yīng)答響應(yīng)。

圖5 NtNDPK4基因在不同激素處理煙草中的表達(dá)量Fig.5 Expression levels of NtNDPK4 in tobacco under different hormone treatments

為了檢測煙草NtNDPK4 基因是否與光照有關(guān)，對煙草幼苗黑暗處理后恢復(fù)光照不同時(shí)間采集的樣品利用qPCR 技術(shù)檢測NtNDPK4 基因的表達(dá)量，結(jié)果如圖6 所示。在恢復(fù)光照12 h 時(shí)，該基因被顯著誘導(dǎo)（P＜0.05），24 h時(shí)該基因的表達(dá)量最高，說明該基因參與了光照響應(yīng)。

圖6 NtNDPK4基因在不同光照處理的煙草中的表達(dá)量Fig.6 Expression levels of NtNDPK4 in tobacco under different light treatments

3 討論

從普通煙草K326克隆獲得了1個(gè)煙草核苷二磷酸激酶基因NtNDPK4，該基因CDS 長度約678 bp，編碼225個(gè)氨基酸。進(jìn)化分析表明NtNDPK4與擬南芥AtNDPK2 和煙草NtNDPK2 同屬NDPKⅡ型，這類NDPK 基因可能參與活性氧清除、生長素調(diào)節(jié)和植物光合作用等過程。亞細(xì)胞定位預(yù)測，NtNDPK4最有可能定位于葉綠體。順式作用元件分析結(jié)果推測，NtNDPK4 可能參與激素響應(yīng)和光照響應(yīng)。進(jìn)化分析及序列比對發(fā)現(xiàn)，煙草中有兩個(gè)NDPKⅡ型基因，即NtNDPK2和NtNDPK4，兩個(gè)基因編碼的蛋白相似度約80%。NtNDPK2 可能參與活性氧的清除［30］，NtNDPK4 基因與NtNDPK2 基因是否有功能冗余，還有待進(jìn)一步研究。

NtNDPK4 基因在煙草各個(gè)組織中都有表達(dá)，且根部表達(dá)相對較高。值得注意的是，該基因在花的各個(gè)器官中以花瓣中的表達(dá)最高，這一結(jié)果與中國白菜中的研究結(jié)果一致［8］。水稻［5］和楊樹［13］中NDPK2基因則是在幼嫩的葉片中表達(dá)量最高。NDPKⅡ基因組織表達(dá)的多樣性也預(yù)示著這些基因可能具有不同的功能。在擬南芥中，AtNDPK2 突變后下胚軸變短，生長素運(yùn)輸增強(qiáng)［9］。本研究中除生長素外使用了多種激素處理煙草幼苗，發(fā)現(xiàn)NtNDPK4 基因的表達(dá)受到了顯著誘導(dǎo)，尤其是赤霉素處理后該基因的表達(dá)上調(diào)了近50 倍，但該基因在煙草GA 代謝中的重要作用仍有待進(jìn)一步深入研究。與中國白菜BcNDK2 功能類似，NtNDPK4 的表達(dá)受到光照誘導(dǎo)，但該基因參與光照響應(yīng)的具體機(jī)制有待深入探索。

4 結(jié)論

本研究中從栽培煙草K326 中克隆獲得NtNDPK4 基因，進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)該基因?qū)儆贜DPKⅡ型。NtNDPK4基因在根、莖、葉和花中均有表達(dá)。在GA、IAA、6-BA、ABA 和MeJA 等 激 素 處 理 下，NtNDPK4 基因的表達(dá)量顯著提高。同時(shí)，黑暗生長的煙草幼苗恢復(fù)光照12 h 后，NtNDPK4 基因表達(dá)明顯上調(diào)。這表明該基因在煙草非生物脅迫中可能具有重要作用。